Zweryfikowany panel LC-MS/MS do ilościowego określenia 11 leków opornych na gruźlicę w małych próbkach włosów
19 maja 2020
Obecne metody analizy przestrzegania przez pacjentów złożonych schematów leczenia gruźlicy opornej na leki (DR-TB) mogą być niedokładne i wymagające dużych zasobów. Nasza metoda analizuje włosy, łatwo zbieralną i przechowywaną matrycę, pod kątem stężeń 11 leków DR-TB. Dzięki LC-MS/MS możemy określić poziomy leków poniżej nanogramów, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia przestrzegania leków.
Przestrzeganie przez pacjentów jest bardzo trudne, a metabolizm leków może się różnić indywidualnie, dlatego obiektywne pomiary poziomu leków mogą okazać się istotne dla zapobiegania powstawaniu oporności podczas leczenia gruźlicy. Gdyby przestrzeganie można było dokładniej i łatwiej zmierzyć, pracownicy służby zdrowia mogliby opracować plan leczenia, który ograniczyłby rozwój oporności na leki. Opracowaliśmy pierwszy panel spektrometrii masowej wielokrotnej analizy dla wielu leków na gruźlicę w małych próbkach włosów w jednym teście.
Nasz panel wielolekowy wymaga jedynie jednej próbki dwóch miligramów na pacjenta i nie stosuje ani procesu ekstrakcji w fazie stałej, ani filtracji, aby zapobiec utracie objętości próbki. Obiektywne pomiary narażenia na leki mierzone na wczesnym etapie leczenia mogą potencjalnie ostrzegać klinicystów o problemach związanych z poszczególnymi lekami w programie leczenia. Próbki włosów muszą zostać rozdrobnione w dniu analizy, aby uzyskać dokładny pomiar stężenia leku.
Aby pobrać próbki włosów, po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody przygotuj materiały, w tym cienką etykietę, dwie etykiety dla graczy, nożyczki, rozłożoną folię aluminiową, chusteczkę alkoholową i plastikową torbę. Wytrzyj ostrza nożyczek chusteczką alkoholową. Podnieś tył głowy i podnieś górną część włosów spinką, jeśli chcesz.
Zbierz 30 pasm włosów z tyłu głowy i odizoluj strzechę ręką. Weź nożyczki do skóry głowy i obetnij kępę włosów. Ostrożnie umieść kępę włosów na folii aluminiowej.
Przyklej cienką metkę na dalszy koniec strzechy z włosów, przyklejając ją mocno do folii aluminiowej. Dalszy koniec to strona najdalsza od skóry głowy. Nawiąż kawałek folii aluminiowej na strzechę z włosów i przyklej etykietę uczestnika na folię.
Włóż złożony kawałek folii aluminiowej do plastikowej torby i przyklej kolejną etykietę uczestnika na wierzch torby. Do ekstrakcji leku z próbek włosów odważ po dwa miligramy każdej próbki włosów w indywidualnie oznaczonych tubkach z koralikami oraz po dwa miligramy próbki z czystą do każdej z 16 dodatkowych probówek z koralikami. Po ważeniu wszystkie rurki kulkowe umieść w homogenizatorze do młyna koralikowego i homogenizuj próbki z prędkością 6,95 metra na sekundę przez dwa cykle po 30 sekund z 15-sekundowym okresem odpoczynku między cyklami.
Po drugiej homogenizacji należy dodać 500 mikrolitrów odpowiedniej wewnętrznej mieszanki standardowej do każdej próbki i 500 mikrolitrów metanolu do rurki matrycy. Złóż do rurek krzywej kalibracyjnej odpowiednią objętość referencyjnej mieszanki zgodnie z tabelą i umieść wszystkie rurki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni, delikatnie potrząsając przez dwie godziny. Po zakończeniu inkubacji przelej supernatant z każdej probówki kulkowej do nowych oznaczonych mikrowirówek i dodaj 500 mikrolitrów metanolu do rurek kulkowych.
Przeplot rurki kulkowe i przelej płukanie metanolem do odpowiednich rurek mikrowirówki. Wiruj próbki i ostrożnie przelej supernatanty do nowych probówek, nie zakłócając osadów włosowych. Odparuj ciecz w probówkach do wyschnięcia w temperaturze 32 stopni Celsjusza i odtworz próbki za pomocą 200 mikrolitrów wody o wysokiej temperaturze cieczowej z kwasem modrowkowym o stężeniu 1%.
Po wirowaniu przenieś próbki cieczy do bursztynowych fiolek z wkładkami o pojemności 250 mikrolitrów. W tandemowej spektrometrii masowej w chromatografii cieczowej najpierw zainstaluj kolumnę o średnicy od 2 do 100 milimetrów o rozmiarze cząstek 2,5 mikrometra i porach angstremu 100 z poleminowo-eterowymi kulkami fenolowymi w pełni wykonanymi z porowatej krzemionki w komorze kolumny. Upewnij się, że kolumna ma też zamontowany wkład ochronny zalecany przez producenta.
Skopiuj i wklej informacje złożone zawarte w przejściach metod MDR-TB LCMS. pliku CSV w oknie spektrometrium mas. W arkuszu kalkulacyjnym stwórz sekwencję wsadową krzywej kalibracyjnej, kontroli jakości, próbek pacjentów, krzywej kalibracyjnej, kontroli jakości, próbek pacjentów, krzywej kalibracyjnej oraz kontroli jakości.
Dodaj iniekcje do rozpuszczalnika na początku i końcu cyklu oraz przed i po krzywej kalibracyjnej, kontroli jakości oraz próbek pacjentów. Następnie należy umieścić co najmniej osiem iniekcji pustych rozpuszczalników w zastrzykach na krzywej kalibracyjnej oraz fiolce o wysokiej jakości kontroli, aby zmniejszyć ilość przejścia analitu. Gdy partie się zakończą, otwórz oprogramowanie do ilości.
Przewiń przejścia, aby upewnić się, że automatycznie wybrany czas retencji jest dokładny i sprawdź, czy wygładzanie Gaussa jest ustawione na 1,5. Następnie kliknięcie wyświetla krzywą kalibracji i regresję, a typ oczekiwania ustawiam na jeden przez x. Kliknij OK i zweryfikowaj krzywą kalibracyjną oraz próbki kontroli jakości, aby upewnić się, że partia przebiegła pomyślnie.
Dla każdego analizowanego kwantyfikatora referencyjnego co najmniej dwie trzecie punktów kalibracyjnych musi mieć dokładność w zakresie 80-120%. Sprawdź, czy wartość R wyświetlana powyżej krzywej kalibracyjnej jest większa niż 0,975. Jeśli spełnione są wszystkie powyższe warunki, partia została przeszła i próbki można ilościowo zidentyfikować. Kliknij Edytuj w pasku narzędzi i kliknij Skopiuj całą tabelę.
Następnie wklej tabelę do arkusza kalkulacyjnego i użyj średniej obliczonej koncentracji z dwóch zastrzyków próbek, aby określić zgłoszone stężenie każdej próbki. Tutaj pokazano ilustrację chromatogramu z potwierdzonymi poziomami wszystkich 11 testowanych leków opornych na gruźlicę. Na tych rysunkach można zaobserwować wyodrębnione chromatogramy jonowe dla jednego konkretnego leku w jednym z kalibratorów.
Przejścia kwantyfikatora i kwalifikatora służą do jakościowego potwierdzenia obecności leku, ponieważ stosunek między powierzchnią kwantyfikatora a obszarem kwalifikatora pozostaje stały w różnych próbkach. Wewnętrzny standard jest również monitorowany, aby zapewnić, że każda próbka wstrzyknięta jest normalizowana. W tej analizie oceniono wygodną próbkę 15 próbek włosów spośród całkowitej populacji 96 pacjentów przyjmujących leki oporne na gruźlicę w warunkach bezpośrednio obserwowanych w warunkach terapii zachodniej w Południowej Afryce, aby określić reprezentatywne poziomy leków opornych na gruźlicę w najniższych i najwyższych poziomach dla każdego analitu.
W przypadku braku procesu ekstrakcji w fazie stałej lub filtracji, należy zachować ostrożność podczas przenoszenia supernatantu do rur parowania. Wszystko, co zostanie przeniesione do rurek, może zostać wstrzyknięte do kolumny. Ponieważ wirnik bead raptora może odlecieć, jeśli nie jest mocno przykręcony lub zablokowany, koniecznie sprawdź rotor przed rozpoczęciem operacji.
W przeciwieństwie do leków przeciwretrowirusowych w dziedzinie HIV, związek między farmakokinetyką leków na gruźlicę, jej przestrzeganiem a wynikami klinicznymi pozostaje w dużej mierze niezbadany. Postawiliśmy hipotezę, że niektóre leki na gruźlicę źle się gromadzą we włosach. Celowanie w metabolity tych leków może lepiej zrozumieć przestrzeganie przez pacjentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę analizy przywiązania pacjentów do leków opornych na gruźlicę (DR-TB) za pomocą próbek włosów. Poprzez pomiar stężenia leków we włosach, opiekunowie zdrowotni mogą uzyskać obiektywne informacje na temat przywiązania do terapii, potencjalnie zapobiegając pojawianiu się oporności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Farmakologia
- Zdrowie publiczne
Tło
- Przywiązanie pacjentów do leczenia DR-TB jest kluczowe dla efektywnego zarządzania.
- Obecne metody pomiaru przywiązania są często niedokładne i wymagające dużo zasobów.
- Różnorodność metabolizmu leków wymaga obiektywnego pomiaru stężeń leków.
- Próbki włosów zapewniają nieinwazyjną metodę analizy stężeń leków.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody ilościowego określania przywiązania do terapii u pacjentów z DR-TB.
- Wykorzystanie próbek włosów do pomiaru stężeń wielu leków przeciwgruźliczych.
- Poprawa planów leczenia poprzez wczesne wykrywanie problemów z przywiązaniem do terapii.
Stosowane metody
- Opracowanie panelu spektrometrii masowej z wieloma analitами.
- Analiza małych próbek włosów (2 mg) bez ekstrakcji fazy stałej.
- Pomiar sub-nanogramowych stężeń leków za pomocą LC-MS/MS.
- Mielenie próbek włosów w dniu analizy dla zapewnienia dokładności.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia dokładne pomiar stężeń leków we włosach.
- Obiektywne pomiary mogą ostrzec lekarzy o potencjalnych problemach z przywiązaniem do terapii.
- Pojedyncze badanie dla wielu leków przeciwgruźliczych poprawia efektywność.
- Wczesne wykrycie problemów z ekspozycją na leki może wpłynąć na korekty leczenia.
Wnioski
- Analiza włosów oferuje obiecującą alternatywę dla monitorowania przywiązania do leczenia DR-TB.
- Ta metoda może znacząco poprawić zarządzanie pacjentami i wyniki leczenia.
- Dalsze badania mogą poszerzyć zastosowanie tej techniki w innych obszarach medycyny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative LC-MS/MS analysis of drug-resistant TB medications in hair enables objective, long-term assessment of patient adherence, addressing a critical gap in therapeutic drug monitoring. This approach supports predictive confidence in exposure assessment and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in anti-infective development. The validated multi-analyte panel enhances portfolio value by enabling scalable, non-invasive monitoring across diverse patient populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective measurement of drug exposure to clarify pharmacokinetic variability in real-world settings.
- Supports biological de-risking by linking drug presence to adherence and potential resistance emergence.
- Facilitates predictive confidence in exposure-response relationships for anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, multiplexed LC-MS/MS assay for simultaneous quantification of 11 TB drugs in a single run.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream pharmacokinetic and adherence studies.
- Enables assay standardization and platform reuse for expanded drug panels or new indications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns drug exposure measurement with translational biomarker strategies for adherence and resistance monitoring.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal exposure assessment.
- De-risks advancement decisions by providing objective adherence data in diverse patient cohorts.
Pipeline & Workflow Integration
This LC-MS/MS panel integrates into the therapeutic development continuum from early discovery through translational research, supporting both exposure-response studies and adherence monitoring.
- Discovery Biology: Objectively quantifies drug exposure to inform hypothesis testing and mechanistic de-risking.
- Screening: Supplies validated, reproducible assay outputs for pharmacokinetic and adherence studies.
- Analytics: Delivers quantitative measurements and calibration-based readouts for robust data comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and clinical research by enabling long-term exposure monitoring in patient samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, non-invasive platform adaptable to additional drug panels or disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in adherence and exposure, reducing mechanistic ambiguity in resistance studies.
- Operational Value: Standardizes sample collection and analysis, supporting reproducibility and scalability across sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by identifying adherence-driven risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective assets based on objective exposure data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS/MS operation and quantitative assay validation.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample collection, processing, and data analysis protocols.
- Adaptable to other drug classes or matrices with appropriate method development.
- Sample integrity and accurate pulverization are critical for reliable quantification.
