Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster
March 16th, 2020
Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.
Ogólnym celem tego protokołu uszkodzenia Drosophila jest obserwacja zarówno zachowania morfologii aksonów i synapty, jak i funkcji synaptycznych aksonów i ich synaps. Testy te mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania czynników utrzymania neuronów, badania transportu aksonalnego lub analizy organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach. Test częściowego uszkodzenia skrzydła pozwala na obserwację uszkodzonych aksonów ulegających zwyrodnieniu obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym w skrzydle Drosophila.
Ten test obrażeń można łatwo przećwiczyć wcześniej u much typu dzikiego, wykonując cięcie mniej więcej na środku skrzydła za pomocą mikronożyczek. Uraz wewnętrzny pozwala na ocenę morfologii aksonów i za pomocą optogenetyki do wizualizacji funkcjonalnego zachowania aksonów i ich synaps. Ablacja czułka wymaga pewnych rąk.
Zaleca się również wcześniejsze przećwiczenie usuwania czułków u much typu dzikiego. W przypadku uzależnienia, każda dostępna konfiguracja optogenetyczna jest odpowiednia do aktywacji neuronów w locie z kapeluszem. W przeciwnym razie prostą konfigurację można łatwo zbudować od podstaw.
Na początek użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu do wykonania krzyżówek w temperaturze pokojowej. Przenoś pokolenie P0 do nowych fiolek co trzy do czterech dni. Świeżo zamknięte dorosłe potomstwo F1 należy codziennie zbierać do nowych fiolek i starzać je przez siedem do 14 dni.
Po znieczuleniu użyj mikronożyczek, aby przeciąć wewnętrzną żyłę skrzydła mniej więcej na środku skrzydła. Użyj jednego skrzydła do leczenia kontuzji, a drugiego skrzydła jako kontroli dopasowanej do wieku. Zastosuj jedną kontuzję na skrzydło i upewnij się, że zranisz 15 skrzydeł.
Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Następnie za pomocą pipety rozprowadź 10 mikrolitrów oleju halowęglowego 27 wzdłuż całego szkiełka podstawowego. Jeden lub siedem dni po urazie użyj mikronożyczek, aby odciąć rannego, a także nieuszkodzone skrzydło kontrolne.
Użyj pęsety, aby chwycić skrzydło pośrodku, zamontuj maksymalnie cztery skrzydła w oleju halowęglowym 27 i przykryj je szkiełkiem osłonowym. Obrazy neuronów oznaczonych GFP w skrzydle można łatwo uzyskać za pomocą obracającego się dysku. Jednak czas akwizycji musi być wykonany w czasie krótszym niż osiem minut po zamontowaniu skrzydeł, ponieważ czasza nie jest zamocowana.
Natychmiast zobrazuj skrzydło za pomocą mikroskopu z obracającym się dyskiem. Zdobądź serię przekrojów optycznych wzdłuż osi Z z krokiem co 0,33 mikrometra i skompresuj stosy Z w jeden plik do kolejnych analiz. Skrzyżuj pięć dziewiczych samic i pięć samców z odpowiedniego genotypu i zbierz pokolenie F1, tak jak poprzednio.
Po znieczuleniu użyj pęsety, aby oblamować prawy trzeci segment czułka do jednostronnej ablacji lub zarówno lewy, jak i prawy trzeci segment czułka do ablacji obustronnej. Powoduje to usunięcie ciał komórek neuronalnych znakowanych GFP, podczas gdy ich projekcje aksonalne pozostają w OUN. W zależności od neuronów znakowanych GFP użytych w technice, ważne jest, aby wiedzieć, czy ciała komórkowe znajdują się w trzecim, czy w drugim segmencie anteny do późniejszego testu urazu.
Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Po znieczuleniu użyj pęsety, aby chwycić szyję i innej pęsety, aby przymocować klatkę piersiową. Delikatnie odciągnij szyję i głowę od klatki piersiowej.
Za pomocą pęsety, która została zanurzona w roztworze utrwalającym, przenieś wszystkie głowice do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego 4% paraformaldehydu i 0,1 trytonu X100 w PBS. Zamocuj głowice na 20 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę mikrowirówki na lodzie, a głowice grawitują do dna probówki mikrowirówki.
Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać jeden mililitr buforu płuczącego zawierającego 0,1% triton X100 w PBS. Umieść rurkę na obracającym się kole w temperaturze pokojowej, aby myć przez dwie minuty. Powtórz pranie jeszcze cztery razy, aby usunąć resztki roztworu utrwalającego.
Po przygotowaniu mózgów zaopatrz się w szkiełko podstawowe, przyklej do niego taśmę laboratoryjną i wytnij z taśmy kształt przypominający literę T. Użyj końcówki do pipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów w miejscu, w którym odcięto trzy milimetry końcówki, aby poszerzyć otwór pipety. Odpipetować mózg zawierający odczynnik zapobiegający blaknięciu na szkiełko i przykryć mózgi szkiełkiem podstawowym.
Użyj gliny, aby przygotować dwie małe równe bułki. Upewnij się, że gliniane rolki nie są wyższe niż wysokość szklanego zjeżdżalni. Przyklej gliniane bułki do szkiełka i umieść kanapkę z mózgiem zawierającą szkiełko nakrywkowe na glinianych bułkach.
Postępuj zgodnie z rękopisem. Aby przygotować muchy do optogenetyki, najpierw rozpuść pokarm dla much w kuchence mikrofalowej. Po ostygnięciu pokarmu, przed zestaleniem, dodaj 20 milimoli całego trans-Retinalu w etanolu do końcowego stężenia 200 mikromolowych.
Dobrze wymieszaj i natychmiast wlej pokarm do pustych fiolek. Przykryj fiolki zawierające zestalony pokarm zatyczkami lub wacikami. Owinąć fiolki folią aluminiową.
Następnie należy przechowywać fiolki zawierające żywność w ciemnym, chłodnym pomieszczeniu. Użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu, aby wykonać krzyżówki w temperaturze pokojowej i zebrać pokolenie F1, jak poprzednio, w aluminiowych fiolkach zawierających 200 mikromolowców, wszystkie trans-Retinal w pokarmie dla much. Następnie zbierz muchy, stukając je z fiolek zawierających żywność do pustej fiolki bez jedzenia.
Schłodzić fiolkę w wodzie zawierającej lód przez około 30 sekund. Muchy zasypiają. Teraz szybko umieść pojedyncze muchy w małych komorach pokrytych szkiełkiem nakrywkowym, aby przeprowadzić optogenetykę.
W ciemnym pomieszczeniu wykonaj protokół składający się z 30 sekund, w których czerwone światło jest nieobecne, a następnie 10 sekund ekspozycji na czerwone światło z częstotliwością 10 Hz. Powtórz tę procedurę łącznie trzy razy, a następnie w dodatkowym 30-sekundowym odstępie, gdy czerwone światło jest nieobecne. Zbieraj pojedyncze muchy z każdej komory na podkładkach z dwutlenku węgla.
Aby narazić je na uraz czułka, należy dokonać ablacji zarówno lewego, jak i prawego drugiego segmentu czułka. Powoduje to usunięcie ciał komórkowych neuronów narządów Johnstona, podczas gdy wypustki aksonalne pozostają w OUN. Odzyskaj muchy w pokrytych aluminium fiolkach zawierających 200 milimolowych wszystkich trans-retinal
.W odpowiednich punktach czasowych, na przykład siedem dni po ablacji czułków, poddaj muszki kolejnemu testowi pielęgnacyjnemu. W protokole tym przedstawiono trzy metody badania morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps. Pierwsza metoda pozwala na wysokorozdzielczą obserwację poszczególnych aksonów w obwodowym układzie nerwowym.
Schematyczne skrzyżowania do generowania klonów typu dzikiego i wysokiego drutu w skrzydle są pokazane tutaj. Kontrola w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP jest również przedstawiona za pomocą strzałek wskazujących odcięte aksony. Przedstawiono drugie podejście do badania śmierci aksonów neuronów czuciowych znakowanych GFP w mózgu.
Schematyczne krzyżówki do generowania klonów typu dzikiego i highwire w mózgu są pokazane tutaj. Przykłady kontroli w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP są przedstawione ze strzałkami wskazującymi odcięte wiązki aksonów. Trzecia metoda demonstruje podejście do wizualizacji funkcji aksonalnych i synaptycznych po aksotomii.
Schematyczne krzyżowanie w celu wygenerowania neuronów czuciowych narządów Johnstona typu dzikiego i dnmnat z nadekspresją jest pokazane tutaj. Muchy typu dzikiego to muchy zawierające neurony narządów Johnstona z osłabioną śmiercią aksonów. Obaj zachowywali silne zachowanie pielęgnacyjne przed kontuzją.
Jednak siedem dni po urazie, pielęgnacja nie została wywołana przez optogenetykę u much typu dzikiego, podczas gdy zwierzęta z osłabioną śmiercią aksonów kontynuowały pielęgnację. Tutaj używamy mutacji utraty funkcji lub naszej ekspresji genów, aby zaobserwować zachowanie morfologii aksonów lub funkcji synaptycznej. Można zastosować inne metody modyfikacji, takie jak interferencja RNA knock down lub specyficzne tkankowo nokauty za pośrednictwem CRISPR-Cas9.
Metody te mogą być stosowane w kontekście niezależnym od urazu. Pozwalają one na obserwację i charakterystykę czynników utrzymania neuronów podczas starzenia, transportu aksonalnego i organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia protokoły dotyczące przeprowadzania badań nad degeneracją aksonów indukowaną urazem u Drosophila melanogaster, koncentrując się na ocenie morfologicznego i funkcjonalnego zachowania odciętych aksonów i ich synaps. Badania mają na celu zrozumienie czynników utrzymujących neurony oraz ocenę transportu aksonalnego.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Neurobiologia
- Degeneracja aksonów
- Utrzymanie neuronów
Wprowadzenie
- Degeneracja aksonów i utrzymanie synaps jest kluczowe dla zdrowia neuronów.
- Drosophila melanogaster służy jako przydatny model do badania tych procesów.
- Zrozumienie funkcji synaptycznej po urazie może dostarczyć informacji na temat chorób neurodegeneracyjnych.
- Poprzednie badania podkreśliły znaczenie czynników utrzymujących neurony.
Cel Badania
- Określenie, jak uraz wpływa na morfologię i funkcję aksonów i synaps.
- Charakterystyka czynników przyczyniających się do utrzymania neuronów.
- Umożliwienie analizy transportu aksonalnego i organelli w nienaruszonych aksonach.
Wykorzystane Metody
- Protokoły obejmują przeprowadzanie badań nad uszkodzeniem aksonów i obrazowanie komórkowe.
- Wykorzystany model biologiczny to Drosophila melanogaster, koncentrujący się na uszkodzeniach aksonów i późniejszych ocenach powrotu do zdrowia.
- W tekście nie wspomina się o przepływach pracy multiomics.
- Kluczowe kroki obejmują przeprowadzanie precyzyjnych obrażeń skrzydła i wykorzystywanie optogenetyki do wizualizacji aktywności neuronalnej.
- Uszkodzenia są oceniane za pomocą technik obrazowania z użyciem znakowania GFP oraz starannej analizy cech synaptycznych.
Główne Wyniki
- Metody te z powodzeniem umożliwiają porównanie obok siebie aksonów uszkodzonych i nieuszkodzonych.
- Można uzyskać istotne informacje dotyczące zachowania funkcji synaptycznej po urazie.
- Badanie ilustruje kluczowe ramy czasowe dla uzyskiwania obrazów w celu zapewnienia dokładnych ocen morfologicznych.
- Wnioski podkreślają znaczenie zrozumienia reakcji neuronów na uraz i potencjalnych mechanizmów naprawczych.
Wnioski
- Niniejsza praca dostarcza cenne protokoły do oceny obrażeń aksonów i mechanizmów powrotu do zdrowia w modelu organizmu.
- Wyniki ułatwiają dalsze badania dotyczące zdrowia neuronów, reakcji na uraz i utrzymania synaps.
- Wskazano na implikacje dla zrozumienia schorzeń neurodegeneracyjnych oraz potencjalnych perspektyw terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding axon degeneration mechanisms is critical for de-risking neurodegenerative disease targets and identifying neuroprotective strategies. These Drosophila protocols enable mechanistic evaluation of axonal and synaptic preservation, supporting target validation in early discovery. The assays provide quantitative, side-by-side comparison of degeneration and protection phenotypes, enhancing predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing axonal and synaptic morphology after injury.
- Scientific Value: Supports functional target validation through optogenetic assessment of synaptic transmission in severed axons.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking using highwire loss-of-function and dnmnat overexpression models that delay axon death.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible axonal injury models with internal controls (injured vs. uninjured axons in same nerve bundle).
- Operational Value: Enables high-resolution imaging of GFP-labeled axons for morphology quantification and comparison.
- Operational Value: Supports assay readiness for screening neuronal maintenance factors, axonal transport, and organelle dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system to study conserved axon death signaling cascades from flies to mammals.
- Scientific Value: Enables assessment of synaptic function preservation via optogenetically driven grooming behavior as a functional readout.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating morphological preservation with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows for target validation, lead identification, and preclinical assessment of neuroprotective candidates. It enables hypothesis testing of axonal degeneration pathways and supports go/no-go decisions based on morphological and functional preservation data.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking of axon death signaling cascades using genetic and pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative morphological outputs and functional synaptic readouts for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Enables side-by-side comparison of injured and control axons within identical environments, reducing variability and enhancing data reliability.
- Translational Research: Connects Drosophila axon death mechanisms to mammalian neurodegenerative disease models through conserved pathways like Sarm and DLK.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying neuronal maintenance factors, axonal transport, and mitochondrial health across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking axonal preservation to functional synaptic outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible assays with internal controls that reduce experimental noise and improve throughput.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neuroprotective targets before costly mammalian studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic evidence of target engagement in axon protection pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, neuroanatomy, and microsurgical techniques for precise wing or antennal injury.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure (e.g., spinning disk confocal) for high-resolution axonal imaging.
- Necessitates optogenetics setup with retinal feeding and light stimulation protocols for functional synaptic assays.
- Involves standardization across laboratories for injury timing, genotype handling, and environmental controls to ensure reproducibility.
- Limited by the need for acute injury modeling; chronic degeneration models may require alternative approaches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
