Name: Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: Poznaj syntezę nanocząstek magnetycznych i ich koniugację z sideroforem feroksaminą do wykrywania bakterii. Metoda obejmuje powlekanie krzemionką i funkcjonalizację aminową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują profesorowi Klausowi Hantke (Uniwersytet w Tybindze, Niemcy) za uprzejme dostarczenie szczepów Yersinia enterocolitica użytych w tej pracy. Prace te były wspierane przez granty AGL2015-63740-C2-1/2-R i RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) z Państwowej Agencji Badawczej (AEI) z Hiszpanii, współfinansowane z programu FEDER ze środków Unii Europejskiej. Prace na Uniwersytecie w Santiago de Compostela i Uniwersytecie A Coruña były również wspierane przez granty GRC2018/018, GRC2018/039 i ED431E 2018/03 (grupa strategiczna CICA-INIBIC) z Xunta de Galicia. Na koniec chcemy podziękować Nurii Calvo za jej wspaniałą współpracę przy podkładaniu głosu pod ten protokół wideo.

UWAGA: Dla reakcji przeprowadzanych w warunkach obojętnej atmosfery, wszystkie naczynia szklane zostały wcześniej wysuszone w piecu w temperaturze 65 °C, uszczelnione gumową przegrodą i trzykrotnie przeczyszczone argonem.
1. Synteza nanocząstek magnetycznych sprzężonych z feroksaminą
<ol>
	<li>Synteza nanocząstek magnetycznych Fe3O4 (MNP)
	<ol>
		<li>Dodać 0,5 g Fe(acac)3 do szklanej fiolki o pojemności 20 ml, a następnie wymieszać z 10 ml alkoholu benzylowego.</li>
		<li>Sonikować tę mieszaninę przez 2 minuty, a następnie przenieść do bloku grzewczego i podgrzewać w temperaturze 180 °C przez 72 godziny.</li>
		<li>Po zakończeniu reakcji odczekać, aż fiolki ostygną, przepłukać nanocząstki 96% etanolem i odwirować przy 4000 x g przez 30 minut. Powtórzyć wirowanie co najmniej dwa razy.</li>
		<li>Oddzielić nanocząstki od supernatantu przez przyciąganie magnetyczne za pomocą magnesu neodymowego (NdFeB) i wyrzucić resztki rozpuszczalnika.</li>
		<li>Przepłukać 96% etanolem, powtarzając krok 1.1.4. i wyrzucić supernatant na przemian z sonikacją w kąpieli na 1 minutę przy 40 kHz, aż rozpuszczalnik będzie klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka nanocząstek magnetycznych SiO2 (MNP@SiO2)
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę 2 g MNP w 80 ml izopropanolu, a następnie dodać 4 ml 21% amoniaku, 7,5 ml wody destylowanej i 0,56 ml ortokrzemianu tetraetylu (TEOS) (w tej kolejności) w kolbie okrągłodennej z mieszadłem magnetycznym.</li>
		<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 40 °C przez 2 godziny z ciągłym mieszaniem, a następnie poddać sonikacji przez 1 godzinę.</li>
		<li>Oddzielić MNP za pomocą magnesu, wyrzucić supernatant i rozproszyć go w 30 ml izopropanolu.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.1 i 1.2.2.</li>
		<li>Wyjmij i umyj mieszadło magnetyczne 96% etanolem, aby odzyskać cały materiał.</li>
		<li>Oddziel nanocząstki od supernatantu przez przyciąganie magnetyczne za pomocą magnesu.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i przepłucz nanocząstki 96% etanolem trzy razy na przemian z sonikacją.</li>
		<li>Suszyć nanocząstki w próżni w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FunkcjonalizacjaMNP@SiO 2 za pomocą (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES)
	<ol>
		<li>Przepłukać 500 mg MNP@SiO2 otrzymanego w poprzednim etapie N,N-dimetyloformamidem (DMF) w atmosferze obojętnej, a następnie poddać sonikacji przez 1 minutę przy 40 kHz. Następnie odrzuć supernatant i powtórz ten proces trzy razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić cząstki w kolbie okrągłodennej, mieszając mieszadłem magnetycznym i dodać 9 ml APTES.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 12 godzin.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i przepłucz nanocząstki 96% etanolem trzy razy na przemian z sonikacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza feroksaminy
	<ol>
		<li>Rozpuścić 100 mg (0,15 mmol) soli mezylanu deferoksaminy i 53,0 mg (0,15 mmol) Fe(acac)3 w 5 ml wody destylowanej i mieszać mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Otrzymany produkt przemyć trzykrotnie 20 ml EtOAc w lejku separacyjnym, a następnie usunąć rozpuszczalnik organiczny pod próżnią za pomocą wyparki obrotowej.</li>
		<li>Liofilizuj fazę wodną, aby uzyskać feroksaminę w postaci czerwonego ciała stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza N-sukcynyloferoksaminy 
	<ol>
		<li>Dodać 350 mg (3,50 mmol) bezwodnika bursztynowego do roztworu 100 mg (0,17 mmol) feroksaminy w 5 ml pirydyny w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml w obojętnej atmosferze.</li>
		<li>Mieszaj powstałą mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Po tym czasie usunąć nadmiar pirydyny pod zmniejszonym ciśnieniem w parowniku obrotowym, aby uzyskać ciemnoczerwone ciało stałe.</li>
		<li>Rozpuścić surową reakcję w 3 ml metanolu.</li>
		<li>Przenieść roztwór metanolowy do kolumny Sephadex (20 cm Sephadexu w kolumnie o średnicy 20 mm) i eluować w stężeniu 0,5 ml/min.</li>
		<li>Zebrać czerwoną frakcję i usunąć metanol pod próżnią za pomocą wyparki obrotowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza sprzężenia MNP@SiO2@NH@Fa
	<ol>
		<li>Przepłukać 30 mg suchej MNP@SiO2@NH 2 dwukrotnie DMF i poddać sonicyjce nanocząstki w 100 ml kolbie Erlenmeyera przez 30 minut w atmosferze obojętnej.</li>
		<li>Przygotować roztwór N-sukcynyloferoksaminy (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazolu-1-y-ylo-oksy-tris-(dimetyloamino)-fosfoniowego heksafluorofosforanu (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) i N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) w 10 ml DMF (mieszanina A) w 50 ml kolby okrągłodennej w atmosferze obojętnej.</li>
		<li>Zawiesić wcześniej wypłukane MNP@SiO2@NH2 w 3 ml DMF podczas sonikacji w suchych warunkach beztlenowych przy użyciu atmosfery argonu gazowego (Mix B).</li>
		<li>Dodaj mieszankę A, aby mieszać B kroplami.</li>
		<li>Wstrząśnij końcową mieszaniną za pomocą wytrząsarki orbitalnej w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
		<li>Oddzielić otrzymany sprzęgnięty (MNP@SiO2@NH@Fa) od zawiesiny za pomocą magnesu.</li>
		<li>Wypłucz powstałą substancję stałą, a następnie poddaj ją pięciokrotnej sonikacji 10 ml etanolu.</li>
		<li>Suszyć ciało stałe w próżni przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test bakteryjny ze szczepami Y. enterocolitica w celu ilościowego wychwytywania bakterii chorobotwórczych za pomocą nanocząstek
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu w PBS w stężeniu 1 mg/ml w sterylnych probówkach o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Przygotować kulturę Y. enterocolitica w 5 ml bulionu Luria Bertani (LB) przez noc inkubując w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj 5 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) z niedoborem żelaza, dodając 50 μl 10 mM 2,2′-bipirydylu.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml TSB z niedoborem żelaza za pomocą 50 μl nocnej kultury Y. enterocolitica, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z mieszaniem, aż do osiągnięcia OD600 = 0,5\u20120,8.</li>
	<li>Pobrać 100 μl kultury otrzymanej w kroku 2.4 i rozcieńczyć w probówce o pojemności 2,0 ml zawierającej 900 μl PBS, aby uzyskać pierwsze rozcieńczenie 1:10. Następnie przygotuj rozcieńczenie 1/100 z pierwszego rozcieńczenia, stosując tę samą procedurę, aby uzyskać stężenie komórek bakteryjnych na poziomie 1 x 106 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w przybliżeniu.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny nanocząstek o stężeniu 1 mg/ml do 1 ml zawiesiny bakteryjnej rozcieńczonej w stosunku 1:100 w probówce o pojemności 2,0 ml i homogenizować za pomocą wiru.</li>
	<li>Inkubować kulturę w temperaturze 20 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Oddziel agregaty MNP/bakterii za pomocą magnesu i ostrożnie wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Przepłukać oddzielone nanocząstki dwukrotnie 1 ml PBS za pomocą wiru.</li>
	<li>Zawieś nanocząstki w 1 ml PBS, aby policzyć ilość wychwytu bakterii w CFU/ml.</li>
	<li>Przygotować cztery kolejne rozcieńczenia 1:10 z poprzedniej zawiesiny, aż do uzyskania rozcieńczenia 1 x 10-4.</li>
	<li>Umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych TS i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Sfotografuj płytkę za pomocą digitalizatora żelu w trybie epi white. Przetwarzaj obraz za pomocą odpowiedniego oprogramowania, aby wzmocnić plamkę, aby policzyć liczbę poszczególnych kolonii. 
	UWAGA: Każdy półprodukt MNP został scharakteryzowany w celu śledzenia postępu syntezy. Po pierwsze, gołe MNP zostały zbadane za pomocą XRD w celu sprawdzenia struktury krystalicznej. Następnie przeprowadzono badanie widma FT-IR każdego produktu pośredniego, aby sprawdzić zmiany, które zaszły w odpowiedniej reakcji. Przeprowadzono również analizę spektroskopii Ramana każdego z produktów pośrednich w celu potwierdzenia wniosków wydedukowanych z widm FT-IR. Analiza TGA pozwoliła na oszacowanie masy ubytkowej półproduktów zawierających w swojej strukturze materiał organiczny. Morfologia i rozmiar każdego produktu pośredniego były badane za pomocą TEM. Wreszcie, analiza XPS miała kluczowe znaczenie dla określenia stopni utlenienia atomów na każdej powierzchni pośredniej MNP i potwierdzenia tworzenia wiązania kowalencyjnego w sprzężonym MNP@SiO2@NH@Fa.</li>
</ol>

<ol><li>Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles+for+the+manipulation+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells.</a> Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).</li>
<li>Zheng, T., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-based+detection+of+Fe%28III%29+and+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens.</a> Metallomics. 4, 866-880 (2012).</li>
<li>Hider, R. C., Kong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li>
<li>Sandy, M., Butler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Iron+Acquisition%3A+Marine+and+Terrestrial+Siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores.</a> Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).</li>
<li>Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetite+Nanocrystals+%3A+Nonaqueous+Synthesis%2C+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization.</a> Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).</li>
<li>Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+silica+coated+iron+oxide+magnetic+nano-particles%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+-+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles.</a> Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).</li>
<li>Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+tissue+plasminogen+activator+by+binding+to+silica-coated+magnetic+nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).</li>
<li>El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+glyco-nanoparticles%3A+a+unique+tool+for+rapid+pathogen+detection%2C+decontamination%2C+and+strain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).</li>
<li>Martínez-Matamoros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functionalized+magnetic+nanoparticles+conjugated+with+feroxamine+and+their+evaluation+for+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection.</a> RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).</li>
<li>Cozar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+surface-enhanced+Raman+study+of+desferrioxamine+B+and+its+Fe%28III%29+complex%2C+ferrioxamine+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B.</a> Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).</li>
<li>Shebanova, O. N., Lazor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a-C%3AH+and+oxygen-containing+Si%3AC%3AH+films+by+Raman+spectroscopy+and+XPS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solid+State+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS.</a> Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).</li>
<li>González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopic+study+of+bioactive+silica+based+glasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Non-Crystalline+Solids%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses.</a> Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).</li>
