Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Ten protokół parafinizacji, po którym następuje pobranie antygenu z odcinków aorty zatopionych w parafinie, może być użytecznym narzędziem do badania roli neutrofilowych pułapek trójkomórkowych w zakrzepicy kotów. Wykrywanie trójkomórkowych pułapek neutrofilowych za pomocą immunofluorescencji w tkance utrwalonej i zatopionej w parafinie jest lepsze niż konwencjonalne stenty histologiczne, takie jak HNE, ponieważ umożliwia jednoczesne wykrywanie bezpieczniejszego DNA i białek zewnątrzkomórkowych. Protokół ten może być stosowany w innych typach skrzeplin i u innych gatunków weterynaryjnych.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili w zakrzepach tętniczych kotów sugeruje, że mogą one odgrywać rolę w zakrzepicy u kotów. Przedstawione tutaj protokoły mają charakter orientacyjny. Gorąco zachęcamy badaczy do dostosowania czasu trwania i warunków procesu pobierania antygenu w celu uzyskania zadowalającego sygnału.

Aby użyć zautomatyzowanego systemu do przeprowadzenia deparafinowania i ponownego uwodnienia skrawków na szkiełkach, należy umieścić szkiełka w stojakach. Zanurz całkowicie w 100-procentowej soli fizjologicznej na trzy minuty. Powtórz ten krok dwukrotnie.

Nie spłukiwać między krokami. Zanurzyć całkowicie w malejących stężeniach etanolu w temperaturze pokojowej trzy razy na trzy minuty każdy. Zanurz całkowicie w wodzie dejonizowanej na dwie minuty i powtórz jeszcze raz.

Po uzdatnieniu TBST napełnij zbiornik wodą dejonizowaną podgrzaną do 100 stopni Celsjusza. Pozwól komorze parowaru zrównoważyć się przez 20 minut. Na płycie grzewczej podgrzej dostępny w handlu roztwór do pobierania antygenu zawierający Tris i EDTA o pH od 9,0 do 95 do 97 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że się nie zagotuje. Całkowicie zanurzyć szkiełka w podgrzanym roztworze do pobierania antygenu i kontynuować stosowanie ogrzewania zewnętrznego za pomocą parowca przez 20 minut. Następnie umyj szkiełka trzykrotnie TBST przez pięć minut.

Teraz umieść sekcje w buforze blokującym 1. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem między 30 a 50 obr./min. Bez mycia natychmiast nałożyć 100 mikrolitrów rozcieńczonego poliklonalnego przeciwciała przeciw ludzkiemu cytrulinowanemu histonowi H3 bezpośrednio na szkiełko.

Umieść szkiełko nakrywkowe na każdej sekcji, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie mieszaniny przeciwciał. Inkubować przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc. Następnie umyj szkiełka trzy razy TBST przez pięć minut za każdym razem.

Aby zastosować przeciwciało, użyj pipety i równomiernie rozprowadź 100 mikrolitrów koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Alexa Fluor 488. Przykryj szkiełka folią aluminiową i inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym kołysaniem. Po umyciu TBST zgodnie z rękopisem, skrawki inkubować w buforze blokującym 2 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym kołysaniem.

Chronić przed światłem. Umyj TBST trzy razy przez pięć minut za każdym razem. Zablokuj sekcje w buforze blokującym 3, tak jak to robiono wcześniej, w temperaturze pokojowej przez dwie godziny przy delikatnym kołysaniu.

Inkubować skrawki z wypełnionym biotyną ployklonalnym przeciwciałem przeciwko ludzkiej elastazie neutrofilowej królika w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin, jak opisano wcześniej. Po umyciu TBST inkubować szkiełka z koniugatem streptawidyny Alexa Fluor 594 przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj TBST jeden raz przez pięć minut.

Nanieść 100 mikrolitrów mieszaniny roztworu do hartowania autofluorescencji bezpośrednio na sekcje na jedną minutę zgodnie z instrukcją producenta. Natychmiast umyj szkiełka TBST sześć razy przez 10 minut za każdym razem. Przykryj każde szkiełko 100 mikrolitrami 300 nanomolowych DAPI przez pięć minut w ciemności.

Następnie umyj TBST pięć razy przez trzy minuty za każdym razem. Nałóż kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu bezpośrednio na szklane szkiełko otaczające sekcję. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na sekcję, nie tworząc żadnych pęcherzyków.

Pozostawić próbki do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zlokalizować skrzepliny, skanuj czaszkowo lub doogonowo wzdłuż długości aorty, rozwidlenia aorty i każdej tętnicy udowej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym z obiektywem 10x. Najpierw zbadaj skrawki pod kątem bezkomórkowego DNA za pomocą kanału DAPI ze wzbudzeniem na 357 i 44 nanometrach.

Zidentyfikuj zewnątrzkomórkową elastazę neutrofilową i cytrulinowany histon H3 odpowiednio na kanałach białkowych czerwonej i zielonej fluorescencji w Teksasie. Utrzymuj stały czas ekspozycji i wzmocnienia każdego kanału przez cały czas pozyskiwania obrazów, aby uniknąć nasycenia intensywności pikseli. Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili są identyfikowane na podstawie kolokalizacji elastazy neutrofilowej, cytrulinowanego histonu H3 i bezkomórkowego DNA.

Za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz mikroskopii jasnego pola, skrzepliny tętnicze kotów składają się z czerwonych krwinek, leukocytów, fibryny i płytek krwi. NET pojawiły się jako sieci ciemnofioletowych nici o różnej długości otaczających pobliskie erytrocyty i leukocyty. Korzystając z tego protokołu, mikroskopia immunofluorescencyjna ujawniła duże agregaty NET złożone z bezkomórkowego DNA, zewnątrzkomórkowego cytrulinowanego histonu H3 i elastazy neutrofilowej.

W kontraście fazowym w mikroskopii immunologicznej skrzeplinę scharakteryzowano jako dobrze odgraniczoną strukturę w przestrzeni naczyniowej. Zakrzepów nie wykryto jednak w żadnej z próbek kontrolnych. Rysunek ten pokazuje głęboką autofluorescencję elementów skrzepu, takich jak erytrocyty, gdy są obrazowane na długości fali 488 nanometrów.

Krótkie wygaszanie autofluorescencji po znakowaniu immunologicznym znacznie zwiększyło czułość kolokalizacji białek i wykrywania NET nawet w obszarach z dużą ilością erytrocytów. Czas wiązania wpływa na immunoreaktywność niektórych antygenów. Zalecamy utrwalenie nie dłużej niż 24 godziny od odwodnienia i zatopienia parafiny.

Alternatywnie, paraformaldehyd bez metanolu może być stosowany w celu ograniczenia artefaktów kwasu mrówkowego i ketonów z utleniania formaldehydu. Aby zapobiec interferencji podczas stosowania przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od tego samego gatunku, dołączyliśmy dodatkowy etap blokowania w celu nasycenia wszelkich pozostałych miejsc wiązania na przeciwciałach drugorzędowych. Badacze muszą uwzględnić kontrole ujemne składające się z przeciwciał izotypowych, wykluczenie przeciwciał pierwszorzędowych i etapu znakowania immunologicznego oraz kontrole biologiczne od kotów bez zakrzepicy.

Autofluorescencja granic tkankowych skrzeplin może utrudnić mikroskopową identyfikację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili. Badacz może zminimalizować fluorescencję za pomocą fluoroforów dalekiej czerwieni. Technika ta może być cennym narzędziem do badania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u innych gatunków weterynaryjnych.

Może to zapewnić lepsze zrozumienie patofizjologii zakrzepicy.