Name: Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj nieukierunkowaną analizę metabolomiczną ziarna pszenicy z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Ta metoda umożliwia wykrycie szerszego spektrum metabolitów poprzez zastosowanie trzeciej fazy ruchomej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować programowi stypendialnemu Premiera Australii Zachodniej (Departament Pracy, Turystyki, Nauki i Innowacji, Rząd Australii Zachodniej) oraz Premier's Fellow, profesorowi Simonowi Cookowi (Centre for Digital Agriculture, Curtin University i Murdoch University). Próby terenowe i pobieranie próbek zboża były wspierane przez rządowy program Royalties for Regions Australii Zachodniej. Wyrażamy uznanie dla Grantleya Stainera i Roberta Frencha za ich wkład w badania terenowe. Finansowana przez NCRIS organizacja Bioplatforms Australia jest uznawana za organizację finansującą sprzęt.

<ol><li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li>
<li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype%2C+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+%28Triticum+durum+Desf.%29+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li>
<li>Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li>
<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
<li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li>
<li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li>
<li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li>
<li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
<li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+4.0%3A+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li>
<li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li>
<li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li>
<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metodę nieukierunkowanej metabolomiki opartą na LC-MS do analizy ziarna pszenicy. Metoda łączy cztery tryby akwizycji (odwrócona faza i odwrócona faza podatna na lipidy z jonizacją dodatnią i ujemną) w dwa tryby poprzez wprowadzenie trzeciej fazy ruchomej do odwróconego gradientu fazowego. Połączone podejście pozwoliło uzyskać około 500 biologicznie istotnych cech na polarność jonów, z których około połowa znacznie różni się intensywnością między odmianami pszenicy. Znaczące zmiany w stężeniu ...

Zrozumienie interakcji między genami, środowiskiem i praktykami zarządzania w rolnictwie mogłoby pozwolić na dokładniejsze przewidywanie i zarządzanie wydajnością i jakością produktów. Na metabolity roślinne mają wpływ takie czynniki, jak genom, środowisko (klimat, opady deszczu itp.), a w rolnictwie sposób zarządzania uprawami (tj. stosowanie nawozów, fungicydów itp.). W przeciwieństwie do genomu, na metabolom wpływają wszystkie te czynniki, a zatem dane metabolomiczne dostarczają biochemicznego odcisku palca tych interakcji w określonym czasie. Badanie oparte na metabolomice ma zwykle jeden z dwóch celów: po pierwsze, osiągnięcie głębszego zrozumienia biochemii organizmu i pomoc w wyjaśnieniu mechanizmu odpowiedzi na zaburzenia (stres abiotyczny lub biotyczny) w odniesieniu do fizjologii; a po drugie, powiązanie biomarkerów z badanymi zaburzeniami. W obu przypadkach wynikiem posiadania tej wiedzy jest bardziej precyzyjna strategia zarządzania, aby osiągnąć cel, jakim jest poprawa wielkości i jakości plonów.
Przewiduje się, że metabolom roślinny zawiera tysiące1 małych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych. Obecnie żadne platformy metabolomiczne (głównie spektrometria mas i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) nie są w stanie uchwycić całego metabolomu w jednej analizie. Opracowanie takich technik (przygotowanie próbki, ekstrakcja i analiza metabolitów), które zapewnią jak najdokładniejsze pokrycie metabolomu w ramach jednego cyklu analitycznego, jest kluczowym celem naukowców zajmujących się metabolomiką. Wcześniejsze nieukierunkowane analizy metabolomiczne ziarna pszenicy łączyły dane z wielu separacji chromatograficznych i polaryzacji akwizycji i/lub oprzyrządowania w celu uzyskania większego pokrycia metabolomu. Wymagało to jednak przygotowania i pozyskania próbek oddzielnie dla każdej modalności. Na przykład Beleggia i wsp.2 przygotowali derywatyzowaną próbkę do analizy GC-MS analitów polarnych oprócz analizy GC-MS analitów niepolarnych. Das et al.3 wykorzystali zarówno metody GC, jak i LC-MS, aby poprawić pokrycie w swoich analizach; Podejście to wymagałoby jednak na ogół oddzielnych preparatów próbek, jak opisano powyżej, a także dwóch niezależnych platform analitycznych. Poprzednie analizy ziarna pszenicy przy użyciu GC-MS2,3,4 i LC-MS3,5 platform przyniosło od 50 do 412 (55 zidentyfikowanych) cech dla GC-MS, 409 dla połączonych GC-MS i LC-MS oraz kilka tysięcy dla analizy lipidomicznej LC-MS5. Łącząc co najmniej dwa tryby w jedną analizę, można utrzymać rozszerzony zakres metabolomu, zwiększając bogactwo interpretacji biologicznej, a jednocześnie oferując oszczędność czasu i kosztów.
Aby umożliwić skuteczne rozdzielanie szerokiej gamy gatunków lipidów za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami, nowoczesne metodologie lipidomiczne powszechnie używają dużej ilości izopropanolu w rozpuszczalniku elucyjnym<klasa sup="xref">6, zapewniając łagodność dla klas lipidów, które w przeciwnym razie mogłyby być nierozwiązane przez chromatografię. Aby zapewnić efektywną separację lipidów, początkowa faza ruchoma ma również znacznie wyższy skład organiczny7 niż typowe metody chromatografii z odwróconymi fazami, które uwzględniają inne klasy cząsteczek. Wysoki skład organiczny na początku gradientu sprawia, że metody te są mniej odpowiednie dla wielu innych klas cząsteczek. Przede wszystkim chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami wykorzystuje binarny gradient rozpuszczalnika, zaczynając od głównie składu wodnego i zwiększając zawartość organiczną wraz ze wzrostem siły elucji chromatografii. W tym celu staraliśmy się połączyć te dwa podejścia, aby osiągnąć separację metabolitów zarówno lipidowych, jak i nielipidowych w ramach jednej analizy.
Tutaj prezentujemy metodę chromatograficzną, która wykorzystuje trzecią fazę ruchomą i umożliwia połączenie tradycyjnej metody chromatografii z odwróconą fazą i odpowiednią dla lipidomiki przy użyciu przygotowania pojedynczej próbki i jednej kolumny analitycznej. Przyjęliśmy wiele środków kontroli jakości i etapów filtrowania danych, które zostały wcześniej wdrożone w badaniach metabolomicznych, głównie klinicznych. Podejścia te są przydatne do określania solidnych cech o wysokiej odtwarzalności technicznej i znaczeniu biologicznym oraz wykluczają te, które nie spełniają tych kryteriów. Na przykład opisujemy powtórną analizę zbiorczej próbki QC8, korekta QC9, filtrowanie danych9,10 i imputacja brakujących cech11.

<table><tbody><tr><td>13C6-sorbitol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoantracen</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 ml</td><td>>99.995%</td></tr><tr><td>Analityk TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>wersja 1.7</td></tr><tr><td>Oprogramowanie AnalyzerPro</td><td>SpectralWorks Sp. z o.o.</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych użyte w kroku 7.2. Wersja 5.7</td></tr><tr><td>Sortware AnalyzerPro XD</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych użyte w kroku 7.5. Wersja 1.4</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius. Wagi precyzyjne Sp. z o.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas d6-transcynamonowy</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>99%</td></tr><tr><td>Liofilizator (Freezone 2.5 Plus)</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki Schott (100 mL, 500 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki (2 mL) i zakrętki (wstępnie nacięte)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (fiolki), VSS-SC91191 (pokrywki)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw montażowy do Sciex TripleToF</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>klasa Mieszalnik laboratoryjny</td><td>Waring Model komercyjny</td><td></td><td>HGBTWTS3</td></tr><tr><td>Leucyna-enkefalina</td><td>Wody</td><td>p/n 700008842</td><td>Rozwiązanie tuningowe</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a>Webowy</td><td></td> <td>potok analityczny do wysokoprzepustowej metabolomiki. Darmowe narzędzie internetowe. Wersja 4.0.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS klasy</td></tr><tr><td>mikonazol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka (Eppendorf 5415R)</td><td>Eppendorf (dystrybuowana przez Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>5426 Nr 0021716</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (2 ml)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Oprogramowanie Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View</td><td>Sciex</td><td></td><td>wersja 1.2 (64-bitowa)</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (200 uL, 1000 uL)</td><td>TermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy odkrywania cząsteczek Samll. Wersja 2.3 (64-bitowa)</td></tr><tr><td>Sciex 5600 potrójny spektrometr masowy ToF</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki do lizy z nakrętką śrubową (2 ml) z kulkami ceramicznymi</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan sodu</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Lizer/homogenizator tkankowy</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>Serial 0001620</td></tr><tr><td>Kolby miarowe (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>IKA Works Inc. (dystrybuowany przez Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>Woda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>grade Water's Acquity LC system wyposażony w pompy czwartorzędowe</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 kolumna</td><td>Wody</td><td>p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Zrozumienie interakcji między genami, środowiskiem i zarządzaniem w praktyce rolniczej mogłoby pozwolić na dokładniejsze przewidywanie i zarządzanie wydajnością i jakością produktów. Dane metabolomiczne umożliwiają odczyt tych interakcji w danym momencie i dostarczają informacji o stanie biochemicznym organizmu. Co więcej, poszczególne metabolity lub panele metabolitów mogą być wykorzystywane jako precyzyjne biomarkery do przewidywania i zarządzania plonami i jakością. Przewiduje się, że metabolom roślinny zawiera tysiące małych cząsteczek o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych, które dają możliwość biochemicznego wglądu w cechy fizjologiczne i odkrycia biomarkerów. Aby to wykorzystać, głównym celem badaczy metabolomiki jest uchwycenie jak największej różnorodności fizykochemicznej w ramach jednej analizy. W tym artykule przedstawiamy metodę nieukierunkowanej metabolomiki opartą na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy ziarna pszenicy uprawianego w terenie. Metoda wykorzystuje czwartorzędowy menedżer rozpuszczalnika do chromatografii cieczowej w celu wprowadzenia trzeciej fazy ruchomej i łączy tradycyjny gradient odwróconych faz z gradientem podatnym na działanie lipidów. Szczegółowo opisano procesy przygotowania ziarna, ekstrakcji metabolitów, analizy instrumentalnej i przetwarzania danych. Zaobserwowano dobrą dokładność masy i odtwarzalność sygnału, a metoda pozwoliła uzyskać około 500 biologicznie istotnych cech na tryb jonizacji. Ponadto określono istotnie różniące się sygnały dotyczące cech metabolitów i lipidów między odmianami pszenicy.

