Name: Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę indukcji reaktywnych form tlenu w skórze myszy przy użyciu światła czerwonego i protoporfiryny IX. Technika stymuluje regenerację tkanek, gojenie ran i wzrost włosów u myszy C57BL/6.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantami od Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 dla JE) i Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 dla JE) z Hiszpanii. Komisja Europejska otrzymała wsparcie w ramach grantu Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid i UAM).

Wszystkie procedury hodowli i eksperymentów na myszach muszą być prowadzone zgodnie z lokalnymi, krajowymi, międzynarodowymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
1. Indukcja wzrostu włosów, indukcja oparzeń i identyfikacja długotrwałych BRDU LRC w nabłonku skóry ogona
UWAGA: Do opisanych poniżej eksperymentów używaj 10-dniowych lub 7-tygodniowych myszy C57BL/6, najlepiej rodzeństwa z miotu. We wszystkich procedurach eksperymentalnych zwierzęta będą znieczulane przez inhalację 3% izofluranu lub uśpione przez zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie ze wskazaniami.
<ol>
	<li>Indukcja wzrostu włosów na skórze pleców myszy w drugiej fazie telogenu (spoczynku) (około 50 dnia po porodzie)
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy inhalacją 3% izofluranu. Potwierdź pełne znieczulenie głębokie poprzez brak odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca). Ogol dwa niezależne obszary skóry pleców u każdej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i kremu do depilacji (tabela materiałów). Użyj lewej strony do kontroli, a prawej strony do leczenia. 
		UWAGA: Sprawdź, czy po goleniu skóra pleców jest różowawa, a nie szara/, co jest wskaźnikiem melanogenezy i wejścia w fazę anagenu (wzrostu) u tego szczepu myszy.</li>
		<li>Dokładnie przemyć PBS w celu usunięcia wszystkich resztek kremu i przystąpić do indukcji przejściowego wytwarzania in situ nieśmiertelnych poziomów ROS, jak opisano w sekcji 2.1.</li>
		<li>Rejestruj wzrost mieszków włosowych poprzez codzienne pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości kontrolnych i leczonych obszarów skóry pleców u każdego zwierzęcia (np. za pomocą kamery HD sprzężonej z soczewką lornetkową 5−20x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja zmian oparzeniowych 2 stopnia na skórze pleców myszy w drugiej fazie telogenu (spoczynku) (około 50 dnia po porodzie)
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy. Ogol cały obszar skóry pleców każdej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów i kremu do depilacji, a następnie dokładnie umyj PBS, aby usunąć wszystkie resztki kremu. 
		UWAGA: Podać in situ podskórne zastrzyki lidokainy 0,5% (2 mg/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, nie przekraczając 7 mg/ml, tuż przed zabiegiem spalania.</li>
		<li>Rozgrzej mosiężny pręt (o przekroju 1 cm) w temperaturze 95 °C, zanurzając go we wrzącej wodzie, a następnie nałóż na środkową część grzbietowej powierzchni skóry każdej myszy przez 5 sekund.</li>
		<li>Tuż po wytworzeniu oparzeń należy wstrzyknąć zwierzętom dootrzewnowo 1 ml roztworu fizjologicznego (0,9% NaCl) na koc elektryczny, aby zapobiec odwodnieniu. Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez 24 godziny i przystąp do indukcji przejściowego wytwarzania in situ nieśmiertelnych poziomów ROS, jak opisano w sekcji 2.3.</li>