<li>Veres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a-C%3AH+and+oxygen-containing+Si%3AC%3AH+films+by+Raman+spectroscopy+and+XPS%5BTitle%5D)+AND+%22Diamond+and+Related+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS.</a> Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+investigation+of+Si-C+covalent+bonding+of+single+carbon+nanotube+grown+on+silicon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate.</a> Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).</li>
<li>Graf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPS+and+NEXAFS+studies+of+aliphatic+and+aromatic+amine+species+on+functionalized+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces.</a> Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).</li>
<li>Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+HMDSO%2FO2+plasma+deposits+using+a+high-sensitivity+and+-energy+resolution+XPS+instrument%3A+curve+fitting+of+the+Si+2p+core+level%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level.</a> Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).</li>
<li>Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+bacteriophage+conjugated+magnetic+particles+for+E.+coli+capturing%3A+Influence+of+bacteriophage+loading%2C+temperature+and+tryptone%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).</li>
<li>Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino-functionalized+magnetic+nanoparticles+for+enhancement+of+bacterial+capture+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency.</a> RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).</li>
<li>Zhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+pathogenic+bacteria+and+viruses+by+multifunctional+amine-modified+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles.</a> Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje syntezę koniugatu między nanocząstkami magnetycznymi a sideroforem feroksaminą poprzez wiązanie kowalencyjne. Syntezę magnetytu przeprowadzono przy użyciu protokołu opisanego przez Pinna i wsp.5, a następnie pokryto go powłoką krzemionkową w celu ochrony jądra magnetycznego przed korozją w układach wodnych, zminimalizowania agregacji i zapewnienia odpowiedniej powierzchni do funkcjonalizacji6. Proces powlekania krzemionką został zmodyfikowany. Zamiast p...

Metody wykrywania bakterii za pomocą MNP opierają się na molekularnym rozpoznawaniu przeciwciał, aptamerów, bioprotein, węglowodanów sprzężonych z MNP przez bakterie chorobotwórcze1. Biorąc pod uwagę, że siderofory są rozpoznawane przez specyficzne receptory na zewnętrznej błonie bakterii, mogą one również łączyć się z MNP, aby zwiększyć ich specyficzność2. Siderofory to małe cząsteczki organiczne biorące udział w wychwytywaniu Fe3+ przez bakterie3,4. Przygotowanie koniugatów między sideroforami a MNP wraz z ich oceną pod kątem wychwytywania i izolacji bakterii nie zostało jeszcze zgłoszone.
Jednym z kluczowych etapów syntezy koniugatów magnetycznych nanocząstek z małymi cząsteczkami jest wybór rodzaju wiązania lub interakcji między nimi, aby zapewnić, że mała cząsteczka jest dołączona do powierzchni MNP. Z tego powodu procedura przygotowania koniugatu między nanocząstkami magnetycznymi a feroksaminą – sideroforem rozpoznawanym przez Yersinia enterocolitica – skupiła się na wytworzeniu modyfikowalnej powierzchni MNP, aby umożliwić kowalencyjne powiązanie jej z sideroforem za pomocą chemii karbodiimidu. W celu uzyskania jednorodnych nanocząstek magnetytu (MNP) oraz poprawy zarodkowania i kontroli wielkości, reakcję solfolizy z alkoholem benzylowym przeprowadzono w bloku termicznym bez wstrząsania5. Następnie metodą Stöbera wygenerowano powłokę krzemionkową w celu zapewnienia ochrony i poprawy stabilności zawiesiny nanocząstek w środowisku wodnym6. Biorąc pod uwagę strukturę feroksaminy, wprowadzenie grup aminowych jest konieczne do wytworzenia odpowiednich nanocząstek (MNP@SiO2@NH 2), które mają być sprzężone z sideroforem. Osiągnięto to poprzez kondensację (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) z grupami alkoholowymi obecnymi na powierzchni nanocząstek modyfikowanych krzemionką (MNP@SiO2) przy użyciu metody zol-żel7.
Równolegle, kompleks feroksaminy żelaza(III) został przygotowany przez kompleksowanie dostępnej na rynku deferoksaminy z octanem acetylu żelaza w roztworze wodnym. N-sukcynyloferoksaminę, zawierającą grupy sukcynylowe, które będą działać jako łączniki, otrzymano w reakcji feroksaminy z bezwodnikiem bursztynowym.
Koniugacja między MNP@SiO2@NH 2 a N-sukcynyloferoksaminą w celu uzyskania MNP@SiO2@NH@Fa została przeprowadzona poprzez chemię karbodymidu przy użyciu jako odczynników sprzęgających: heksafluorofosforanu benzotriazolu-1-ylo-oksy-tris-(dimetyloamino)-fosfoniowego (BOP) i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w miękkim podłożu zasadowym w celu aktywacji końcowej grupy kwasowej w N-sukcynyloferoksaminie<sup="xref">8.
Po scharakteryzowaniu MNP, oceniliśmy możliwości gołych i funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych do wychwytywania typu dzikiego (WC-A) i mutanta Y. enterocolitica pozbawionego receptora feroksaminy FoxA (FoxA WC-A 12-8). Zwykłe MNP, funkcjonalizowane MNP i koniugatMNP@SiO 2@NH@Fa mogły wchodzić w interakcje z każdym szczepem Y. enterocolitica. Agregaty sprzężone z bakteriami oddzielono od zawiesiny bakteryjnej za pomocą pola magnetycznego. Oddzielone agregaty przepłukano dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponownie zawieszono w PBS w celu przygotowania seryjnych rozcieńczeń, a następnie posiano je w celu zliczenia kolonii. Protokół ten demonstruje każdy etap syntezyMNP@SiO 2@NH@Fa, charakterystykę strukturalną wszystkich produktów pośrednich i koniugatu oraz test wychwytywania bakterii jako łatwy sposób oceny swoistości koniugatu w stosunku do produktów pośrednich. 9

<table><tbody><tr><td>1-Hydroksybenzotriazol hydrat HOBT</td><td>Acros</td><td>300561000</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropylotrietrazysilan 99%</td><td>Acros</td><td>151081000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu 28% NH3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Heksafluorofosforan heksafluorofosforanu benzotriazolu-1-yloksytris(dimetyloamino)-fosfonii Odczynnik BOP</td><td>Acros</td><td>209800050</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>822259</td><td></td></tr><tr><td>Sól mezylanowa deferoksaminy >92,5% (TLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny, 96%</td><td>Panreac</td><td>131085</td><td></td></tr><tr><td>octan etylu, ekstra czysty, SLR, Fisher Chemical</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octoacetonian żelaza(III) 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F300</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina, 99,5+%, AcroSeal</td><td>Acros</td><td>459591000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid, 99,8%, Extra Dry, AcroSeal</td><td>Acros</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna, 99,5%, Ekstra wytrawny, AcroSeal</td><td>Acros</td><td></td><td></td>339421000</tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LH20100</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik bursztynowy >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239690</td><td></td></tr><tr><td>Ortozolikan tetraetylu >99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86578</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

W niniejszej pracy opisano syntezę nanocząstek magnetycznych, ich powlekanie SiO2, następnie funkcjonalizację aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugację z deferoksaminą, sideroforem rozpoznawanym przez Yersinia enterocolitica, wykorzystującym ugrupowanie sukcynylu jako łącznik.
Magnetyczne nanocząstki (MNP) magnetytu (Fe3O4) zostały przygotowane metodą solwotermiczną i pokryte SiO2 (MNP@SiO2) przy użyciu procesu Stöbera, a następnie funkcjonalizowane APTES (MNP@SiO2@NH2). Następnie feroksaminę sprzężono z MNP@SiO2@NH2 przez sprzężenie karbodiamimidowe, dając MNP@SiO2@NH2@Fa. Morfologię i właściwości koniugatu i produktów pośrednich badano ośmioma różnymi metodami, w tym dyfrakcją proszkową promieniowania rentgenowskiego (XRD), spektroskopią w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), spektroskopią Ramana, rentgenowską spektroskopią fotoelektronów (XPS), transmisyjną mikroskopią elektronową (TEM) i mapowaniem rentgenowskim z dyspersją energii (EDX). Ta wyczerpująca charakterystyka potwierdziła powstanie koniugatu. Wreszcie, aby ocenić pojemność i specyficzność nanocząstek, przetestowano je w teście wychwytywania bakterii przy użyciu Yersinia enterocolitica.

Przeprowadzono wyczerpującą charakterystykę strukturalną w celu określenia morfologii i właściwości każdego produktu pośredniego oraz końcowego koniugatu. W tym celu, aby wykazać powstanie koniugatu, wykorzystano techniki XRD, FT-IR, spektroskopię Ramanowską, TGA, TEM, mapowanie EDX oraz XPS. Stany utlenienia atomów na powierzchni nanocząsteczek uzyskane za pomocą spektroskopii fotoelektronów w promieniach rentgenowskich (XPS) stanowią najważniejsze dane potwierdzające powstanie wiązań kowalencyjnych pomiędzy nanocząstec...

Ta praca opisuje protokoły przygotowania nanocząstek magnetycznych, ich powlekania SiO2, następnie funkcjonalizacji aminy (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) i jej koniugacji z deferoksaminą przy użyciu ugrupowania sukcynylu jako łącznika. Szczegółowo opisano również szczegółowy opis charakterystyki strukturalnej i test wychwytywania bakterii z użyciem Y. enterocolitica dla wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Nanocząstki magnetyczne są idealnymi narzędziami w naukach analitycznych i nanomedycynie ze względu na ich silne właściwości magnetyczne i łatwą funkcjonalizację ich powierzchni. Przedstawiamy tutaj pierwszy przypadek koniugatu między cząstkami magnetycznymi krzemionki funkcjonalizowanej aminowo a feroksaminą sideroforową wraz z oceną wychwytywania materiału fotogenicznego. Siderofory to małe, organiczne cząsteczki, które odgrywają kluczową rolę w mechanizmie udziału żelaza i są rozpoznawane przez specyficzne receptory błony zewnętrznej bakterii.Ten film przedstawia krok po kroku skuteczny protokół przygotowania magnetycznych nanocząstek żelaza. Następnie pokryto je krzemionką w celu ochrony dyspersji i ochrony jądra magnetycznego. Powstałą w ten sposób powierzchnię reaktora funkcjonalizowano grupami aminowymi.Synteza nanocząstek magnetycznych sprzężonych z feroksaminą. Dodaj 0,5 grama Fe(acac)3 do szklanej fiolki o pojemności 20 ml. Następnie wymieszaj z 10 ml alkoholu benzylowego.Sonikuj tę mieszaninę przez 2 minuty. Następnie przenieś do bloku grzewczego i podgrzewaj w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Przepłucz nanocząsteczki 96% etanolem.I wirować przez 30 minut. Oddzielić nanocząstki od supernatantu przez przyciąganie magnetyczne za pomocą magnesu neodymowego. Wyrzucić pozostały rozpuszczalnik.Odrzucić supernatant, na przemian z sonikacją, aż rozpuszczalnik stanie się klarowny. Przygotuj zawiesinę 2 gramów MNP w 80 mililitrach izopropanolu, dodaj 4 mililitry 21% amoniaku, 7,5 mililitra wody destylowanej i 0,56 mililitra TEOS. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 2 godziny, ciągle mieszając.Następnie sonikuj przez 1 godzinę. Oddziel MNP za pomocą magnesu, wyrzuć supernatant, rozprosz go w 30 mililitrach izopropanolu, dodaj amoniak, wodę destylowaną i TEOS, w tej samej kolejności, jak opisano wcześniej. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez dwie godziny, ciągle mieszając.Następnie sonikuj przez godzinę. Wyjmij i wygodnie umyj mieszadło magnetyczne, aby odzyskać cały materiał. Wyrzucić supernatant i przepłukać nanocząstki trzykrotnie 96% etanolem, na przemian z sonikacją.Suszyć nanocząstki w próżni w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Przepłukać 500 miligramów MNP@SIO2 otrzymanej w poprzednim etapie dimetyloformamidem. Poddaj je sonizacji i wyrzuć.Ponownie zawiesić cząstki w kolbie okrągłodennej, wymieszać prętem magnetycznym i dodać 9 mililitrów APTES. Mieszaj mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Wyrzucić supernatant i przepłukać nanocząstki trzykrotnie 96% etanolem, na przemian z sonikacją.Rozpuścić 100 mg deferoksaminy, soli mezylanowej i 53,0 miligramów acetyloacetonianu żelaza w 5 mililitrach wody destylowanej. Mieszaj mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej. Powstały produkt umyć trzykrotnie 20 mililitrami octanu etylu w lejku separacyjnym.Usuń rozpuszczalnik organiczny w próżni. Liofilizować fazę wodną, aby uzyskać feroksaminę i czerwone ciało stałe. Dodać 350 miligramów bezwodnika bursztynowego do roztworu 100 mg feroksaminy w 5 mililitrach pirydyny w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 mililitrów.Mieszaj powstałą mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Usunąć nadmiar pirydyny pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozpuść surową reakcję w 3 mililitrach metanolu.Przenieść roztwór metanolowy do kolumny LH-20 i eluować w tempie 0,5 ml/minutę. Zbierz czerwoną frakcję i usuń metanol w próżni. Przepłukać 30 mg suchych nanocząstek funkcjonalizowanych aminami dwukrotnie DMF i poddać sonifikacji nanocząstek w 100-mililitrowej kolbie Erlenmeyera przez 30 minut.Przygotować roztwór 200 miligramów N-sukcynyloferoksaminy, 173 miligramów heksafluorofosforanu 1-yl-oksy-fosfonii benzotriazolu BOP, 46 mg 1-hydroksybenzotriazolu HOBt i 128,8 miligrama N, N-diizopropyloetyloaminy DIPEA, w 10 ml DMF, w 50-mililitrowej kolbie okrągłodennej. Zawiesić wcześniej wypłukany MNP@SiO2@NH2 w 3 mililitrach DMF, pod wpływem sonikacji w suchych i beztlenowych warunkach. Użyj atmosfery argonu.Dodaj, kroplami, wymieszaj A, aby wymieszać B. Wstrząśnij końcową mieszaniną za pomocą wytrząsarki orbitalnej w temperaturze pokojowej przez noc. Oddziel powstały sprzęg od zawiesiny za pomocą magnesu. Test bakteryjny ze szczepami Y.enterocolitica w celu ilościowego określenia izolacji i wychwytywania bakterii chorobotwórczych za pomocą nanocząstek.Przygotować zawiesinę wszystkich nanocząstek pośrednich i końcowego koniugatu w PBS w stężeniu 1 mg/ml w sterylnych probówkach. Przygotuj przez noc kulturę Y.entorocolitica w 5 ml bulionu Luria Bertani, LB. Przygotuj 5 ml bulionu sojowego z trypcase'u z niedoborem żelaza, TSB, dodając 50 mikrolitrów 10 mM 2, 2-bipirydylu roztworu.Zaszczep 5 mililitrów bulionu TSB z niedoborem żelaza za pomocą 50 mikrolitrów nocnej kultury Y.enterocolitica. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem, aż do osiągnięcia OD600 od 0,5 do 0,8. Weź 100 mikrolitrów nocnej kultury i rozcieńcz ją w probówce zawierającej 900 mikrolitrów PBS, aby uzyskać pierwsze rozcieńczenie 1:10.Następnie przygotuj rozcieńczenie 1/100 z pierwszego rozcieńczenia, stosując tę samą procedurę, aby uzyskać stężenie komórek bakteryjnych na poziomie 10 do mocy około 6 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny nanocząstek i 1 mg / ml do 1 mililitra rozcieńczenia 1/100 bakterii. Oddziel agregaty bakterii MNP za pomocą magnesu, ostrożnie wyrzuć supernatant.Przepłucz oddzielone nanocząstki dwukrotnie 1 milimetrem PBS za pomocą wiru. Przygotować cztery kolejne rozcieńczenia 1:10 z poprzedniej zawiesiny, aż do rozcieńczenia 10 do potęgi minus 4. Umieścić 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych TS.Sfotografuj płytkę za pomocą digitalizatora żelu w trybie epi white. Przetwarzaj obraz za pomocą wygodnego oprogramowania, aby wzmocnić plamkę, aby policzyć liczbę poszczególnych kolonii. Aby potwierdzić powstanie wiązania kowalencyjnego między nanocząstkami a sideroforem, stosujemy spektroskopię Ramana FT-IR do monitorowania syntezy, obserwując, jak na każdym etapie pojawiają się nowe prążki zgodne z nowymi grupami funkcyjnymi.Do obserwacji morfologii i wielkości cząstek wykorzystano mikroskopię TEM i SEM. Analiza termograwimetryczna w celu pomiaru utraty masy ciała w wyniku dodania materiału organicznego. A XPS pozwalają nam analizować różne stopnie utlenienia atomów na powierzchni i potwierdzać powstawanie wiązań kowalencyjnych.Na koniec wykorzystaliśmy wszystkie produkty pośrednie w końcowym koniugacie, aby przetestować jego zdolność do wychwytywania bakterii, w celu ustalenia ich właściwości jako bioczujnika. Protokół ten został opracowany w celu wykorzystania wysokiej biokompatybilności nanocząstek magnetytu. Powłoka z krzemionką poprawia dyspersję i chroni jądro magnetyczne przed degradacją w środowisku wodnym.A także dać reaktywną powierzchnię do funkcjonalizacji grupami aminowymi, które są niezbędne do kowalencyjnego wiązania sideroforu zmodyfikowanego kwasem przez chemię karmodiimidu. W tym przypadku N-sukcynilferoksamina. Przetestowano zdolność wychwytywania bakterii sprzężonych i w rezultacie stwierdzono niewielką liczbę kolonii, bez istotnej różnicy w stosunku do produktów pośrednich ze względu na specyficzne interakcje na masywne efekty prezentowane w zawiesinie bakteryjnej PBS.

synthesis-functionalized-magnetic-nanoparticles-their-conjugation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Technologia mikrofalowa umożliwia niezwykle szybką syntezę nanocząsteczek tlenku żelaza w celu scharakteryzowania blaszek miażdżycowych. Zastosowanie aminobisfosfonianu w zewnętrznej stronie nanocząstki zapewnia szybką akumulację w obszarze miażdżycowym.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza sterowana mikrofalami w celu szybkiego wykrywania miażdżycy

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Aby ulepszyć serologiczne testy diagnostyczne dla antygenów Mycobacterium tuberculosis, opracowaliśmy superparamagnetyczne nanosondy tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej.

Synteza, charakterystyka i zastosowanie superparamagnetycznych nanosond tlenku żelaza do wykrywania gruźlicy pozapłucnej

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Poznaj syntezę nanocząstek magnetycznych i ich koniugację z sideroforem feroksaminą do wykrywania bakterii. Metoda obejmuje powlekanie krzemionką i funkcjonalizację aminową.

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii (Wideo) | JoVE Journal

Synteza funkcjonalizowanych nanocząstek magnetycznych, ich koniugacja z sideroforem feroksaminą i jej ocena pod kątem wykrywania bakterii

Przeglądaj więcej filmów