Name: Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji pułapek neutrofilowych w zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Technika ta umożliwia wykrywanie NETs w tkankach zatopionych w parafinie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez fundusze z University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Autorzy chcieliby podziękować dr Kevinowi Woolardowi za użycie mikroskopu fluorescencyjnego.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Sekcje zwłok i biopsje tkanek wykonywano za zgodą właścicieli.
1. Utrwalanie, osadzanie i cięcie tkanek
<ol>
	<li>Wypreparuj rozwidlenie aorty, w tym aortę zstępującą, tętnicę udową i tętnice biodrowe wspólne (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A), wkrótce po humanitarnej eutanazji lub śmierci. Tępo rozetnij powięź (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B) przed całkowitym zanurzeniem jej w 10% neutralnie buforowanej formalinie na minimum 24 godziny i nie dłużej niż 48 godzin.</li>
	<li>Aby odwodnić próbkę, należy najpierw zanurzyć ją w 10% neutralnie buforowanej formalinie podgrzanej do temperatury 37 °C na 1 godzinę. Następnie zanurzyć w rosnących stężeniach etanolu podgrzanego do 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x po 1 godzinę. Na koniec, bez spłukiwania, zanurzyć 2x w 100% toluenie podgrzanym do 37 °C na 1 godzinę każdy.</li>
	<li>Dodać parafinę podgrzaną do temperatury 62 °C i pozostawić parafinę do całkowitego zestalenia się przez noc.</li>
	<li>Przekrój 2–3 μm tkanki zatopionej w parafinie za pomocą mikrotomu i umieścić na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych. Pocięte tkanki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
2. Deparafinizacja, nawodnienie i odzyskiwanie antygenu pod wpływem ciepła
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić deparafinowanie i ponowne uwodnienie skrawków na szkiełkach podstawowych, należy umieścić szkiełka w stojakach i przetwarzać w następującej kolejności:
	<ol>
		<li>Zanurz całkowicie w 100% ksylenie na 3 minuty. Powtórz ten krok 2x. Nie spłukiwać między krokami.</li>
		<li>Zanurzyć całkowicie w malejących stężeniach etanolu (100%, 95%, 70%) w temperaturze pokojowej (RT), 3x na 3 minuty każdy. Nie spłukiwać między krokami.</li>
		<li>Zanurz całkowicie w wodzie dejonizowanej na 2 minuty. Powtórz</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść skrawki soli fizjologicznej z 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) na 2–3 minuty.</li>
	<li>Napełnij zbiornik wodą dejonizowaną podgrzaną do 100 °C. Pozwól, aby komora gotowania na parze wyrównała się przez 20 minut. 
	UWAGA: Pobieranie antygenu pod wpływem ciepła najlepiej wykonywać za pomocą ogrzewania pośredniego generowanego przez parowar z zaprogramowanym ustawieniem temperatury, taki jak parowar do żywności.</li>
	<li>Podgrzać dostępny w handlu roztwór do pobierania antygenu zawierający Tris i EDTA (pH = 9) do temperatury 95–97 °C na płycie grzejnej o kontrolowanej temperaturze, ciągle mieszając. Upewnij się, że się nie gotuje. 
	UWAGA: Po podgrzaniu roztwór powinien stać się mętny.</li>
	<li>Wlej podgrzany roztwór do pobierania antygenu do szkiełkowego pojemnika i umieść pojemnik w komorze parowaru. Pozostawić, aby roztwór pobierający antygen zrównoważył się z temperaturą naczynia do gotowania na parze przez 3–4 minuty. Upewnij się, że temperatura komory wynosi ~95 °C.</li>
	<li>Zanurz całkowicie szkiełka w podgrzanym roztworze do pobierania antygenu i kontynuuj ogrzewanie zewnętrzne za pomocą parowca przez 20 minut.</li>
	<li>Wyjąć pojemnik na szkiełka z naczynia do gotowania na parze i pozostawić szkiełka oraz roztwór do pobierania antygenu do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Rozcieńczony roztwór do pobierania antygenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby użyć ponownie do 2 razy.</li>
	<li>Myć szkiełka 3x łyżką TBST przez 5 min.</li>
</ol>
3. Znakowanie immunologiczne i gaszenie autofluorescencji
UWAGA: Tabela 1 szczegółowo opisuje skład blokujących używanych w następujących krokach.