		<li>Rejestruj postęp rany oparzeniowej poprzez codzienne pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości kontrolnych i leczonych obszarów skóry pleców u każdego zwierzęcia (np. za pomocą kamery HD sprzężonej z soczewką lornetkową 5-20x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie i identyfikacja długoterminowych BRDU LRC w nabłonku skóry ogona
	<ol>
		<li>Wstrzykuje się 10/14-dniowe rodzeństwo z miotu dootrzewnowo (bez znieczulenia) raz dziennie przez 4 kolejne dni z 50 mg/kg masy ciała BrdU rozpuszczonym w PBS. Po fazie znakowania pozwól myszom rosnąć przez 50-60 dni przed jakimkolwiek zabiegiem. 
		UWAGA: Do każdego wstrzyknięcia należy używać świeżej igły. </li>
		<li>Postępować zgodnie z opisem w sekcji 2.3 w celu indukcji przejściowej nieśmiertelnej produkcji ROS in situ w skórze ogona w różnym czasie przed przygotowaniem całych mas tkankowych.</li>
		<li>Aby przygotować całe wierzchy naskórka ogona, należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i przyciąć ogony nożyczkami chirurgicznymi.
		<ol>
			<li>Użyj skalpela, aby wykonać proste podłużne nacięcie wzdłuż ogona i oderwać całą skórę jako pojedynczy kawałek od kręgosłupa. Inkubować obraną skórę w 5 mM EDTA w PBS w probówkach o pojemności 5 ml przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i ostrożnie oddzielić nienaruszone arkusze naskórka od skóry właściwej za pomocą kleszczy.</li>
			<li>Utrwalić tkankę w 4% formaldehydzie w PBS przez co najmniej 72 godziny w temperaturze pokojowej (RT) i przystąpić do wykrywania BrdU przy użyciu odpowiednich przeciwciał.</li>
			<li>Użyj mikroskopii fluorescencyjnej/konfokalnej, aby zidentyfikować i określić ilościowo LRC w każdym stanie eksperymentalnym, w tym w kontroli światła i zabiegach fotodynamicznych w różnym czasie przed przygotowaniem całych mas tkankowych, jak opisano wcześniej szczegółowo19,20. 
			UWAGA: Utrwalone arkusze naskórka mogą być przechowywane w PBS zawierającym 0,02% azydku sodu w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy. Utrwalone arkusze naskórka mogą być stosowane do immunolokalizacji wymaganych białek zgodnie ze standardowymi procedurami wycinków histologicznych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja przejściowej produkcji nieśmiertelnych poziomów ROS w skórze myszy
UWAGA: Aby wywołać przejściowe wytwarzanie nieśmiertelnych poziomów ROS w skórze myszy, zostanie zastosowana terapia fotodynamiczna z użyciem prekursora endogennego fotosensybilizatora PpIX, w tym przypadku metyloaminolewulinianu (mALA) i światła czerwonego.
<ol>
	<li>Aby włączyć przejściową produkcję ROS w celu indukcji wzrostu włosów w skórze grzbietu, należy przygotować zwierzęta zgodnie z zaleceniami w sekcji 1.1.
	<ol>
		<li>Nałóż ~25 mg mALA w postaci kremu do stosowania miejscowego (tabela materiałów) na prawą okolicę, pozostawiając lewą stronę jako kontrolę wewnętrzną, unikając różnic międzyosobniczych. Inkubować przez 2,5 godziny w ciemności, nadmiar śmietany dokładnie zmyć PBS. Aby potwierdzić głębokość znieczulenia, monitoruj zwierzęta co 10 minut, aż do całkowitego odzyskania sprawności. 
		UWAGA: Wytwarzanie PpIX w skórze pleców powinno być testowane in situ poprzez jego czerwoną fluorescencję pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim (407 nm).</li>
		<li>Znieczulij zwierzęta.</li>
		<li>Naświetlić całą skórę pleców odpowiednim źródłem światła czerwonego (tabela materiałów) w całkowitej dawce 2,5−4 J/cm2. Trzymaj myszy na kocu elektrycznym do czasu ich całkowitego wyzdrowienia i postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.1.3. 
		UWAGA: Natężenie promieniowania należy regulować, manipulując odległością między źródłem światła a tkanką i mierzyć za pomocą miernika energii (Tabela materiałów). Eksperyment uważa się za zakończony, gdy zaobserwuje się pełny wzrost włosów w którymkolwiek z niezależnych ogolonych obszarów każdego zwierzęcia. Cała procedura obejmuje tylko jeden zabieg fotograficzny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby włączyć przejściową produkcję ROS w celu poprawy gojenia się zmian po oparzeniach 2. stopnia, należy przygotować zwierzęta zgodnie z zaleceniami w punkcie 1.2.
	<ol>
		<li>Nałóż ~25 mg mALA w postaci kremu do stosowania miejscowego wzdłuż spalonej powierzchni, obejmując około 4 mm sąsiedniej tkanki. Inkubować przez 2,5 godziny w ciemności, nadmiar kremu dokładnie zmyć PBS. Aby potwierdzić głębokość znieczulenia, monitoruj zwierzęta co 10 minut, aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
		<li>Znieczulij zwierzęta.</li>
		<li>Naświetlić całą skórę pleców odpowiednim źródłem światła czerwonego o łącznej dawce 2,5−4 J/cm2. Trzymaj myszy na kocu elektrycznym do czasu ich całkowitego wyzdrowienia i postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.2.4. 
		UWAGA: Procedurę doświadczalną dla każdego zwierzęcia uważa się za zakończoną, gdy zaobserwuje się pełne gojenie oparzeń. Cała procedura obejmuje tylko jeden zabieg fotograficzny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby włączyć przejściową produkcję ROS w skórze ogona, należy przygotować myszy, jak wskazano w punkcie 1.3, zastosować ~25 mg mALA w postaci miejscowego kremu wzdłuż całego obszaru tkanki grzbietowej i postępować zgodnie z opisem w punkcie 2.1 dla skóry pleców. Wykonaj zabiegi fotograficzne i odpowiednią kontrolę światła 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny przed eutanazją zwierząt i dalszym usuwaniem skóry ogona całych wierzchowców. 
	UWAGA: We wszystkich projektach eksperymentalnych należy oznaczyć zależność procesu od ROS przy użyciu przeciwutleniających zmiataczy ROS (np. codzienne inokulowanie 100 mg/kg masy ciała N-acetylo-cysteiny przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu 20 mg/ml w PBS, pH 7,2, rozpoczynając 5 dni przed leczeniem mALA lub, alternatywnie, dwie dawki 100 mg/ml kwasu askorbinowego w 50% etanolu, w odstępie 30 minut, stosowany miejscowo na skórę w odstępie czasu między zabiegami mALA a naświetlaniem światłem czerwonym).</li>
</ol>
3. Wykrywanie ROS w skórze
<ol>
	<li>Ocena ex vivo produkcji ROS w skórze ogona po zabiegu fotodynamicznym z użyciem hydroetydyny 
	UWAGA: Hydroetydyna jest cząsteczką niefluorescencyjną, która reaguje specyficznie z ROS, wytwarzając barwnik fluorescencyjny 2-hydroksyyetyd (hET).
	<ol>
		<li>Inkubować całe skóry ogona, otrzymane w sposób opisany w sekcji 1.3.3, przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w 5 mM EDTA w roztworze PBS (próbki kontrolne) lub dodatkowo zawierające 2 mM mALA (próbki poddane działaniu substancji fotodynamicznej).</li>
		<li>We wszystkich przypadkach dodać hydroetydynę do końcowego stężenia 3,2 μM z 25 mg/ml zapasu dimetylosulfotlenku (DMSO) i inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozciągnąć próbki skóry ogona na szklanej powierzchni za pomocą opuszków palców i naświetlić czerwonym światłem o długości fali 636 nm o płynności 10 J/cm2.</li>
		<li>Natychmiast należy przystąpić do oddzielania naskórka od skóry właściwej i mocowania arkuszy naskórka zgodnie z opisem w punkcie 1.3.3.</li>
		<li>Oceń emisję czerwieni hET pod mikroskopem fluorescencyjnym/konfokalnym przy użyciu zielonego światła wzbudzającego, uchwyć wysokiej jakości obrazy i przystąp do dalszej analizy. 
		UWAGA: Barwienie hET próbek tkanek należy stosować przy braku obróbki fotodynamicznej jako kontrolę ujemną autooksydacji hET.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie in vivo produkcji ROS w skórze pleców po indukcji wzrostu włosów i gojeniu oparzeń, a następnie leczeniu fotodynamicznym 
	UWAGA: Ten etap jest wykonywany przy użyciu dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DHF-DA), niefluorescencyjnego związku przenikającego komórkę, który po rozszczepieniu przez wewnątrzkomórkowe enzymy esterazy specyficznie reaguje z ROS, dając barwnik fluorescencyjny 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCF).
	<ol>
		<li>Należy wykorzystać zwierzęta przygotowane do indukcji wzrostu włosów (punkt 1.1) lub gojenia oparzeń (punkt 1.2). Tuż przed miejscowym zastosowaniem kremu mALA (patrz punkty 2.1 i 2.2) należy dozować miejscowo 100 μl 1 mg/ml w 50% etanolu DHF-DA na wszystkie docelowe kontrolne/leczone obszary skóry, pozwolić skórze w pełni wchłonąć materiał i przystąpić do miejscowego stosowania kremu mALA.</li>
		<li>Inkubuj leczone zwierzęta przez 4 godziny w ciemności, dokładnie zmyj miejscowy krem mALA ze skóry za pomocą PBS i dozuj drugą dawkę 100 μl roztworu DHF-DA na skórę. Aby potwierdzić głębokość znieczulenia, monitoruj zwierzęta co 10 minut, aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
		<li>Inkubować leczone zwierzęta przez 50 minut w ciemności, znieczulić i naświetlić całą skórę pleców z płynnością w zakresie od 2,5 do 4 J/cm2 światła czerwonego o długości fali 636 nm za pomocą lampy LED.</li>
		<li>Bezpośrednio po napromienianiu należy ocenić poziomy ROS generowane w skórze za pomocą systemu obrazowania in vivo (tabela materiałów). Ustaw skrzynkę filtra na wzbudzenie 445−490 nm i emisję 515−575 nm, uchwyć wysokiej jakości obrazy i przystąp do dalszej analizy. 
		UWAGA: Barwienie DHF-DA próbek tkanek należy stosować przy braku obróbki fotodynamicznej jako kontrolę ujemną dla autooksydacji DHF-DA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
<li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+Destroyers+or+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li>
<li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+from+health+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Medical+Weekly%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659(2012).</li>
<li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-radical+damage+theory%3A+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li>
<li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li>
<li>Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases%3A+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
<li>Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+A+radical+role+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+Passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((production+and+NF-%CE%BAB+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li>
<li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8(2013).</li>
<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
<li>Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109(2016).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li>
</ol>

Wszystkie komercyjne zastosowania procedur opisanych w tej pracy są chronione patentem CSIC-UAM (EP2932967A1) autorstwa EC, MIC i JE i licencjonowanym przez Derma Innovate SL do komercyjnego wykorzystania. JE i JJM zajmują stanowisko doradcze w Derma Innovate SL.

W tym miejscu przedstawiamy metodologię, która pozwala na przejściową aktywację endogennej produkcji ROS in vivo w skórze myszy z efektami fizjologicznymi. Metodologia opiera się na procedurze fotodynamicznej mającej na celu wywołanie kontrolowanej i miejscowej stymulacji endogennego fotouczulacza PpIX (ryc. 1B). To eksperymentalne podejście jest interesującym narzędziem do badania biologii ROS w systemach eksperymentalnych in vivo, stanowiąc znaczący postęp w stosunku do metodologii wykorzy...

Reaktywne formy tlenu (ROS) są wynikiem chemicznej redukcji tlenu cząsteczkowego do postaci wody i obejmują tlen singletowy, anion ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru i rodnik hydroksylowy1,2,3. ROS mają bardzo krótką żywotność ze względu na ich niezwykle reaktywny chemicznie charakter. W organizmach tlenowych ROS powstają przypadkowo wewnątrz komórek jako główny nieszczelny produkt uboczny oddychania tlenowego (łańcuch transportu elektronów) w mitochondriach. Przejściowa akumulacja wysokiego poziomu ROS w komórce powoduje stan stresu oksydacyjnego, który może wywołać nieodwracalną inaktywację białek, lipidów i cukrów oraz wprowadzenie mutacji w cząsteczce DNA2,3,4,5. Stopniowa akumulacja uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach, tkankach i całych organizmach stale wzrasta z czasem i jest związana z indukcją programów śmierci komórkowej, kilkoma patologiami i procesem starzenia2,3,4,6.
Organizmy tlenowe stale rozwijają skuteczne mechanizmy molekularne, aby poradzić sobie z nadmiernym gromadzeniem ROS w komórkach i tkankach. Mechanizmy te obejmują członków rodziny białek dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), które katalizują dysmutację rodników ponadtlenkowych na tlen cząsteczkowy i nadtlenek wodoru, a także różne katalazy i peroksydazy, które wykorzystują pulę przeciwutleniaczy (glutation, NADPH, peroksyredoksyna, tioredoksyna7,8) w celu katalizowania późniejszej konwersji nadtlenku wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego.
Jednak kilka raportów potwierdza rolę ROS jako kluczowych składników obwodów molekularnych, które regulują krytyczne funkcje komórki, w tym proliferację, różnicowanie i mobilność2,3,4. Koncepcja ta jest dodatkowo wspierana przez wstępną identyfikację i charakterystykę dedykowanych mechanizmów wytwarzania RFT w organizmach tlenowych, w tym lipooksygenaz, cyklooksygenaz i oksydaz NADPH9,10. W tym sensie ROS odgrywają aktywną rolę podczas rozwoju zarodków kręgowców11,12,13 a kluczowe role tych cząsteczek w regulacji specyficznych funkcji fizjologicznych in vivo zostały zgłoszone w różnych systemach eksperymentalnych, w tym w programie różnicowania komórek progenitorowych hematopoetycznych u Drosophila14, indukcja uzdrawiania u danio pręgowanego, czyli regeneracja ogona u kijanek Xenopus15. U ssaków ROS były zaangażowane w potencjał samoodnawiania/różnicowania nerwowych komórek macierzystych w modelu neurosfery16 oraz w deregulację funkcji jelitowych komórek macierzystych podczas inicjacji raka jelita grubego17. W skórze sygnalizacja ROS jest związana z różnicowaniem naskórka i regulacją niszy komórek macierzystych skóry oraz cyklu wzrostu mieszków włosowych18,19.
Z tej perspektywy, głównym ograniczeniem eksperymentalnym pozwalającym określić fizjologiczne role ROS w systemach biologicznych, zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych, jest brak odpowiednich narzędzi eksperymentalnych do indukowania kontrolowanej produkcji tych cząsteczek w komórkach i tkankach, dokładnie odwzorowujących ich fizjologiczną produkcję jako drugich przekaźników sygnałowych. Obecnie większość podejść eksperymentalnych polega na podawaniu egzogennych RFT, głównie w postaci nadtlenku wodoru. Niedawno wdrożyliśmy eksperymentalne podejście polegające na włączeniu przejściowej, nieśmiertelnej produkcji endogennych ROS in vivo w skórze myszy, w oparciu o podanie prekursorów endogennego fotouczulacza protoporfiryny IX (PpIX; np. kwasu aminolaevulinowego lub jego pochodnej metyloaminolewulinianu) i dalszego naświetlania próbki światłem czerwonym w celu wywołania tworzenia in situ ROS z wewnątrzkomórkowego tlenu cząsteczkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ta procedura fotodynamiczna może być skutecznie wykorzystana do stymulacji rezydentnych nisz komórek macierzystych, aktywując w ten sposób programy regeneracyjne klasy tissue19,20 i otwierając drogę dla nowych modalności terapeutycznych w medycynie regeneracyjnej skóry. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy opis protokołu, pokazujący reprezentatywne przykłady stymulacji nisz komórek macierzystych, mierzonej jako wzrost liczby długoterminowych komórek zatrzymujących znacznik 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) (LRC) w obszarze wybrzuszenia mieszka włosowego19,21, a następnie aktywacja programów regeneracyjnych (przyspieszenie procesów wzrostu włosów i gojenia oparzeń) wywołana przez stan przejściowy, nieśmiertelna produkcja ROS w skórze szczepu myszy C57Bl6.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-dichlorofluorescin dioctan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deoksyjuryna</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anty-bromodeoksyurydyna-fluoresceina</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji (np. Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania in vivo, np. IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA w postaci kremu do stosowania miejscowego, np. METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Miernik energii Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power (np. ThorLabs Model PM100D)</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła czerwonego, np. 636 nm Lampa LED Aktilite</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny ix

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Tutaj opisujemy protokół indukcji przełączanej fotogeneracji in vivo endogennych reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze myszy. Ta przejściowa produkcja ROS in situ skutecznie aktywuje proliferację komórek w niszach komórek macierzystych i stymuluje regenerację tkanek, co silnie przejawia się poprzez przyspieszenie procesów gojenia się oparzeń i wzrostu mieszków włosowych. Protokół opiera się na regulowanym leczeniu fotodynamicznym, które traktuje tkankę prekursorami endogennego fotouczulacza protoporfiryny IX i dalej naświetla tkankę światłem czerwonym przy ściśle kontrolowanych parametrach fizykochemicznych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi interesujące narzędzie eksperymentalne do analizy biologii ROS.

Miejscowe podanie prekursora mALA w skórę grzbietu i ogona myszy prowadzi do znacznej akumulacji PpIX w całej tkance, a w szczególności w mieszku włosowym, co potwierdza czerwono-różowa fluorescencja tego związku pod wpływem wzbudzenia światłem niebieskim (407 nm) (Rysunek 2A,C). Następne napromieniowanie potraktowanej tkanki światłem czerwonym (636 nm) przy gęstości energii 2,5−4 J/cm2 indukuje przejściową produkcję ROS w tkance, zwłaszcza w obszarze wypukłości (...

Celem tego protokołu jest wywołanie przejściowej produkcji in vivo nieśmiertelnych poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze myszy, co dodatkowo promuje reakcje fizjologiczne w tkance.

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Nasza metodologia jest pierwszą, która zapewnia niezawodne narzędzie eksperymentalne do indukowania przejściowej aktywacji endogennej reaktywnej formy tlenu lub produkcji ROS w tkance in vivo. Nasza metodologia zapewnia solidną, przyjazną dla użytkownika i nieinwazyjną procedurę, która zapewnia stałą produkcję fizjologicznych stymulujących poziomów ROS w skórze, zasadniczo przy użyciu źródła światła czerwonego. Ponieważ fizjologiczna indukcja ROS w skórze osiąga potrzeby pnia tkanki, dalej zastosowaliśmy naszą metodologię terapii regeneracji skóry, w tym dobre gojenie i wzrost włosów.Biologia i sygnalizacja ROS jest obecnie gorącym kotłem badawczym. Głównym ograniczeniem w badaniu funkcji ROS in vivo jest brak odpowiednich narzędzi do indukowania kontrolowanej endogennej produkcji ROS. Nasza metodologia jest przyjazna dla użytkownika i łatwa, ale wszystkie urządzenia, lampa, kroplówka, IS i tak dalej, muszą być odpowiednio skalibrowane.Krytyczne prekursory chemiczne muszą być świeże, a wszystkie kroki lub protokół muszą być rygorystycznie przestrzegane. Aby wywołać wzrost włosów na skórze grzbietowej myszy w drugiej fazie telogenu, po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowan

stimulation-stem-cell-niches-tissue-regeneration-mouse-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Ta metoda bada, jak senny fibroblast skóry wpływa na zdrowe. Starzenie jest indukowane poprzez ekspozycję na UVB, a uodparniony medium jest stosowany na normalne fibroblasty. Pomaga to ocenić aktywne biologicznie związki, które mają na celu zmienioną komunikację między komórkami w starzeniu się skóry.

Nowela połączenia przeciwutleniaczy do przywrócenia zdrowej komunikacji międzykomórkowej w modelu in vitro przy użyciu pożywki warunkowej z komórek starzejących się

Poznaj metodę indukcji reaktywnych form tlenu w skórze myszy przy użyciu światła czerwonego i protoporfiryny IX. Technika stymuluje regenerację tkanek, gojenie ran i wzrost włosów u myszy C57BL/6.

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX (Wideo) | JoVE Journal

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Przeglądaj więcej filmów