Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Nasza metodologia jest pierwszą, która zapewnia niezawodne narzędzie eksperymentalne do indukowania przejściowej aktywacji endogennej reaktywnej formy tlenu lub produkcji ROS w tkance in vivo. Nasza metodologia zapewnia solidną, przyjazną dla użytkownika i nieinwazyjną procedurę, która zapewnia stałą produkcję fizjologicznych stymulujących poziomów ROS w skórze, zasadniczo przy użyciu źródła światła czerwonego. Ponieważ fizjologiczna indukcja ROS w skórze osiąga potrzeby pnia tkanki, dalej zastosowaliśmy naszą metodologię terapii regeneracji skóry, w tym dobre gojenie i wzrost włosów.

Biologia i sygnalizacja ROS jest obecnie gorącym kotłem badawczym. Głównym ograniczeniem w badaniu funkcji ROS in vivo jest brak odpowiednich narzędzi do indukowania kontrolowanej endogennej produkcji ROS. Nasza metodologia jest przyjazna dla użytkownika i łatwa, ale wszystkie urządzenia, lampa, kroplówka, IS i tak dalej, muszą być odpowiednio skalibrowane.

Krytyczne prekursory chemiczne muszą być świeże, a wszystkie kroki lub protokół muszą być rygorystycznie przestrzegane. Aby wywołać wzrost włosów na skórze grzbietowej myszy w drugiej fazie telogenu, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania w około 50 dniu po urodzeniu miotu C57 czarnych sześciu myszy, użyj maszynki do golenia i kremu do depilacji, aby usunąć dwa niezależne obszary skóry obok siebie z tyłu każdej myszy. Po kilku minutach usuń krem za pomocą PBS i rejestruj wzrost mieszków włosowych poprzez codzienne pozyskiwanie obrazów w wysokiej rozdzielczości kontrolnych i leczonych obszarów skóry grzbietowej każdego zwierzęcia.

Aby wywołać powstawanie zmian oparzeniowych drugiego stopnia na skórze grzbietowej myszy w drugiej fazie telogenu, usuń sierść z tyłu myszy. Rozgrzej mosiężny pręt o przekroju jednego centymetra do 95 stopni Celsjusza we wrzącej wodzie i przyłóż pręt do środkowej części skóry myszy na pięć sekund. Natychmiast po wytworzeniu oparzeń należy wstrzyknąć zwierzętom dootrzewnowo jeden mililitr roztworu fizjologicznego, aby zapobiec odwodnieniu i umożliwić myszom powrót do zdrowia przez 24 godziny przed przystąpieniem do leczenia.

W celu wytworzenia komórek zatrzymujących znakowanych BrdU lub LRC, należy wstrzykiwać 10 lub 14-dniowym rodzeństwu z miotu dootrzewnowo raz dziennie przez cztery kolejne dni w dawce 50 miligramów na kilogram masy ciała BrdU w PBS. Po fazie znakowania pozwól myszom rozwijać się przez 50 do 60 dni przed zastosowaniem leczenia. Aby wywołać przejściową produkcję nieśmiercionośnych reaktywnych form tlenu lub poziomów ROS w skórze myszy do analizy wzrostu włosów, po uzyskaniu wyjściowego obrazu wzrostu włosów, należy miejscowo nałożyć około 25 miligramów kremu mALA na prawy ogolony obszar skóry i umieścić zwierzę w ciemności na 2,5 godziny.

Pod koniec okresu leczenia fotouczulaczem należy dokładnie usunąć nadmiar kremu za pomocą PBS i potwierdzić produkcję PP9 in situ poprzez ekspresję czerwonej fluorescencji pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim, a następnie naświetlić całą skórę pleców odpowiednim źródłem światła czerwonego o łącznej dawce od 2,5 do 4 dżuli na centymetr kwadratowy. Następnie pozwól myszom dojść do siebie na kocu elektrycznym z monitorowaniem aż do pełnego leżenia przed powrotem zwierząt do klatek. Aby włączyć przejściową produkcję ROS w celu gojenia oparzeń drugiego stopnia, nałóż około 25 miligramów kremu mALA wzdłuż prawej powierzchni oparzenia i około czterech milimetrów sąsiedniej tkanki i umieść zwierzęta w ciemności na 2,5 godziny, jak pokazano.

Po usunięciu kremu należy napromienić całą skórę pleców i pozwolić myszom dojść do siebie przy monitorowaniu, jak pokazano. Aby wywołać przejściową produkcję ROS w skórze ogona, nałóż około 25 miligramów kremu mALA wzdłuż całego obszaru tkanki grzbietowej myszy leczonych BrdU i naświetlaj skórę grzbietową ogona, jak pokazano. Po eutanazji myszy zbierz skórę ogona w celu wykrycia BrdU.

Użyj skalpela, aby zebrać ogon od każdego zwierzęcia, a następnie wykonaj proste podłużne nacięcia i oderwij całą skórę jako pojedynczy kawałek od kręgosłupa. Inkubuj obrane kawałki skóry w pięciu milimolowych EDTA i PBS oraz pięciomililitrowych probówkach przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić ostrożne oddzielenie nienaruszonych arkuszy naskórka od skóry właściwej za pomocą kleszczy. Utrwal oddzielone tkanki w 4% formaldehydzie i PBS przez co najmniej 72 godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie oznacz utrwalone tkanki interesującymi nas fluorescencyjnymi przeciwciałami sprzężonymi przed wizualizacją tkanek za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej zgodnie ze standardowymi protokołami w celu identyfikacji i ilościowego określenia LRC w każdych warunkach eksperymentalnych. W celu oceny ex vivo produkcji ROS, po zebraniu kawałków skóry ogona myszy, jak pokazano, inkubuje się kontrolne tkanki niepoddane działaniu substancji oraz pięć milimolowych EDTA i PBS samych oraz próbki poddane działaniu substancji fotodynamicznej w EDTA uzupełnione dwoma milimolowymi mALA. Następnie dodać hydroetydynę do końcowego stężenia 3,2 mikromola do każdego zestawu tkanek i inkubować wszystkie próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Pod koniec inkubacji opuszkami palców rozciągnij próbki skóry ogona na szklanej powierzchni i naświetl leczone tkanki czerwonym światłem o długości 636 nanometrów z płynnością 10 dżuli na centymetr kwadratowy. Pod koniec zabiegu należy natychmiast oddzielić naskórek od skóry właściwej i utrwalić arkusze naskórka w 4% formaldehydzie i PBS przez co najmniej 72 godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec fiksacji oceń emisję czerwonego 2-hydroksyyetidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu zielonego światła wzbudzającego, aby umożliwić uzyskanie obrazów wysokiej jakości.

W celu wykrycia in vivo produkcji ROS w skórze grzbietowej, zaraz po napromieniowaniu światłem czerwonym, należy zastosować 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr DH-FDA i 50% etanolu na wszystkie docelowe kontrolne i leczone obszary skóry. Miejscowe podawanie prekursora mALA na skórę grzbietu i ogona myszy powoduje znaczną akumulację protoporfiryny IX w całej tkance i zauważalnie w mieszku włosowym, o czym świadczy czerwonawo-różowa fluorescencja tego związku pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim. Późniejsze naświetlanie leczonej tkanki światłem czerwonym sprzyja przejściowemu wytwarzaniu ROS w tkance, szczególnie w obszarze wybrzuszenia mieszka włosowego.

Włączenie nieśmiertelnej produkcji ROS w skórze myszy in vivo sprzyja znacznemu wzrostowi liczby LRC w obszarze wybrzuszenia mieszka włosowego dwa dni po leczeniu fotodynamicznym. Warto zauważyć, że wzrost liczby LRC jest przejściowy i powraca do normalnego poziomu sześć dni po leczeniu. Przejściowa produkcja ROS przyspiesza gojenie się skóry po oparzeniu drugiego stopnia.

Kwantyfikacja stopniowego zmniejszania się uszkodzonej skóry wskazuje na solidność i znaczenie statystyczne tkanki przyspieszającej proces gojenia się ran. Podobnie, nieśmiertelne poziomy ROS silnie promują wzrost włosów po goleniu podczas drugiego skoordynowanego telogenu, fazy, podczas której mieszek włosowy jest oporny na reagowanie na bodźce wzrostu. Ponadto produkcja ROS po zabiegach fotograficznych jest również znacznie zmniejszona dzięki zastosowaniu związków przeciwutleniających.

Wytwarzanie PP IX in situ przez ekspresję czerwonej fluorescencji pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim musi być dokładnie potwierdzone. Aby wywołać produkcję ROS, należy prawidłowo ustalić natężenie promieniowania źródła światła czerwonego. w porównaniu z tkanką i całkowitą dawką światła.

Po indukcji ROS można wykorzystać obecne techniki biochemiczne oraz biologii komórkowej i molekularnej do analizy pobranych próbek i oceny dynamicznej odpowiedzi fizjologicznej tkanki. Nasza metodologia zapewnia potężne narzędzie do badania fizjologicznego wpływu przejściowej produkcji endogennych ROS w tkance in vivo. Jest to nowe podejście eksperymentalne, które może być bardzo przydatne dla badaczy zajmujących się sygnalizacją ROS.