Metabolom rośliny jest kształtowany przez kombinację genomu oraz środowiska, a dodatkowo, w warunkach rolniczych, przez system zarządzania uprawami. Wykazaliśmy, że różnice genetyczne między odmianami pszenicy można zaobserwować na poziomie metabolitów; w niniejszej pracy ponad 500 zmierzonych związków wykazało istotnie różne stężenia między odmianami w samych ziarnach. W obu trybach jonizacji, ujemnej i dodatniej, zaobserwowano dobrą dokładność masy (błąd &lt;10 ppm) oraz powtarzalność s...

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Na metabolit mają wpływ takie czynniki, jak genom, środowisko i praktyki zarządzania. Zrozumienie interakcji między tymi czynnikami może pozwolić na dokładniejsze przewidywanie i zarządzanie wydajnością i jakością produktu. Dzięki włączeniu trzeciej fazy ruchomej zamiast tradycyjnych dwóch, technika ta pozwala na oddzielenie i wykrycie szerszego zakresu metabolitów.Metabolomikę można zastosować w każdej dziedzinie biologii. Po pierwsze, aby lepiej zrozumieć biochemię organizmu i pomóc wyjaśnić jego reakcję na stres abiotyczny lub biotyczny w odniesieniu do fizjologii. Po drugie, powiązanie biomarkerów z badanymi zaburzeniami.Ponieważ alkohol izopropylowy jest lepkim rozpuszczalnikiem, należy go wprowadzać przy niskiej szybkości zapłonu i wykorzystać wystarczający czas równowagi przed zwiększeniem składu do 98%Te kroki zapobiegną nadmiernemu ciśnieniu w chromatycznym systemie graficznym, zwracaniu błędu lub potencjalnemu uszkodzeniu kolumny analitycznej. Aby rozpocząć przygotowanie ziaren, użyj blendera laboratoryjnego do zmielenia ziarna. Uruchom blender na wysokich obrotach przez 20 sekund, a następnie powtórz.Wyjmij dzbanek blendera z podstawy. Postukaj w bok dzbanka blendera, aby wydobyć grubo zmielone ziarno na powierzchnię próbki. Grubo zmielone ziarno można wyrzucić lub przechowywać.Przenieś drobno zmielone ziarno z blendera do dwumililitrowej plastikowej mikroprobówki wirówkowej. Tego samego dnia, w którym odbywa się ekstrakcja, należy przygotować rozpuszczalnik ekstrakcyjny, zgodnie z opisem w rękopisie. Następnie zważ 200 miligramów drobno zmielonego ziarna do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Dodaj 500 mikrolitrów rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do ziarna w probówce. Ponadto należy przygotować ślepą próbę, dodając 500 mikrolitrów rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do pustej probówki. Za pomocą homogenizatora ustawionego na 6 500 obr./min mieszaj rozpuszczalnik i ziarno przez 20 sekund.Następnie powtarzaj przez kolejne 20 sekund. Następnie odwiruj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 16, 100 razy G przez pięć minut. Przenieść supernatant do dwumililitrowej plastikowej rurki i zachować osad.Powtórz proces ekstrakcji na peletach dwukrotnie. Połącz trzy supernatanty, uzyskując całkowitą objętość ekstraktu około 1,5 mililitra i wymieszaj przez wirowanie. Aby uzyskać zbiorczą próbkę wszystkich ekstraktów zbożowych, które mają być użyte do kontroli jakości, przenieś 55 mikrolitrów każdego ekstraktu zbożowego do dwumililitrowej probówki i wiruj.Następnie przenieść 50 mikrolitrowych porcji tej połączonej próbki do szklanych fiolek. Przenieść 50-mikrolitrową porcję każdego ekstraktu próbki ziarna do szklanych fiolek. Zgodnie z opisem w rękopisie pisemnym należy przygotować roztwory, które będą potrzebne do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas.W dniu analizy LCMS przygotuj 100 mililitrów 5% acetonitrylu, zawierającego 200 nanogramów na mililitr enkefaliny leucyny. Dodać 950 mikrolitrów tego roztworu do szklanej fiolki zawierającej 50 mikrolitrów porcji ekstraktu zbożowego. Wymieszać zawartość fiolki przez wirowanie.Najpierw skonfiguruj i skalibruj przyrządy zgodnie z opisem w manuskrypcie i podręczniku użytkownika producenta. Następnie należy oczyścić i przepłukać układ fluidyki LC za pomocą rozpuszczalników klasy LCMS, w tym rozpuszczalników do fazy ruchomej i mycia. Zrównoważyć układ LC przy użyciu warunków początkowych metody LC, upewniając się, że ciśnienie w kolumnie się ustabilizowało.Skonfiguruj tabelę sekwencji instrumentów. Wstrzyknąć mrówczan sodu na początku sekwencji próbki, aby sprawdzić kalibrację urządzenia. Najpierw należy przeanalizować ślepe próby rozpuszczalnikowe i preparatywne, następnie zbiorcze próbki kontroli jakości w celu kondycjonowania systemu, a następnie losową listę próbek.Przeprowadzaj kontrolę jakości próbek w regularnych odstępach czasu, w miarę replik technicznych. Uruchom dwie próbki kontroli jakości na końcu sekwencji. Podczas wykonywania sekwencji należy sprawdzić jakość danych, w tym zarówno dokładność masy wzorca wewnętrznego, jak i odtwarzalność sygnału.Aby sprawdzić odtwarzalność sygnału, powinna wystarczyć wizualna kontrola nałożonych widm. W roztworze użytym do przygotowania ekstraktów zbożowych uwzględniono cztery wzorce wewnętrzne. Podczas LCMS zaobserwowano dobrą dokładność masy i pojedynczą odtwarzalność wzorców wewnętrznych zarówno dla dodatnich, jak i ujemnych trybów jonizacji.Na podstawie analizy ślepych prób uznano, że 421 sygnałów w trybie ujemnym i 835 sygnałów w trybie dodatnim to artefakty. Sygnały te były obecne w ślepych próbach z intensywnością równą lub większą niż 5% średniej intensywności pojedynczej w próbkach ziarna. Po usunięciu artefaktów i dalszym filtrowaniu danych, tryb ujemny zwrócił 483 cechy, a tryb pozytywny zwrócił 523 cechy.Około 250 cech było istotnych biologicznie i różniło się znacznie intensywnością w zależności od odmiany pszenicy. Należy pamiętać o środkach kontroli jakości, takich jak włączenie preparatywnych prób ślepych, wzorców wewnętrznych i próbek zbiorczych.

untargeted-liquid-chromatography-mass-spectrometry-based-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

Prezentowany tutaj jest protokół do określania absorpcji, translokacji i dystrybucji imidakloprydu w pszenicy w warunkach hydroponicznych przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS-MS). Wyniki pokazały, że imidaklopryd może być wchłaniany przez pszenicę, a imidaklopryd wykryto zarówno w korzeniach, jak i liściach pszenicy.

Oznaczanie absorpcji, translokacji i dystrybucji imidakloprydu w pszenicy

Przedstawiono metodę analizy metabolomicznej jęczmienia. Metoda obejmuje frakcjonowanie i derywatyzację metabolitów oraz ich analizę za pomocą chromatografii gazowej/spektrometrii mas (GC/MS). Analiza metabolomiczna może być wykorzystana do określenia wpływu międzyplonów i stresu suszy na ziarno.

Analiza metabolomiczna jęczmienia metodą chromatografii gazowej/spektrometrii mas

Ten protokół przedstawia zweryfikowaną metodę chromatografii cieczowej, mobilności jonów i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, do określania obecności alkaloidów sporyszu w żywności, zgodnie z niedawno wydanym rozporządzeniem Komisji (UE) 2023/915.

Wykrywanie regulowanych alkaloidów sporyszu w matrycach spożywczych za pomocą chromatografii cieczowej - spektrometria ruchliwości jonów uwięzionych w elektronice - spektrometria mas czasu przelotu

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji metabolitów ze Staphylococcus aureus i ich późniejszej analizy za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.

Podejście oparte na tandemowej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy metabolitów Staphylococcus aureus

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Poznaj nieukierunkowaną analizę metabolomiczną ziarna pszenicy z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Ta metoda umożliwia wykrycie szerszego spektrum metabolitów poprzez zastosowanie trzeciej fazy ruchomej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów