Name: Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metody oceny morfologii i funkcji aksonów oraz synaps podczas degeneracji w Drosophila melanogaster. Protokoły te pozwalają badać czynniki utrzymania neuronów i transport aksonalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Neukomm za wkład. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) Nagrodę Adiunkta (grant 176855), Międzynarodową Fundację Badań nad Paraplegią (IRP, grant P180), SNSF Spark (grant 190919) oraz przez wsparcie Uniwersytetu w Lozannie i Wydziału Neuronauk Podstawowych (État de Vaud) dla LJN.

1. Obserwacja morfologii aksonów podczas obumierania aksonów w obwodowym układzie nerwowym (PNS)
<ol>
	<li>Uszkodzenie skrzydła: częściowe uszkodzenie pęczków aksonów
	<ol>
		<li>Użyj 5 dziewiczych samic i 5 samców odpowiedniego genotypu (Rysunek 4A, pokolenie P0) do przeprowadzenia krzyżówek w temperaturze pokojowej (RT). Przenoszenie P0 do nowych fiolek wykonuj co 3–4 dni. Codziennie zbieraj świeżo wyklute potomstwo dorosłe (pokolenie F1) i utrzymuj je przez 7–14 dni.</li>
		<li>Znieczul muchy na podkładkach z CO2. Za pomocą mikronożyczek przetnij przednią żyłkę skrzydła mniej więcej w połowie długości skrzydła (Rysunek 1A). Jedno skrzydło wykorzystaj do uszkodzenia, a drugie jako kontrolę nieuszkodzoną w tym samym wieku. Wykonuj jedno uszkodzenie na skrzydło i upewnij się, że uszkodzono wystarczającą liczbę skrzydeł (około 15 skrzydeł). 
		UWAGA: Można przeciąć całe skrzydło, jednak wystarczy przeciąć tylko przednią żyłkę skrzydła. Jest to najmocniejsza część skrzydła.</li>
		<li>Pozostaw muchy do regeneracji w fiolkach z pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Disekcja skrzydła i wizualizacja aksonów
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety rozprowadź 10 µL oleju halowęglowego 27 wzdłuż całego szkiełka przedmiotowego (Rysunek 1B).</li>
		<li>Odetnij uszkodzone oraz kontrolne nieuszkodzone skrzydło w wybranych punktach czasowych (np. 1 lub 7 dni po uszkodzeniu). Do odcięcia użyj mikronożyczek, a do chwytania skrzydła pęsety. Zamocuj maksymalnie 4 skrzydła w oleju halowęglowym 27 (Rysunek 1B) i przykryj je szkiełkiem nakrywnym.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie skrzydła natychmiast przy użyciu mikroskopu z dyskiem rotującym. Pozyskaj serię przekrojów optycznych wzdłuż osi z z krokiem 0.33 μm i skompresuj stosy z w jeden plik do późniejszych analiz. 
		UWAGA: Nie chwytaj przedniej żyłki skrzydła, w której znajdują się ciała komórek i aksony. Chwytaj skrzydło za środek. Tkanka w skrzydłach nie jest utrwalona; czas od zamocowania skrzydeł do ich obrazowania musi być krótszy niż 8 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii i preparacji skrzydła Drosophila, przedstawiający drogi neuronalne oraz sposób przygotowania preparatu do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obserwacja morfologii aksonów podczas obumierania aksonów w skrzydle. (A) Schemat skrzydła muchy z dwoma rzadko oznakowanymi GFP neuronami sensorycznymi, które są również oddzielnie wskazane poniżej. Oznaczono miejsce uszkodzenia oraz pole obserwacji. (B) Schemat przygotowania do obrazowania skrzydła. Uszkodzone oraz nieuszkodzone skrzydła kontrolne (szare) są zamontowane w oleju halowęglowym 27 (czerwony) na szkiełku przedmiotowym (jasnoniebieski) i przykryte szkiełkiem podstawowym (czarny). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Obserwacja morfologii aksonów i synaps podczas obumierania aksonów w OUN
<ol>
	<li>Ablacja czułków: uszkodzenie całych pęczków aksonalnych
	<ol>
		<li>Do przeprowadzania krzyżówek w temperaturze pokojowej (RT) należy użyć 5 dziewiczych samic i 5 samców odpowiedniego genotypu (Rysunek 5A, pokolenie P0). Przenosić osobniki P0 do nowych fiolek co 3–4 dni. Codziennie zbierać świeżo wyklute potomstwo dorosłe (pokolenie F1) i pozostawić je na okres od 7 do 14 dni.</li>
		<li>Zanurzyć muchy w poduszkach z CO2 w celu znieczulenia. Za pomocą pęsety usunąć prawy 3rd segment czułka w przypadku ablacji jednostronnej lub oba (lewy i prawy) 3rd segmenty czułków w przypadku ablacji obustronnej (Rysunek 2A-C). Pozwoli to na usunięcie ciał komórek neuronalnych znakowanych GFP, podczas gdy ich projekcje aksonalne pozostaną w OUN. 
