Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii
16 czerwca 2020
Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.
Nanocząstki magnetyczne są idealnymi narzędziami w naukach analitycznych i nanomedycynie ze względu na ich silne właściwości magnetyczne i łatwą funkcjonalizację ich powierzchni. Przedstawiamy tutaj pierwszy przypadek koniugatu między cząstkami magnetycznymi krzemionki funkcjonalizowanej aminowo a feroksaminą sideroforową wraz z oceną wychwytywania materiału fotogenicznego. Siderofory to małe, organiczne cząsteczki, które odgrywają kluczową rolę w mechanizmie udziału żelaza i są rozpoznawane przez specyficzne receptory błony zewnętrznej bakterii.
Ten film przedstawia krok po kroku skuteczny protokół przygotowania magnetycznych nanocząstek żelaza. Następnie pokryto je krzemionką w celu ochrony dyspersji i ochrony jądra magnetycznego. Powstałą w ten sposób powierzchnię reaktora funkcjonalizowano grupami aminowymi.
Synteza nanocząstek magnetycznych sprzężonych z feroksaminą. Dodaj 0,5 grama Fe(acac)3 do szklanej fiolki o pojemności 20 ml. Następnie wymieszaj z 10 ml alkoholu benzylowego.
Sonikuj tę mieszaninę przez 2 minuty. Następnie przenieś do bloku grzewczego i podgrzewaj w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Przepłucz nanocząsteczki 96% etanolem.
I wirować przez 30 minut. Oddzielić nanocząstki od supernatantu przez przyciąganie magnetyczne za pomocą magnesu neodymowego. Wyrzucić pozostały rozpuszczalnik.
Odrzucić supernatant, na przemian z sonikacją, aż rozpuszczalnik stanie się klarowny. Przygotuj zawiesinę 2 gramów MNP w 80 mililitrach izopropanolu, dodaj 4 mililitry 21% amoniaku, 7,5 mililitra wody destylowanej i 0,56 mililitra TEOS. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 2 godziny, ciągle mieszając.
Następnie sonikuj przez 1 godzinę. Oddziel MNP za pomocą magnesu, wyrzuć supernatant, rozprosz go w 30 mililitrach izopropanolu, dodaj amoniak, wodę destylowaną i TEOS, w tej samej kolejności, jak opisano wcześniej. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwie godziny, ciągle mieszając.
Następnie sonikuj przez godzinę. Wyjmij i wygodnie umyj mieszadło magnetyczne, aby odzyskać cały materiał. Wyrzucić supernatant i przepłukać nanocząstki trzykrotnie 96% etanolem, na przemian z sonikacją.
Suszyć nanocząstki w próżni w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Przepłukać 500 miligramów MNP@SIO2 otrzymanej w poprzednim etapie dimetyloformamidem. Poddaj je sonizacji i wyrzuć.
Ponownie zawiesić cząstki w kolbie okrągłodennej, wymieszać prętem magnetycznym i dodać 9 mililitrów APTES. Mieszaj mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Wyrzucić supernatant i przepłukać nanocząstki trzykrotnie 96% etanolem, na przemian z sonikacją.
Rozpuścić 100 mg deferoksaminy, soli mezylanowej i 53,0 miligramów acetyloacetonianu żelaza w 5 mililitrach wody destylowanej. Mieszaj mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej. Powstały produkt umyć trzykrotnie 20 mililitrami octanu etylu w lejku separacyjnym
.Usuń rozpuszczalnik organiczny w próżni. Liofilizować fazę wodną, aby uzyskać feroksaminę i czerwone ciało stałe. Dodać 350 miligramów bezwodnika bursztynowego do roztworu 100 mg feroksaminy w 5 mililitrach pirydyny w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 mililitrów.
Mieszaj powstałą mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Usunąć nadmiar pirydyny pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozpuść surową reakcję w 3 mililitrach metanolu.
Przenieść roztwór metanolowy do kolumny LH-20 i eluować w tempie 0,5 ml/minutę. Zbierz czerwoną frakcję i usuń metanol w próżni. Przepłukać 30 mg suchych nanocząstek funkcjonalizowanych aminami dwukrotnie DMF i poddać sonifikacji nanocząstek w 100-mililitrowej kolbie Erlenmeyera przez 30 minut.
Przygotować roztwór 200 miligramów N-sukcynyloferoksaminy, 173 miligramów heksafluorofosforanu 1-yl-oksy-fosfonii benzotriazolu BOP, 46 mg 1-hydroksybenzotriazolu HOBt i 128,8 miligrama N, N-diizopropyloetyloaminy DIPEA, w 10 ml DMF, w 50-mililitrowej kolbie okrągłodennej. Zawiesić wcześniej wypłukany MNP@SiO2@NH2 w 3 mililitrach DMF, pod wpływem sonikacji w suchych i beztlenowych warunkach. Użyj atmosfery argonu.
Dodaj, kroplami, wymieszaj A, aby wymieszać B. Wstrząśnij końcową mieszaniną za pomocą wytrząsarki orbitalnej w temperaturze pokojowej przez noc. Oddziel powstały sprzęg od zawiesiny za pomocą magnesu. Test bakteryjny ze szczepami Y.enterocolitica w celu ilościowego określenia izolacji i wychwytywania bakterii chorobotwórczych za pomocą nanocząstek.
Przygotować zawiesinę wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu w PBS w stężeniu 1 mg/ml w sterylnych probówkach. Przygotuj przez noc kulturę Y.entorocolitica w 5 ml bulionu Luria Bertani, LB. Przygotuj 5 ml bulionu sojowego z trypcase'u z niedoborem żelaza, TSB, dodając 50 mikrolitrów 10 mM 2, 2-bipirydylu roztworu.
Zaszczep 5 mililitrów bulionu TSB z niedoborem żelaza za pomocą 50 mikrolitrów nocnej kultury Y.enterocolitica. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem, aż do osiągnięcia OD600 od 0,5 do 0,8. Weź 100 mikrolitrów nocnej kultury i rozcieńcz ją w probówce zawierającej 900 mikrolitrów PBS, aby uzyskać pierwsze rozcieńczenie 1:10.
Następnie przygotuj rozcieńczenie 1/100 z pierwszego rozcieńczenia, stosując tę samą procedurę, aby uzyskać stężenie komórek bakteryjnych na poziomie 10 do mocy około 6 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny nanocząstek i 1 mg / ml do 1 mililitra rozcieńczenia 1/100 bakterii. Oddziel agregaty bakterii MNP za pomocą magnesu, ostrożnie wyrzuć supernatant.
Przepłucz oddzielone nanocząstki dwukrotnie 1 milimetrem PBS za pomocą wiru. Przygotować cztery kolejne rozcieńczenia 1:10 z poprzedniej zawiesiny, aż do rozcieńczenia 10 do potęgi minus 4. Umieścić 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych TS.
Sfotografuj płytkę za pomocą digitalizatora żelu w trybie epi white. Przetwarzaj obraz za pomocą wygodnego oprogramowania, aby wzmocnić plamkę, aby policzyć liczbę poszczególnych kolonii. Aby potwierdzić powstanie wiązania kowalencyjnego między nanocząstkami a sideroforem, stosujemy spektroskopię Ramana FT-IR do monitorowania syntezy, obserwując, jak na każdym etapie pojawiają się nowe prążki zgodne z nowymi grupami funkcyjnymi.
Do obserwacji morfologii i wielkości cząstek wykorzystano mikroskopię TEM i SEM. Analiza termograwimetryczna w celu pomiaru utraty masy ciała w wyniku dodania materiału organicznego. A XPS pozwalają nam analizować różne stopnie utlenienia atomów na powierzchni i potwierdzać powstawanie wiązań kowalencyjnych.
Na koniec wykorzystaliśmy wszystkie produkty pośrednie w końcowym koniugacie, aby przetestować jego zdolność do wychwytywania bakterii, w celu ustalenia ich właściwości jako bioczujnika. Protokół ten został opracowany w celu wykorzystania wysokiej biokompatybilności nanocząstek magnetytu. Powłoka z krzemionką poprawia dyspersję i chroni jądro magnetyczne przed degradacją w środowisku wodnym.
A także dać reaktywną powierzchnię do funkcjonalizacji grupami aminowymi, które są niezbędne do kowalencyjnego wiązania sideroforu zmodyfikowanego kwasem przez chemię karmodiimidu. W tym przypadku N-sukcynilferoksamina. Przetestowano zdolność wychwytywania bakterii sprzężonych i w rezultacie stwierdzono niewielką liczbę kolonii, bez istotnej różnicy w stosunku do produktów pośrednich ze względu na specyficzne interakcje na masywne efekty prezentowane w zawiesinie bakteryjnej PBS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przygotowania i funkcjonalizacji nanocząsteczek magnetycznych. Obejmuje on powlekanie krzemionką i konjugację z deferoksaminą, a także charakterystykę strukturalną oraz test wychwytywania bakterii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Synteza nanocząsteczek
- Materiały magnetyczne
- Zastosowania biomedyczne
Wstęp
- Nanocząsteczki magnetyczne posiadają silne właściwości magnetyczne.
- Mogą być one łatwo funkcjonalizowane do różnorodnych zastosowań.
- Siderofory odgrywają kluczową rolę w pobieraniu żelaza przez bakterie.
- Funkcjonalizowane nanocząsteczki mogą być wykorzystywane do ukierunkowanego wychwytywania bakterii.
Cel badania
- Opracowanie metody przygotowania nanocząstek magnetycznych.
- Funkcjonalizacja tych nanocząstek w celu zwiększenia wydajności wychwytywania bakterii.
- Ocena skuteczności koniugatu w wychwytywaniu bakterii patogennych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie magnetycznych nanocząstek żelaza.
- Powlekanie krzemionką w celu zapewnienia stabilności.
- Funkcjonalizacja aminowa z użyciem (3-aminopropyl)trietoksysilanu (APTES).
- Koniugacja z deferoksaminą przy użyciu łącznika succynylowego.
Główne wyniki
- Pomocna synteza funkcjonalizowanych nanocząsteczek magnetycznych.
- Charakterystyka właściwości strukturalnych nanocząsteczek.
- Wykazanie skutecznego wychwytywania Y. enterocolitica.
- Walidacja użyteczności koniugatu w testach wychwytywania bakterii.
Wnioski
- Opracowane nanocząsteczki wykazują potencjał w zastosowaniach biomedycznych.
- Funkcjonalizacja zwiększa ich zdolność do celowania w konkretne bakterie.
- Niniejsza praca stanowi podstawę dla przyszłych zastosowań w diagnostyce i terapeutyce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza praca ustanawia platformę z funkcjonalizowanych nanocząsteczek magnetycznych do wychwytywania patogenów, oferując narzędzie wielokrotnego użytku do wczesnej walidacji celu w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Poprzez sprzęganie sideroforów z biozgodnymi rdzeniami, metoda ta wspomaga mechanistyczne ograniczanie ryzyka w strategiach detekcji bakterii i umożliwia ilościową ocenę zaangażowania celu. Podejście to dostarcza wartości prognostycznej dla testów przesiewowych, w których wymagane jest specyficzne rozpoznawanie bakterii, co zmniejsza niejednoznaczność w procesie optymalizacji związków wiodących (hit-to-lead).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie bakteryjnych szlaków poboru zależnych od sideroforów w celu weryfikacji hipotez dotyczących celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system z możliwością separacji magnetycznej, pozwalający na izolację specyficznych interakcji bakteryjnych z kompleksowych mieszanin.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę specyficzności celu poprzez pomiary wydajności wychwytu w określonych szczepach bakteryjnych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie mierzalnych wyników wychwytu bakterii poprzez liczenie kolonii po separacji magnetycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną zawiesinę nanocząsteczek o stężeniu 1 mg/mL w PBS, co gwarantuje spójne wyniki analizy.
- Skalowalność: Wykorzystuje syntezę solwotermalną i powłokę krzemionkową do wytwarzania stabilnych partii odpowiednich dla wielodołkowych formatów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Bezpośrednia ocena wychwytu Yersinia enterocolitica, patogennego modelu do badań nad zakażeniami odzwierzęcymi.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie syntezy nanocząstek z walidacją funkcjonalną w pożywkach o niskiej zawartości żelaza, naśladujących środowisko gospodarza.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia równoległe testowanie produktów pośrednich w celu zmniejszenia ryzyka związanego z wydajnością koniugacji przed zastosowaniem biologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których walidacja celu wymaga izolacji konkretnych szczepów bakteryjnych z nadosadów hodowlanych, co umożliwia przejście do identyfikacji wiodących cząsteczek przy zredukowanym ryzyku wyników fałszywie dodatnich.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wiązania receptorów sideroforów jako mechanizmu wirulencji.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymanie nanocząstek funkcjonalizowanych grupami aminowymi, gotowych do sprzęgania z różnymi ligandami celującymi, poza feroksaminą.
- Analityka: Wykorzystuje oznaczanie jednostek tworzących kolonie po separacji magnetycznej w celu uzyskania ilościowych, statystycznie ocenialnych wyników.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje pożywkę TSB o obniżonej zawartości żelaza do symulacji warunków in vivo, co zwiększa istotność badania w kontekście dostosowania przedklinicznych biomarkerów.
- Zastosowania wielokrotne: Tworzy modułową platformę, w której rdzeń magnetyczny może być regenerowany i ponownie funkcjonalizowany na potrzeby wielu kampanii celowania.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji bakteryjnych celów terapeutycznych dzięki bezpośrednim, mierzalnym analizom wychwytu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność między partiami dzięki powłoce krzemionkowej i zestandaryzowanym protokołom funkcjonalizacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych dowodów na swoiste wiązanie z celem w modelach patogennych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe lub testy diagnostyczne z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o mierzalną wydajność wychwytu.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie syntezy nanocząsteczek, chemii powierzchni oraz technik separacji magnetycznej.
- Zależy od dostępu do sonikatora, bloków grzewczych, wirówek i magnesów do przetwarzania partii.
- Wymaga standaryzacji zawiesin bakteryjnych opartych na PBS oraz pośrodków ubogich w żelazo do badań porównawczych.
- Należy uwzględnić zmienność partii w zakresie rozmiaru nanocząsteczek i gęstości amin powierzchniowych podczas skalowania konjugacji.
- Ograniczone przez niespecyficzne wiązanie w złożonych matrycach biologicznych, co wymaga etapów blokowania lub płukania, zgodnie z opisem w protokole.