<ol>
	<li>Inkubuj sekcje w buforze blokującym 1 przez 2 godziny przy suchym natężeniu prądu przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Uszczelnij folią parafinową, aby uniknąć wyschnięcia.</li>
	<li>Bez mycia natychmiast nanieść 100 μl rozcieńczonego króliczego poliklonalnego przeciwciała przeciwko ludzkiemu cytrulinowanemu histonowi H3 (citH3) (0,03 mg/ml rozcieńczone w buforze blokującym 1) bezpośrednio na szkiełko.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) na każdej sekcji, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie mieszaniny przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować przez 12–16 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc (30–50 obr./min). Uszczelnij folią parafilmową, aby uniknąć wyschnięcia.</li>
	<li>Myć 3x TBST przez 5 min.</li>
	<li>Zastosuj 100 μl koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Alexa Fluor 488 (rozcieńczonego do końcowego stężenia 0,04 mg/ml lub 1:50 w buforze blokującym 1), jak opisano w kroku 3.3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Chroń slajdy przed światłem.</li>
	<li>Myć TBST 3x przez 5 min.</li>
	<li>Inkubować sekcje w buforze blokującym 2 przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Chronić przed światłem.</li>
	<li>Myć TBST 3x przez 5 min.</li>
	<li>Zablokuj sekcje w buforze blokującym 3 zgodnie z opisem w kroku 3.3 przy wilgotności względnej przez 2 godziny przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min).</li>
	<li>Inkubować skrawki z biotynylowanym poliklonalnym króliczym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu przeciwciału NE (stężenie końcowe = 0,2 μg/ml w buforze blokującym 3) w temperaturze 4 °C przez 12–16 godzin, jak opisano w krokach 3.2–3.4.</li>
	<li>Myć TBST 3x przez 5 min.</li>
	<li>Inkubować ze sprzężonym streptawidyną Alexa Fluor 594 (rozcieńczyć do 1:100 lub 0,02 mg/ml w buforze blokującym 3) zgodnie z opisem w krokach 3.2–3.3 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem i uszczelnić parafiną, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Myć z TBST 1x przez 5 min.</li>
	<li>Nanieść 100 μl mieszaniny roztworu gaszącego autofluorescencję bezpośrednio na sekcje przez 1 minutę zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Szkiełka należy natychmiast myć środkiem TBST 6x przez 10 minut.</li>
	<li>Przykryj każde szkiełko 100 μl 300 nM DAPI przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Myć TBST przez 3 minuty. Powtórz to w sumie 5 razy.</li>
	<li>Nanieś kroplę (~50 μl) środka do gaszenia zapobiegającego blaknięciu, będącego częścią zestawu do hartowania autofluorescencji, bezpośrednio na szkiełko podstawowe otaczające sekcję. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) na sekcję, nie tworząc żadnych pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostawić próbki do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C, aż podłoże mocujące stwardnieje do analizy mikroskopowej za pomocą soczewek zanurzeniowych.</li>
</ol>
4. Identyfikacja pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili
UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje odwrócony mikroskop epifluorescencyjny z cyfrową kamerą CCD 1,280 x 960 (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Aby zlokalizować skrzepliny, skanuj czaszkowo lub doogonowo wzdłuż długości aorty, rozwidlenia aorty i każdej tętnicy udowej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym z obiektywem 10x. Skrzeplina to konglomerat tkanek zawierających czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi przylegające do śródbłonka w mikroskopii kontrastu fazowego i jasnego pola (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, <silna klasa = "xfig" >Figura 2B).</li>
	<li>Najpierw zbadaj sekcje dla NET przy użyciu kanału DAPI (wzbudzenie = 357/44 nm) z obiektywami 10x i 20x (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C). Należy zauważyć, że cfDNA wydaje się być zdekondensowanym DNA, które nie znajduje się w granicach cytoplazmy komórki, gdy jest widziane w kontraście fazowym lub mikroskopii jasnego pola.</li>
	<li>Zidentyfikuj zewnątrzkomórkowy kanał białkowy NE i citH3 na kanałach Texas Red (wzbudzenie = 585/29 nm, emisja = 628/32 nm) i zielonym kanale białkowym fluorescencyjnym (wzbudzenie = 470/22 nm, emisja = 525/50 nm), odpowiednio z obiektywami 10, 20 i 40x.</li>
	<li>Oceń i przeanalizuj NET w skrzeplinie za pomocą dostępnego oprogramowania, takiego jak Image J (NIH). Tworzenie NET jest identyfikowane na podstawie kolokalizacji cfDNA, zewnątrzkomórkowego citH3 i NE, jak opisano wcześniej18. Utrzymuj stały czas ekspozycji i wzmocnienia każdego kanału przez cały czas pozyskiwania obrazów, aby uniknąć nasycenia intensywności pikseli.</li>
	<li>Zmapuj każdą skrzeplinę na podstawie jej bliskości do aorty zstępującej, dzieląc ją na trzy równe strefy, przy czym strefa 1 znajduje się najbliżej aorty, strefa 3 jest najbardziej oddalona od aorty, a strefa 2 między strefami 1 i 3). Gdy operator jest ślepy na stan zdrowia każdego z testerów, zajmij co najmniej dziesięć losowych pól w każdej strefie. Scharakteryzuj rozkład NET w skrzeplinach, uśredniając liczbę pól z NET w każdej strefie lub obliczając średni obszar zajmowany przez NET na strefę.</li>
</ol>

<ol><li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Cardiology%3A+The+Official+Journal+of+the+European+Society+of+Veterinary+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).</li>
<li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li>
<li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice%3A+2004-2012%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-extracellular+traps%2C+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721(2019).</li>
<li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+smears+observed+in+H+%26+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li>
<li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li>
<li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li>
<li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322(2019).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li>
<li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation%3A+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083(2018).</li>
<li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+smears+observed+in+H%26E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li>
<li>Farkas, ÁZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li>
<li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928(2017).</li>
<li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li>
<li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li>
<li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210(2018).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+substitute+fixatives%3A+effects+on+nucleic+acid+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li>
<li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking%2C+immunoreactivity%2C+and+heat+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li>
<li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens%3A+the+GBS+%28glutaraldehyde-borohydride-saponin%29+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%3A+The+Official+Publication+of+the+American+Federation+for+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li>
<li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li>
<li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li>
<li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry%3A+an+in-situ+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li>
<li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy protokół identyfikacji NET w utrwalonych kardiogennych skrzeplinach tętniczych kotów przy użyciu protokołu podwójnego znakowania immunologicznego i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Chociaż wybarwione były tylko kardiogenne skrzepliny tętnicze, teoretycznie protokół ten może być stosowany w przypadku innych typów skrzeplin i innych gatunków weterynaryjnych. Identyfikacja NET w skrzeplinach tętniczych kotów sugeruje, że NET mogą odgrywać rolę w zakrzepicy u kotów.
Wykrywanie NET za ...

Koty z kardiomiopatią przerostową są narażone na zagrażające życiu powikłania zakrzepowo-zatorowe1,2. Pomimo wysokiej zachorowalności i śmiertelności związanej z kardiogenną tętniczą chorobą zakrzepowo-zatorową kotów (CATE), patofizjologia leżąca u podstaw CATE u kotów jest słabo poznana. Istnieją również ograniczone narzędzia diagnostyczne i terapeutyczne do leczenia i identyfikacji kotów zagrożonych tą wyniszczającą chorobą3.
Oprócz swojej roli w odporności wrodzonej, wykazano, że neutrofile odgrywają rolę w zakrzepicy poprzez uwalnianie neutrofili zewnątrzkomórkowych pułapek (NET), które są sieciami przypominającymi sieć bezkomórkowego DNA (cfDNA) inkrustowaną histonami i ziarnistymi białkami, takimi jak elastaza neutrofilowa (NE) i mieloperoksydaza. Neutrofile ulegają powstawaniu NET w odpowiedzi na ogólnoustrojowy stan zapalny, bezpośrednie spotkanie z patogenami i interakcję z aktywowanymi płytkami krwi4,5,6,7. Wykazano, że u psów DNA pochodzące z neutrofili hamuje lizę skrzepów, podczas gdy białka NET przyspieszają tworzenie skrzepów. Zdolność sieci NET do wychwytywania krążących komórek i składników krzepnięcia jest również kluczem do ich właściwości zakrzepowych8,9,10,11,12.
NET są wykrywane przez kolokalizację zewnątrzkomórkowych białek neutrofilowych, histonów i cfDNA. Z tego powodu identyfikacja i kwantyfikacja NET w utrwalonych tkankach za pomocą immunofluorescencji tkanek odparafinowanych jest lepsza niż tradycyjne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu mikroskopii jasnego pola4,5. Kilka badań na ludziach z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej zidentyfikowało NET jako składniki strukturalne skrzeplin tętnic wieńcowych, skrzeplin po udarze mózgu, miażdżycy i zakrzepów żylnych13,14,15,16,17. Do tej pory nie opisano znormalizowanej metody wykrywania i ilościowego oznaczania NET w skrzeplinach kotów. Ponieważ identyfikacja NET w kardiogennych skrzeplinach tętniczych kotów może ułatwić przyszłe badania translacyjne nad NETs i zakrzepicą, opisujemy techniki identyfikacji i oceny NET w zakrzepach tętniczych zatopionych w parafinie u kotów.

<table><tbody><tr><td>4,6-diamidyno-2-fenylina (DAPI)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Koniugat streptawidyny</td><td>Katalog naukowy</td><td>ThermoFisher # S11227</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwcytrulinowane histonem H3</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania komórek EVOS FL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie EVOS Obiektyw systemowy 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4681</td><td>NA 0,25, WD 6,9/7,45 mm</td></tr><tr><td>System obrazowania EVOS Obiektyw 20x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4682</td><td>NA 0,40, WD 6,8 mm</td></tr><tr><td>System obrazowania EVOS Obiektyw 40x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4699</td><td>NA 0,75, WD 0,72 mm</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królikowe Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Catalog # A32723</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>Katalog # NC9660079. Część producenta # 005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało elastazy neutrofilowej</td><td>Przeciwciała Bioss</td><td>Bs-6982R-Biotyna</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika, Biotyna sprzężona</td></tr><tr><td>z NP40</td><td>Pierce</td><td>Product # 28324. Część # EJ64292</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe</td><td>Thomas Scientific</td><td>Producent nr 1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Surowica królików</td> Katalog <td>technologii życia</td><td># 10510</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania celu</td><td>Agilent Dako</td><td>S2367</td><td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td></tr><tr><td>TrueVIEW Zestaw do hartowania autofluorescencji</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET), składające się z bezkomórkowego DNA (cfDNA) i białek takich jak histony i elastaza neutrofilowa (NE), są uwalniane przez neutrofile w odpowiedzi na ogólnoustrojowe zapalenie lub patogeny. Chociaż wcześniej wykazano, że NET zwiększają tworzenie się skrzepów i hamują fibrynolizę u ludzi i psów, rola NET u kotów z kardiogenną tętniczą chorobą zakrzepowo-zatorową (CATE), zagrażającym życiu powikłaniem wtórnym do kardiomiopatii przerostowej, jest nieznana. Ustandaryzowana metoda identyfikacji i ilościowego oznaczania NET w kardiogennych skrzeplinach tętniczych u kotów pogłębi naszą wiedzę na temat ich patologicznej roli w CATE. W tym miejscu opisujemy technikę identyfikacji NET w skrzeplinach utrwalonych w formaldehydzie i zatopionych w parafinie w obrębie bifurkacji aorty, ekstrahowanych podczas sekcji zwłok. Po deparafinowaniu ksylenem odcinki aorty uległy pośredniemu pobraniu antygenu wywołanemu ciepłem. Skrawki następnie zablokowano, przepuścino i ex vivo NET zidentyfikowano poprzez kolokalizację bezkomórkowego DNA (cfDNA), cytrulinowanego histonu H3 (citH3) i elastazy neutrofilowej (NE) przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Aby zoptymalizować immunodetekcję NET w skrzeplinach, autofluorescencję elementów tkankowych ograniczono poprzez zastosowanie procesu wygaszania autofluorescencji przed mikroskopią. Technika ta może być użytecznym narzędziem do badania NET i zakrzepicy u innych gatunków i oferuje nowe informacje na temat patofizjologii tego złożonego schorzenia.

Stosując niniejszy protokół deparafinyzacji, termicznej regeneracji antygenów oraz podwójnego znakowania immunocytochemicznego zakrzepów zatopionych w parafinie, po raz pierwszy zidentyfikowaliśmy NETs w kociej CATE. Zakrzepy w rozwidleniu aorty zlokalizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii w świetle przechodzącym z zastosowaniem standardowego barwienia H&amp;E oraz mikroskopii fazokontrastowej. W mikroskopii w świetle przechodzącym zakrzepy tętnicze kotów składały się z erytrocytów, leukocytów, fibr...

Opisujemy metodę identyfikacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w kardiogennych zakrzepach tętniczych kotów utrwalonych formaldehydem i parafinie, wykorzystując indukowane ciepłem pobieranie antygenu i protokół podwójnego znakowania immunologicznego.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Ten protokół parafinizacji, po którym następuje pobranie antygenu z odcinków aorty zatopionych w parafinie, może być użytecznym narzędziem do badania roli neutrofilowych pułapek trójkomórkowych w zakrzepicy kotów. Wykrywanie trójkomórkowych pułapek neutrofilowych za pomocą immunofluorescencji w tkance utrwalonej i zatopionej w parafinie jest lepsze niż konwencjonalne stenty histologiczne, takie jak HNE, ponieważ umożliwia jednoczesne wykrywanie bezpieczniejszego DNA i białek zewnątrzkomórkowych. Protokół ten może być stosowany w innych typach skrzeplin i u innych gatunków weterynaryjnych.Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili w zakrzepach tętniczych kotów sugeruje, że mogą one odgrywać rolę w zakrzepicy u kotów. Przedstawione tutaj protokoły mają charakter orientacyjny. Gorąco zachęcamy badaczy do dostosowania czasu trwania i warunków procesu pobierania antygenu w celu uzyskania zadowalającego sygnału.Aby użyć zautomatyzowanego systemu do przeprowadzenia deparafinowania i ponownego uwodnienia skrawków na szkiełkach, należy umieścić szkiełka w stojakach. Zanurz całkowicie w 100-procentowej soli fizjologicznej na trzy minuty. Powtórz ten krok dwukrotnie.Nie spłukiwać między krokami. Zanurzyć całkowicie w malejących stężeniach etanolu w temperaturze pokojowej trzy razy na trzy minuty każdy. Zanurz całkowicie w wodzie dejonizowanej na dwie minuty i powtórz jeszcze raz.Po uzdatnieniu TBST napełnij zbiornik wodą dejonizowaną podgrzaną do 100 stopni Celsjusza. Pozwól komorze parowaru zrównoważyć się przez 20 minut. Na płycie grzewczej podgrzej dostępny w handlu roztwór do pobierania antygenu zawierający Tris i EDTA o pH od 9,0 do 95 do 97 stopni Celsjusza.Upewnij się, że się nie zagotuje. Całkowicie zanurzyć szkiełka w podgrzanym roztworze do pobierania antygenu i kontynuować stosowanie ogrzewania zewnętrznego za pomocą parowca przez 20 minut. Następnie umyj szkiełka trzykrotnie TBST przez pięć minut.Teraz umieść sekcje w buforze blokującym 1. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem między 30 a 50 obr./min. Bez mycia natychmiast nałożyć 100 mikrolitrów rozcieńczonego poliklonalnego przeciwciała przeciw ludzkiemu cytrulinowanemu histonowi H3 bezpośrednio na szkiełko.Umieść szkiełko nakrywkowe na każdej sekcji, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie mieszaniny przeciwciał. Inkubować przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc. Następnie umyj szkiełka trzy razy TBST przez pięć minut za każdym razem.Aby zastosować przeciwciało, użyj pipety i równomiernie rozprowadź 100 mikrolitrów koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Alexa Fluor 488. Przykryj szkiełka folią aluminiową i inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem. Po umyciu TBST zgodnie z rękopisem, skrawki inkubować w buforze blokującym 2 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym kołysaniem.Chronić przed światłem. Umyj TBST trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Zablokuj sekcje w buforze blokującym 3, tak jak to robiono wcześniej, w temperaturze pokojowej przez dwie godziny przy delikatnym kołysaniu.Inkubować skrawki z wypełnionym biotyną ployklonalnym przeciwciałem przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej królika w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin, jak opisano wcześniej. Po umyciu TBST inkubować szkiełka z koniugatem streptawidyny Alexa Fluor 594 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj TBST jeden raz przez pięć minut.Nanieść 100 mikrolitrów mieszaniny roztworu do hartowania autofluorescencji bezpośrednio na sekcje na jedną minutę zgodnie z instrukcją producenta. Natychmiast umyj szkiełka TBST sześć razy przez 10 minut za każdym razem. Przykryj każde szkiełko 100 mikrolitrami 300 nanomolowych DAPI przez pięć minut w ciemności.Następnie umyj TBST pięć razy przez trzy minuty za każdym razem. Nałóż kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu bezpośrednio na szklane szkiełko otaczające sekcję. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na sekcję, nie tworząc żadnych pęcherzyków.Pozostawić próbki do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zlokalizować skrzepliny, skanuj czaszkowo lub doogonowo wzdłuż długości aorty, rozwidlenia aorty i każdej tętnicy udowej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym z obiektywem 10x. Najpierw zbadaj skrawki pod kątem bezkomórkowego DNA za pomocą kanału DAPI ze wzbudzeniem na 357 i 44 nanometrach.Zidentyfikuj zewnątrzkomórkową elastazę neutrofilową i cytrulinowany histon H3 odpowiednio na kanałach białkowych czerwonej i zielonej fluorescencji w Teksasie. Utrzymuj stały czas ekspozycji i wzmocnienia każdego kanału przez cały czas pozyskiwania obrazów, aby uniknąć nasycenia intensywności pikseli. Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili są identyfikowane na podstawie kolokalizacji elastazy neutrofilowej, cytrulinowanego histonu H3 i bezkomórkowego DNA.Za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz mikroskopii jasnego pola, skrzepliny tętnicze kotów składają się z czerwonych krwinek, leukocytów, fibryny i płytek krwi. NET pojawiły się jako sieci ciemnofioletowych nici o różnej długości otaczających pobliskie erytrocyty i leukocyty. Korzystając z tego protokołu, mikroskopia immunofluorescencyjna ujawniła duże agregaty NET złożone z bezkomórkowego DNA, zewnątrzkomórkowego cytrulinowanego histonu H3 i elastazy neutrofilowej.W kontraście fazowym w mikroskopii immunologicznej skrzeplinę scharakteryzowano jako dobrze odgraniczoną strukturę w przestrzeni naczyniowej. Zakrzepów nie wykryto jednak w żadnej z próbek kontrolnych. Rysunek ten pokazuje głęboką autofluorescencję elementów skrzepu, takich jak erytrocyty, gdy są obrazowane na długości fali 488 nanometrów.Krótkie wygaszanie autofluorescencji po znakowaniu immunologicznym znacznie zwiększyło czułość kolokalizacji białek i wykrywania NET nawet w obszarach z dużą ilością erytrocytów. Czas wiązania wpływa na immunoreaktywność niektórych antygenów. Zalecamy utrwalenie nie dłużej niż 24 godziny od odwodnienia i zatopienia parafiny.Alternatywnie, paraformaldehyd bez metanolu może być stosowany w celu ograniczenia artefaktów kwasu mrówkowego i ketonów z utleniania formaldehydu. Aby zapobiec interferencji podczas stosowania przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od tego samego gatunku, dołączyliśmy dodatkowy etap blokowania w celu nasycenia wszelkich pozostałych miejsc wiązania na przeciwciałach drugorzędowych. Badacze muszą uwzględnić kontrole ujemne składające się z przeciwciał izotypowych, wykluczenie przeciwciał pierwszorzędowych i etapu znakowania immunologicznego oraz kontrole biologiczne od kotów bez zakrzepicy.Autofluorescencja granic tkankowych skrzeplin może utrudnić mikroskopową identyfikację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Badacz może zminimalizować fluorescencję za pomocą fluoroforów dalekiej czerwieni. Technika ta może być cennym narzędziem do badania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u innych gatunków weterynaryjnych.Może to zapewnić lepsze zrozumienie patofizjologii zakrzepicy.

identification-neutrophil-extracellular-traps-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Tutaj opisano metodę lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą znakowanych DIG sond DNA 16S ukierunkowanych na rRNA. Protokół ten można zastosować do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania i identyfikowania nowo scharakteryzowanej subpopulacji gigantycznych fagocytów pochodzących z neutrofili. Komórki te rozwijają się w hodowli ze świeżych neutrofili ludzkiej krwi i charakteryzują się fagocytozą, autofagią, niezwykle dużymi rozmiarami i wydłużoną żywotnością. Metoda ta jest niezbędna do dalszego badania tej unikalnej subpopulacji pochodzącej z neutrofili.

Opracowanie i identyfikacja nowej subpopulacji ludzkich fagocytów olbrzymich pochodzących z neutrofili in vitro

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę identyfikacji pułapek neutrofilowych w zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Technika ta umożliwia wykrywanie NETs w tkankach zatopionych w parafinie.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów