Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster
16 marca 2020
Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.
Ogólnym celem tego protokołu uszkodzenia Drosophila jest obserwacja zarówno zachowania morfologii aksonów i synapty, jak i funkcji synaptycznych aksonów i ich synaps. Testy te mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania czynników utrzymania neuronów, badania transportu aksonalnego lub analizy organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach. Test częściowego uszkodzenia skrzydła pozwala na obserwację uszkodzonych aksonów ulegających zwyrodnieniu obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym w skrzydle Drosophila.
Ten test obrażeń można łatwo przećwiczyć wcześniej u much typu dzikiego, wykonując cięcie mniej więcej na środku skrzydła za pomocą mikronożyczek. Uraz wewnętrzny pozwala na ocenę morfologii aksonów i za pomocą optogenetyki do wizualizacji funkcjonalnego zachowania aksonów i ich synaps. Ablacja czułka wymaga pewnych rąk.
Zaleca się również wcześniejsze przećwiczenie usuwania czułków u much typu dzikiego. W przypadku uzależnienia, każda dostępna konfiguracja optogenetyczna jest odpowiednia do aktywacji neuronów w locie z kapeluszem. W przeciwnym razie prostą konfigurację można łatwo zbudować od podstaw.
Na początek użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu do wykonania krzyżówek w temperaturze pokojowej. Przenoś pokolenie P0 do nowych fiolek co trzy do czterech dni. Świeżo zamknięte dorosłe potomstwo F1 należy codziennie zbierać do nowych fiolek i starzać je przez siedem do 14 dni.
Po znieczuleniu użyj mikronożyczek, aby przeciąć wewnętrzną żyłę skrzydła mniej więcej na środku skrzydła. Użyj jednego skrzydła do leczenia kontuzji, a drugiego skrzydła jako kontroli dopasowanej do wieku. Zastosuj jedną kontuzję na skrzydło i upewnij się, że zranisz 15 skrzydeł.
Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Następnie za pomocą pipety rozprowadź 10 mikrolitrów oleju halowęglowego 27 wzdłuż całego szkiełka podstawowego. Jeden lub siedem dni po urazie użyj mikronożyczek, aby odciąć rannego, a także nieuszkodzone skrzydło kontrolne.
Użyj pęsety, aby chwycić skrzydło pośrodku, zamontuj maksymalnie cztery skrzydła w oleju halowęglowym 27 i przykryj je szkiełkiem osłonowym. Obrazy neuronów oznaczonych GFP w skrzydle można łatwo uzyskać za pomocą obracającego się dysku. Jednak czas akwizycji musi być wykonany w czasie krótszym niż osiem minut po zamontowaniu skrzydeł, ponieważ czasza nie jest zamocowana.
Natychmiast zobrazuj skrzydło za pomocą mikroskopu z obracającym się dyskiem. Zdobądź serię przekrojów optycznych wzdłuż osi Z z krokiem co 0,33 mikrometra i skompresuj stosy Z w jeden plik do kolejnych analiz. Skrzyżuj pięć dziewiczych samic i pięć samców z odpowiedniego genotypu i zbierz pokolenie F1, tak jak poprzednio.
Po znieczuleniu użyj pęsety, aby oblamować prawy trzeci segment czułka do jednostronnej ablacji lub zarówno lewy, jak i prawy trzeci segment czułka do ablacji obustronnej. Powoduje to usunięcie ciał komórek neuronalnych znakowanych GFP, podczas gdy ich projekcje aksonalne pozostają w OUN. W zależności od neuronów znakowanych GFP użytych w technice, ważne jest, aby wiedzieć, czy ciała komórkowe znajdują się w trzecim, czy w drugim segmencie anteny do późniejszego testu urazu.
Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Po znieczuleniu użyj pęsety, aby chwycić szyję i innej pęsety, aby przymocować klatkę piersiową. Delikatnie odciągnij szyję i głowę od klatki piersiowej.
Za pomocą pęsety, która została zanurzona w roztworze utrwalającym, przenieś wszystkie głowice do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego 4% paraformaldehydu i 0,1 trytonu X100 w PBS. Zamocuj głowice na 20 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę mikrowirówki na lodzie, a głowice grawitują do dna probówki mikrowirówki.
Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać jeden mililitr buforu płuczącego zawierającego 0,1% triton X100 w PBS. Umieść rurkę na obracającym się kole w temperaturze pokojowej, aby myć przez dwie minuty. Powtórz pranie jeszcze cztery razy, aby usunąć resztki roztworu utrwalającego.
Po przygotowaniu mózgów zaopatrz się w szkiełko podstawowe, przyklej do niego taśmę laboratoryjną i wytnij z taśmy kształt przypominający literę T. Użyj końcówki do pipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów w miejscu, w którym odcięto trzy milimetry końcówki, aby poszerzyć otwór pipety. Odpipetować mózg zawierający odczynnik zapobiegający blaknięciu na szkiełko i przykryć mózgi szkiełkiem podstawowym.
Użyj gliny, aby przygotować dwie małe równe bułki. Upewnij się, że gliniane rolki nie są wyższe niż wysokość szklanego zjeżdżalni. Przyklej gliniane bułki do szkiełka i umieść kanapkę z mózgiem zawierającą szkiełko nakrywkowe na glinianych bułkach.
Postępuj zgodnie z rękopisem. Aby przygotować muchy do optogenetyki, najpierw rozpuść pokarm dla much w kuchence mikrofalowej. Po ostygnięciu pokarmu, przed zestaleniem, dodaj 20 milimoli całego trans-Retinalu w etanolu do końcowego stężenia 200 mikromolowych.
Dobrze wymieszaj i natychmiast wlej pokarm do pustych fiolek. Przykryj fiolki zawierające zestalony pokarm zatyczkami lub wacikami. Owinąć fiolki folią aluminiową.
Następnie należy przechowywać fiolki zawierające żywność w ciemnym, chłodnym pomieszczeniu. Użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu, aby wykonać krzyżówki w temperaturze pokojowej i zebrać pokolenie F1, jak poprzednio, w aluminiowych fiolkach zawierających 200 mikromolowców, wszystkie trans-Retinal w pokarmie dla much. Następnie zbierz muchy, stukając je z fiolek zawierających żywność do pustej fiolki bez jedzenia.
Schłodzić fiolkę w wodzie zawierającej lód przez około 30 sekund. Muchy zasypiają. Teraz szybko umieść pojedyncze muchy w małych komorach pokrytych szkiełkiem nakrywkowym, aby przeprowadzić optogenetykę.
W ciemnym pomieszczeniu wykonaj protokół składający się z 30 sekund, w których czerwone światło jest nieobecne, a następnie 10 sekund ekspozycji na czerwone światło z częstotliwością 10 Hz. Powtórz tę procedurę łącznie trzy razy, a następnie w dodatkowym 30-sekundowym odstępie, gdy czerwone światło jest nieobecne. Zbieraj pojedyncze muchy z każdej komory na podkładkach z dwutlenku węgla.
Aby narazić je na uraz czułka, należy dokonać ablacji zarówno lewego, jak i prawego drugiego segmentu czułka. Powoduje to usunięcie ciał komórkowych neuronów narządów Johnstona, podczas gdy wypustki aksonalne pozostają w OUN. Odzyskaj muchy w pokrytych aluminium fiolkach zawierających 200 milimolowych wszystkich trans-retinal
.W odpowiednich punktach czasowych, na przykład siedem dni po ablacji czułków, poddaj muszki kolejnemu testowi pielęgnacyjnemu. W protokole tym przedstawiono trzy metody badania morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps. Pierwsza metoda pozwala na wysokorozdzielczą obserwację poszczególnych aksonów w obwodowym układzie nerwowym.
Schematyczne skrzyżowania do generowania klonów typu dzikiego i wysokiego drutu w skrzydle są pokazane tutaj. Kontrola w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP jest również przedstawiona za pomocą strzałek wskazujących odcięte aksony. Przedstawiono drugie podejście do badania śmierci aksonów neuronów czuciowych znakowanych GFP w mózgu.
Schematyczne krzyżówki do generowania klonów typu dzikiego i highwire w mózgu są pokazane tutaj. Przykłady kontroli w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP są przedstawione ze strzałkami wskazującymi odcięte wiązki aksonów. Trzecia metoda demonstruje podejście do wizualizacji funkcji aksonalnych i synaptycznych po aksotomii.
Schematyczne krzyżowanie w celu wygenerowania neuronów czuciowych narządów Johnstona typu dzikiego i dnmnat z nadekspresją jest pokazane tutaj. Muchy typu dzikiego to muchy zawierające neurony narządów Johnstona z osłabioną śmiercią aksonów. Obaj zachowywali silne zachowanie pielęgnacyjne przed kontuzją.
Jednak siedem dni po urazie, pielęgnacja nie została wywołana przez optogenetykę u much typu dzikiego, podczas gdy zwierzęta z osłabioną śmiercią aksonów kontynuowały pielęgnację. Tutaj używamy mutacji utraty funkcji lub naszej ekspresji genów, aby zaobserwować zachowanie morfologii aksonów lub funkcji synaptycznej. Można zastosować inne metody modyfikacji, takie jak interferencja RNA knock down lub specyficzne tkankowo nokauty za pośrednictwem CRISPR-Cas9.
Metody te mogą być stosowane w kontekście niezależnym od urazu. Pozwalają one na obserwację i charakterystykę czynników utrzymania neuronów podczas starzenia, transportu aksonalnego i organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokoły przeprowadzania testów degeneracji aksonów indukowanej urazem u Drosophila melanogaster, koncentrując się na ocenie zachowania morfologicznego i funkcjonalnego przerwanych aksonów oraz ich synaps. Testy te mają na celu zrozumienie czynników odpowiedzialnych za utrzymanie neuronów oraz ocenę transportu aksonalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Degeneracja aksonalna
- Utrzymanie funkcji neuronów
Wprowadzenie
- Degeneracja aksonów i utrzymanie synaps są kluczowe dla zdrowia neuronów.
- Drosophila melanogaster służy jako użyteczny model do badania tych procesów.
- Zrozumienie funkcji synaptycznej po urazie może dostarczyć informacji na temat chorób neurodegeneracyjnych.
- Poprzednie badania podkreśliły znaczenie czynników odpowiedzialnych za utrzymanie neuronów.
Cel badania
- Określenie, w jaki sposób uraz wpływa na morfologię i funkcję aksonów oraz synaps.
- Charakterystyka czynników przyczyniających się do utrzymania neuronów.
- Umożliwienie analizy transportu aksonalnego i organelli w nienaruszonych aksonach.
Zastosowane metody
- Protokoły obejmują przeprowadzanie testów uszkodzeń aksonalnych oraz obrazowanie komórkowe.
- Wykorzystanym modelem biologicznym jest Drosophila melanogaster, ze szczególnym uwzględnieniem uszkodzeń aksonalnych i późniejszych ocen regeneracji.
- W tekście nie wspomniano o żadnych przepływach pracy multiomicznych.
- Kluczowe kroki obejmują wykonywanie precyzyjnych uszkodzeń skrzydeł oraz zastosowanie optogenetyki do wizualizacji aktywności neuronalnej.
- Uszkodzenia są oceniane za pomocą technik obrazowania z zastosowaniem znakowania GFP oraz dokładnej analizy cech synaptycznych.
Główne wyniki
- Zastosowane metody pozwalają na skuteczne porównanie uszkodzonych i nieuszkodzonych aksonów.
- Można uzyskać istotne informacje na temat zachowania funkcji synaptycznych po urazie.
- Badanie przedstawia kluczowe ramy czasowe pozyskiwania obrazów, aby zapewnić dokładną ocenę morfologiczną.
- Wnioski podkreślają znaczenie zrozumienia odpowiedzi neuronów na urazy oraz potencjalnych mechanizmów naprawczych.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza cennych protokołów służących do oceny uszkodzeń aksonalnych oraz mechanizmów regeneracji w organizmie modelowym.
- Wyniki ułatwiają dalsze badania nad kondycją neuronów, odpowiedziami na uszkodzenia oraz utrzymaniem połączeń synaptycznych.
- Wskazano na implikacje dla zrozumienia schorzeń neurodegeneracyjnych oraz potencjalne wnioski terapeutyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie mechanizmów degeneracji aksonów jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w chorobach neurodegeneracyjnych oraz dla identyfikacji strategii neuroprotekcyjnych. Niniejsze protokoły dla Drosophila umożliwiają mechaniczną ocenę zachowania aksonów i synaps, wspierając walidację celów we wczesnej fazie odkrywania leków. Testy te zapewniają ilościowe, bezpośrednie porównanie fenotypów degeneracji i ochrony, co zwiększa pewność prognostyczną w procesie identyfikacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ocenę morfologii aksonów i synaps po urazie.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez optogenetyczną ocenę przekaźnictwa synaptycznego w przerwanych aksonach.
- Wartość operacyjna: Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka z wykorzystaniem modeli utraty funkcji highwire oraz nadekspresji dnmnat, które opóźniają obumieranie aksonów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie ustandaryzowanych, powtarzalnych modeli uszkodzeń aksonów z kontrolami wewnętrznymi (aksony uszkodzone i nieuszkodzone w tym samym pęczku nerwowym).
- Wartość operacyjna: Umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości aksonów znakowanych GFP w celu kwantyfikacji i porównania morfologii.
- Wartość operacyjna: Wspiera przygotowanie testów do przesiewania czynników utrzymania neuronów, transportu aksonalnego oraz dynamiki organelli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia model systemu istotny dla przebiegu choroby, pozwalający na badanie konserwowanych kaskad sygnalizacji śmierci aksonów od muszek owocówek po ssaki.
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę zachowania funkcji synaptycznych poprzez wykorzystanie optogenetycznie stymulowanego zachowania pielęgnacyjnego jako odczytu funkcjonalnego.
- Wartość operacyjna: Wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez korelację zachowania morfologicznego z wynikiem funkcjonalnym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych w zakresie walidacji celów, identyfikacji wiodących związków oraz oceny przedklinicznej kandydatów o działaniu neuroprotekcyjnym. Umożliwia ona testowanie hipotez dotyczących ścieżek degeneracji aksonalnej i wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o dane dotyczące zachowania morfologii i funkcji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego kaskad sygnalizacji śmierci aksonów z wykorzystaniem perturbacji genetycznych i farmakologicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników morfologicznych i funkcjonalnych odczytów synaptycznych do oceny związków lub modyfikatorów genetycznych.
- Analityka: Umożliwia bezpośrednie porównanie aksonów uszkodzonych i kontrolnych w identycznym środowisku, co zmniejsza zmienność i zwiększa niezawodność danych.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy śmierci aksonów u Drosophila z modelami chorób neurodegeneracyjnych u ssaków poprzez konserwowane szlaki, takie jak Sarm i DLK.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania czynników podtrzymujących neurony, transportu aksonalnego i stanu mitochondriów w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez powiązanie zachowania aksonów z funkcjonalnymi efektami synaptycznymi.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane, powtarzalne testy z kontrolami wewnętrznymi, które redukują szum eksperymentalny i zwiększają wydajność.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów neuroprotekcyjnych przed kosztownymi badaniami na ssakach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając dowodów mechanistycznych na zaangażowanie celu w szlaki ochrony aksonów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu genetyki Drosophila, neuroanatomii oraz technik mikrochirurgicznych w celu precyzyjnego wyrządzenia urazu skrzydła lub czułka.
- Zależne od infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej (np. konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym) w celu uzyskania obrazów aksonów o wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga konfiguracji optogenetycznej wraz z protokołami karmienia retinalem i stymulacji światłem do przeprowadzania funkcjonalnych testów synaptycznych.
- Wymaga standaryzacji między laboratoriami w zakresie czasu urazu, obsługi genotypów oraz kontroli środowiskowej w celu zapewnienia powtarzalności.
- Ograniczone koniecznością modelowania urazów ostrych; modele degeneracji przewlekłej mogą wymagać alternatywnych podejść.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