		UWAGA: Ablacja czułków przecina cały pęczek aksonalny. Jeśli wykonano ablację jednostronną, pęczek aksonalny po stronie przeciwległej (nieuszkodzony czułek) służy jako kontrola wewnętrzna. Należy upewnić się, że wykonano wystarczającą liczbę ablacji czułków (około 15 zwierząt).</li>
		<li>Pozostawić muchy do regeneracji w fiolkach z pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Disekcja mózgu i wizualizacja aksonów
	<ol>
		<li>Wymieszać bazę elastomeru silikonowego (9 mL) z utwardzaczem (1 mL) w stosunku objętościowym 10:1. Przenieść każdą 5 mL mieszaniny do płytki do hodowli tkanek 35 mm i zredukować ilość wprowadzonego podczas mieszania powietrza poprzez delikatne wstrząsanie w dygestorium przez noc. Mieszanina twardnieje w ciągu 24 h. 
		UWAGA: Płytki do disekcji należy przygotować tylko raz; mogą być one używane wielokrotnie.</li>
		<li>Znieczulić muchy na poduszkach z CO2 i odciąć głowy osobników dorosłych za pomocą dwóch pęset w wybranych punktach czasowych (np. 1 lub 7 dni po ablacji czułków). Jedną pęsetą chwycić za szyję, a drugą unieruchomić klatkę piersiową. Delikatnie odciągnąć szyję i głowę od klatki piersiowej. 
		UWAGA: Pozostawić odcięte głowy na poduszce z CO2 do momentu uzyskania pożądanej liczby, pamiętając jednak o przejściu do następnego kroku w ciągu 30 min.</li>
		<li>Przenieść wszystkie głowy do probówki mikrocentryfugalnej 1,5 mL zawierającej 1 mL roztworu utrwalającego składającego się z 4% paraformaldehydu (PFA) i 0,1% Triton X-100 w buforze fosforanowym (PBS), używając pęsety zamoczonej w roztworze utrwalającym. 
		UWAGA: Głowy much dobrze przylegają do mokrej pęsety, co umożliwia sprawne przeniesienie wszystkich głów do probówki mikrocentryfugalnej.</li>
		<li>Utrwalać głowy przez 20 min przy delikatnym wstrząsaniu w RT. Umieścić probówkę mikrocentryfugalną na lodzie, aby głowy opadły na dno. Usunąć nadsącz pipetą i powtórzyć tę procedurę, wykonując pięć 2-minutowych przemyć 1 mL buforu płuczącego zawierającego 0,1% Triton X-100 w PBS przy delikatnym wstrząsaniu w RT, aby usunąć pozostałości roztworu utrwalającego. 
		UWAGA: Filmy instruktażowe dotyczące disekcji mózgów dorosłych Drosophila są powszechnie dostępne27.</li>
		<li>Przenieść głowy szklaną pipetą do płytki do disekcji wypełnionej buforem płuczącym. Jedną pęsetą chwycić i odciągnąć trąbkę od głowy, przytrzymując głowę drugą pęsetą. Pozostawi w ten sposób otwór w miejscu przyczepu trąbki do egzoszkieletu.</li>
		<li>Za pomocą dwóch pęset usunąć egzoszkielet pomiędzy otworem a każdym z oczu złożonych. Umożliwi to otwarcie struktury głowy obiema pęsetami i delikatne wydobycie znajdującego się wewnątrz mózgu.</li>
		<li>Oczyścić każdy mózg z przylegających do niego tchawików lub tkanki tłuszczowej (Rysunek 2D, góra). Po oczyszczeniu umieścić mózg w nowej probówce mikrocentryfugalnej zawierającej 1 mL buforu płuczącego na lodzie. 
		UWAGA: Uszkodzenie lub utrata płatów optycznych nie wpłynie na płat węchowy w centrum mózgu (Rysunek 2D, góra).</li>
		<li>Zastąpić bufor płuczący 1 mL roztworu utrwalającego, gdy wszystkie mózgi zostaną zebrane i zgromadzone na dnie probówki mikrocentryfugalnej. Utrwalać mózgi przez 10 min przy wytrząsaniu w RT, a następnie wykonać pięć 2-minutowych przemyć w 1 mL buforu płuczącego przy wytrząsaniu w RT.</li>
		<li>Nanieść przeciwciała pierwszorzędowe (1:500) w buforze płuczącym przez noc przy wytrząsaniu w 4 °C, a następnie wykonać 10 przemyć w ciągu 2 h, używając 1 mL buforu płuczącego przy wytrząsaniu w RT.</li>
		<li>Nanieść przeciwciała drugorzędowe (1:500) w buforze płuczącym na 2 h przy wytrząsaniu w RT i owinąć probówkę mikrocentryfugalną folią aluminiową, aby odciąć dopływ światła. Przez resztę procedury trzymać probówkę mikrocentryfugalną przykrytą folią aluminiową. Wykonać dziesięć przemyć 1 mL buforu płuczącego w ciągu 2 h przy wytrząsaniu w RT.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i użyć pojedynczej kropli odczynnika przeciwwyblakającego (antifade reagent), aby przykryć mózgi w probówce mikrocentryfugalnej. Inkubować mózgi przez co najmniej 30 min w 4 °C przed przygotowaniem ich do montowania i obrazowania.</li>
		<li>Przygotować szkiełko nakrywkowe, nakleić na nie taśmę laboratoryjną i wyciąć z niej kształt przypominający literę „T” (Rysunek 2D, dół). Powstała przestrzeń służy jako miejsce, do którego pipetowany będzie odczynnik przeciwwyblakający z zawartością mózgów28, najlepiej do obu komór. 
		UWAGA: Należy użyć końcówki do pipety 20-200 µL, z której odcięto 3 mm końcówki w celu poszerzenia otworu. Umożliwi to pipetowanie odczynnika przeciwwyblakającego wraz z mózgiem. Ostrożnie przykryć mózgi szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Użyć plasteliny do przygotowania dwóch małych, równych wałeczków. Upewnić się, że wałeczki z plasteliny nie są wyższe niż wysokość szkiełka przedmiotowego. Przykleić wałeczki do szkiełka przedmiotowego (Rysunek 2D, dół). Umieścić „kanapkę” ze szkiełka nakrywkowego zawierającą mózgi na wałeczkach z plasteliny. 
		UWAGA: Aksony znakowane GFP i ich synapsy znajdują się w przedniej części mózgu. Dlatego łatwiej jest obrazować je od przodu. Mózgi w „kanapce” mogą być skierowane przodem do góry lub do dołu. Wałeczki z plasteliny służą jako uchwyty, dzięki czemu podczas obrazowania „kanapkę” można obrócić do góry nogami. Pozwoli to na uzyskanie obrazów z przodu dla każdego mózgu.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu konfokalnego zebrać serię przekrojów optycznych wzdłuż osi z z krokiem 1,0 μm i skompresować stosy z (z-stacks) do jednego pliku do późniejszych analiz, aby ocenić liczbę nienaruszonych projekcji aksonalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schematy anatomii Drosophila i preparacji mózgu; szlaki neuronalne, płaty węchowe, ablacja czułka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obserwacja morfologii aksonów i synaps podczas obumierania aksonów w mózgu. (A) Widok z boku schematu głowy muchy z ciałami komórkowymi, aksonami i synapsami znakowanymi GFP. (B) Powiększony widok z przodu neuronów receptorowych węchowych znakowanych GFP oraz ich aksonów i synaps. Ciała komórkowe znajdują się w 3rd segmencie czułka, a ich aksony kierują się do OUN. Aksony tworzą synapsy w kłębuszku w lewym płacie węchowym, przecinają linię środkową i tworzą synapsy w kłębuszku w przeciwległym płacie węchowym. (C) Przykłady głów much z jednostronną ablacją czułka. Góra: Kontrola nieuszkodzona. Środek: Ablacja 3rd segmentu czułka. Dół: Ablacja 2nd (a tym samym również 3rd) segmentu czułka. (D) Preparacja mózgu. Góra: Schemat wypreparowanego mózgu muchy z zaznaczonymi płatami węchowymi i projekcjami aksonalnymi w polu widzenia. Dół: Schematyczny układ do obrazowania mózgu. Dwa wałki z gliny (zielone) są zamontowane na szkiełku podstawowym (jasnoniebieskie), utrzymują one kanapkę z szkiełek zakrywek, w której znajdują się mózgi much (szare). Mózgi są zamontowane w odczynniku przeciwblaknięciowym (fioletowy), otoczone taśmą laboratoryjną (pomarańczowa) i przykryte dwoma szkiełkami zakrywkowymi (czarne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
3. Pielęgnacja wywołana optogenetyką jako wskaźnik funkcji aksonów i synaps
<ol>
	<li>Układ optogenetyczny
	<ol>
		<li>Eksperyment optogenetyczny przeprowadzić w ciemni. Należy upewnić się, że układ składa się z podświetlenia LED w podczerwieni (IR) o długości fali 850 nm do oświetlania much w ciemności (Rysunek 3A), migającego podświetlenia LED w kolorze czerwonym o długości fali 660 nm do aktywacji neuronów eksprsumujących CsChrimson oraz kamery monochromatycznej z filtrem długoprzepustowym 700 nm, który zapobiega rejestrowaniu błysków czerwonego światła.</li>
		<li>Za pomocą drukarki 3D wykonać niewielką, okrągłą komorę behawioralną o średnicy 1 cm, przykryć ją szkiełkiem nakrywkowym i umieścić obok komory emitera 860 nm sprzężonego z czerwonym podświetleniem LED (Rysunek 3B). 
		UWAGA: Emitter sygnalizuje, kiedy czerwone podświetlenie LED jest włączone, co oznacza aktywację neuronów.</li>
		<li>Zamontować podświetlenia LED oraz kamerę nad komorą (Rysunek 3A, C).</li>
		<li>Aktywować neurony za pomocą błysków o częstotliwości 10 Hz przez 10 s. Czas trwania aktywacji można dostosować do projektu eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie much do optogenetyki
	<ol>
		<li>Roztopić pożywkę dla much w kuchence mikrofalowej. Po ostygnięciu pożywki, przed jej zastygnięciem, dodać 1:100 roztworu 20 mM all-trans-retinalu w etanolu (EtOH) do stężenia końcowego 200 µM. Dobrze wymieszać i natychmiast przelać pożywkę do pustych fiolek. 
		UWAGA: Należy unikać dodawania all-trans-retinalu do gorącej pożywki, gdyż może to obniżyć wydajność optogenetyki.</li>
		<li>Fiolki zawierające zastygłą pożywkę zamknąć korkami lub watą. Fiolki owinąć folią aluminiową. Następnie przechowywać fiolki z pożywką w ciemnym, chłodnym pomieszczeniu.</li>
		<li>Do przeprowadzenia krzyżówek w temperaturze pokojowej (RT) użyć 5 dziewiczych samic i 5 samców (Rysunek 6A, generacja P0) o odpowiednim genotypie. Przenosić osobniki P0 do nowych fiolek co 3–4 dni. Codziennie zbierać świeżo wyklułe dorosłe potomstwo (generacja F1) i pozwolić im dojrzewać od 7 do 14 dni w owiniętych folią aluminiową fiolkach zawierających pożywkę z 200 µM all-trans-retinalu.</li>
		<li>zebrać muchy, wystukując je z fiolek z pożywką do pustej fiolki bez pożywki. Schłodzić fiolkę w kąpieli wodnej z lodem przez około 30 s, aż muchy zasną. Szybko przenosić pojedyncze muchy do małych komór przykrytych szkiełkiem nakrywkowym (Rysunek 3B). 
		UWAGA: Muchy budzą się natychmiast po ogrzaniu. Kluczowe jest szybkie rozdzielenie pojedynczych much do osobnych komór. Należy unikać stosowania poduszek z CO2 do znieczulania much, ponieważ wpłynie to na ich zachowanie.</li>
		<li>Przeprowadzić stymulację optogenetyczną w celu wywołania czyszczenia anten (antennal grooming). W tym protokole interwały wyglądają następująco: 30 s bez czerwonego światła, a następnie 10 s ekspozycji na czerwone światło o częstotliwości 10 Hz. Powtórzyć tę procedurę łącznie trzy razy, a następnie zastosować dodatkowy 30 s interwał bez czerwonego światła12,29,30. 
		UWAGA: Protokół ten można dostosować do preferencji eksperymentalnych.</li>
		<li>zebrać pojedyncze muchy z każdej komory na poduszki z CO2. Poddać je uszkodzeniu anten. Ablacyjnie usunąć zarówno lewy, jak i prawy 2nd segment anteny (Rysunek 2C). Spowoduje to usunięcie ciał komórkowych neuronów organu Johnstona (JO), podczas gdy projekcje aksonalne pozostaną w OUN. Pozostawić muchy do regeneracji w owiniętych folią aluminiową fiolkach zawierających 200 µM all-trans-retinalu. 
		UWAGA: W przypadku czyszczenia anten indukowanego optogenetycznie, ciała komórkowe neuronów sensorycznych znajdują się w 2nd segmencie anteny (Rysunek 2C).</li>
		<li>W odpowiednich punktach czasowych (np. 7 dni po ablacji anten) poddać muchy kolejnemu testowi czyszczenia (powrócić do kroku 3.2.4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu optogenetycznego: reflektory LED IR i czerwone, komora behawioralna, kamera do badań neuronów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Układ optogenetyczny do indukowania pielęgnacji (grooming) jako wskaźnika funkcji aksonów i synaps. (A) Ilustracja zmontowanych komponentów niezbędnych do optogenetyki. Reflektor LED w podczerwieni (IR), kamera i czerwony reflektor LED (od lewej do prawej, odpowiednio). Komponenty wraz ze szczegółowym opisem wymieniono w Tabeli materiałów. (B) Ilustracja z widokiem z góry komory behawioralnej, zawierająca emiter IR wskazujący aktywację czerwonego reflektora LED. (C) Ilustracja pojedynczego uchwytu. Do dwóch reflektorów LED i kamery wymagane są łącznie trzy zestawy uchwytów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Nigrostriatal+Dopaminergic+Neurons+Form+Widely+Spread+and+Highly+Dense+Axonal+Arborizations+in+the+Neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li>
<li>Wedel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Monument+of+Inefficiency%3A+The+Presumed+Course+of+the+Recurrent+Laryngeal+Nerve+in+Sauropod+Dinosaurs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Palaeontologica+Polonica%22%5BJournal%5D)">A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs.</a> Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Mariano, V., Domínguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+mechanisms+of+circuit-integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).</li>
<li>Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration%3A+an+emerging+axon+death+pathway+linking+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease.</a> Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).</li>
<li>Neukomm, L. J., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cellular+and+molecular+modes+of+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration.</a> Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).</li>
<li>Gustavsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%3A+The+Journal+of+the+European+College+of+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Cost of disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog%2C+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).</li>
<li>Rosell, A. L., Neukomm, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+death+signalling+in+Wallerian+degeneration+among+species+and+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease.</a> Open Biology. 9 (8), 190118(2019).</li>
<li>Mack, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration+of+injured+axons+and+synapses+is+delayed+by+a+Ube4b%2FNmnat+chimeric+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).</li>
<li>Osterloh, J. M., et al. dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOsterloh%2C+JM+%22Science%22">Science</a>. 337 (6093), New York, NY. 481-484 (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biology. 10 (12), 1001440(2012).</li>
<li>Neukomm, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+Death+Pathways+Converge+on+Axundead+to+Promote+Functional+and+Structural+Axon+Disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly.</a> Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).</li>
<li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li>
<li>Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+forward+genetic+approach+for+identifying+axon+death+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nature Communications. 8, 14355(2017).</li>
<li>Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Wallerian+Degeneration+does+not+Hinder+Regeneration+in+Peripheral+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve.</a> The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).</li>
<li>Adalbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+slow+Wallerian+degeneration+%28Wld%28S%29%29+with+improved+preservation+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).</li>
<li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137 (23), Cambridge, England. 3985-3994 (2010).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Wld%28S%29+or+Nmnat2+in+Mauthner+Cells+by+Single-Cell+Electroporation+Delays+Axon+Degeneration+in+Live+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).</li>
<li>Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Nmnat2+is+an+essential+survival+factor+for+maintenance+of+healthy+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons.</a> PLoS Biology. 8 (1), 1000300(2010).</li>
<li>Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phr1+ubiquitin+ligase+promotes+injury-induced+axon+self-destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction.</a> Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).</li>
<li>Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarm1-mediated+axon+degeneration+requires+both+SAM+and+TIR+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).</li>
<li>Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGerdts%2C+J+%22Science%22">Science</a>. 348 (6233), New York, NY. 453-457 (2015).</li>
<li>Bridge, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+crush+injuries--a+model+for+axonotmesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nerve crush injuries--a model for axonotmesis.</a> Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).</li>
<li>Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+Degeneration+in+the+Optic+Nerve+Stretch-Injury+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%3A+A+Stereological+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).</li>
<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).</li>
<li>Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2015).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mowiol+mounting+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mowiol mounting medium.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> eLife. 3, 02951(2014).</li>
<li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A neural command circuit for grooming movement control.</a> eLife. 4, 08758(2015).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102 (2), 147-159 (2000).</li>
<li>Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+activation+of+parallel+sensory+pathways+promotes+a+grooming+sequence+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Farley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Pebbled%2FRREB1+regulates+injury-induced+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depletion+of+ESCRT+protein+Vps4+underlies+injury-induced+autophagic+impediment+and+Wallerian+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration.</a> Science Advances. 5 (2), 4971(2019).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> bioRxiv. 102, 636076(2019).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Vagnoni, A., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cAMP%2FPKA%2FKinesin-1+Axis+Promotes+the+Axonal+Transport+of+Mitochondria+in+Aging+Drosophila+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons.</a> Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+mitophagy+independence+in+the+maintenance+of+axonal+mitochondria+during+normal+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging.</a> Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).</li>
<li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+S-Transferase+Regulates+Mitochondrial+Populations+in+Axons+through+Increased+Glutathione+Oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation.</a> Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj protokoły pozwalają na solidną i powtarzalną obserwację morfologii, a także funkcji aksonów i ich synaps oddzielonych od ich ciał komórkowych u Drosophila. Test skrzydeł ułatwia obserwację obumarcia aksonów obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w PNS14, podczas gdy test antenowy ułatwia obserwację całych wiązek nerwowych aksonów znakowanych GFP i ich synaps, w celu oceny zarówno morfologii, jak i funkcji mózgu (OUN)12. Istnieją krytyczne kroki i pewne zalety dla każdego podejścia do badania morfologii, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.
Aby zaobserwować morfologię aksonów w PNS w skrzydle, można łatwo przeprowadzić eksperymenty ze względu na przezroczystość skrzydła: pozwala to ominąć sekcję i immunohistochemię. Jednak ze względu na brak mocowania, skrzydła muszą być obrazowane natychmiast po zamontowaniu14. Obecnie często używane są dwa różne sterowniki Gal4, ok371Gal4 lub dpr1Gal4, a oba odniesienia oferują różne podejścia do ilościowego określania zwyrodnienia14,26. Zaleca się rzadkie znakowanie kilku neuronów za pomocą "Analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym (MARCM)"14,31, ponieważ rozdzielczość morfologii aksonów jest bezprecedensowa. Natomiast obserwacja synaps nie jest możliwa w skrzydłach, znajdują się one w brzusznym rdzeniu nerwowym wewnątrz klatki piersiowej much. Co więcej, dodatkowe markery aksonalne nie mogą być uwidocznione za pomocą immunohistochemii: woskowaty naskórek uniemożliwia dyfuzję utrwalaczy i przeciwciał do leżącej poniżej tkanki.
Aby zaobserwować morfologię aksonów i synaps w OUN, należy przeprowadzić sekcje mózgu. Mają one tę zaletę, że za pomocą immunohistochemii można zaobserwować dodatkowe markery aksonalne i synaptyczne, a synapsy można obserwować wraz z aksonami w tym samym polu widzenia10,13. Duży zbiór scharakteryzowanych sterowników receptora węchowego (ORN) Gal4 jest łatwo dostępny32, a często OR22aGal4 jest sterownikiem z wyboru. W przypadku ablacji czułków ciała komórkowe neuronów OR22a znajdują się w 3. segmencie (ryc. 2B). Kwantyfikacja oparta na intensywności fluorescencji służy do ilościowego określenia zwyrodnienia aksonów lub synaps13. I odwrotnie, eksperymenty są czasochłonne ze względu na sekcję mózgu i barwienie przeciwciał.
Aby uwidocznić funkcję aksonalną i synaptyczną po aksotomii, optogenetyka służy do wyzwalania pielęgnacji czułków: służy jako odczyt do funkcjonalnego zachowania odciętych aksonów i ich synaps12. Obwód pielęgnacyjny i odpowiadające mu sterowniki czuciowe, między- i ruchowe Gal4 zostały dokładnie opisane29,30. GMR60E02Gal4 znakuje podzbiór neuronów czuciowych narządu Johnstona (JO), które są wymagane i wystarczające do pielęgnacji29,30. W przypadku ablacji czułków ciała komórkowe neuronów JO znajdują się w drugimsegmencie anteny (ryc. 2B). Konfigurację optogenetyczną można łatwo zbudować od podstaw lub dostosować istniejącą konfigurację. Co ważne, eksperymenty muszą być przeprowadzane w ciemnym pomieszczeniu, a muchy są w ten sposób wizualizowane za pomocą reflektora LED w podczerwieni (IR). Podczas korzystania z CsChrimson jako kanału, ważne jest, aby dostarczyć pokarmowi wszystkie trans-retinale i czerwony reflektor LED, aby aktywować neurony JO29. Alternatywnie, do aktywacji neuronów można wykorzystać kanały wrażliwe na niebieskie światło i niebieski reflektor LED lub kanał TrpA1 i temperaturę29,33. Kwantyfikacja zachowań związanych z uwodzeniem została już opisana12,29.
Kiedy testy te są wykorzystywane do specyficznego badania śmierci aksonów, ważne jest, aby pamiętać, że fenotyp zachowania morfologicznego lub funkcjonalnego powinien być solidny w czasie. Istnieją przypadki, w których śmierć aksonów prowadzi do spójnego, ale mniej wyraźnego fenotypu w zachowaniu morfologicznym34,35, a to, czy taki fenotyp przekłada się na zachowanie funkcjonalne, pozostaje do ustalenia.
Fenotypy śmierci aksonów zaobserwowano również w neuronach podczas rozwoju larw Drosophila, gdzie nerwy były raczej zmiażdżone niż uszkodzone11,23. W tym przypadku skupiliśmy się na dorosłych neuronach Drosophila, które zakończyły rozwój. W tym kontekście można łatwo zastosować interferencję RNA36 lub specyficzny tkankowo CRISPR/Cas937. Co ważne, powyższe techniki mogą być stosowane w kontekście niezależnym od śmierci aksonów: ułatwiają charakterystykę czynników utrzymania neuronów38, transportu aksonalnego39, zależnych od wieku zmian mitochondriów aksonalnych40 oraz morfologii mitochondriów aksonalnych41.

Integralność morfologiczna neuronów jest niezbędna do utrzymania funkcji układu nerwowego przez całe życie. Zdecydowana większość objętości neuronalnej jest zajmowana przez aksony1,2; W związku z tym utrzymanie przez całe życie szczególnie długich aksonów jest poważnym wyzwaniem biologicznym i bioenergetycznym dla układu nerwowego. Zidentyfikowano wiele mechanizmów wsparcia aksonalno-wewnętrznego i glejowo-zewnętrznego, zapewniających przeżycie aksonów przez całe życie. Ich upośledzenie powoduje zwyrodnienie aksonów3, co jest powszechną cechą układów nerwowych zagrożonych przez chorobę oraz przez siły mechaniczne lub chemiczne4,5. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw zwyrodnienia aksonów pozostają słabo poznane w jakimkolwiek kontekście, co sprawia, że opracowanie skutecznych metod leczenia w celu zablokowania utraty aksonów jest wyzwaniem. Opracowanie skutecznych terapii przeciwko tym schorzeniom neurologicznym jest ważne, ponieważ stanowią one ogromne obciążenie dla naszego społeczeństwa6.
Zwyrodnienie aksonów wywołane urazem służy jako prosty model do badania, w jaki sposób odcięte aksony dokonują własnego rozkładu. Odkryta i nazwana na cześć Augustusa Wallera w 1850 roku, degeneracja Wallera (WD) jest terminem zbiorczym, który obejmuje dwa odrębne, molekularnie rozłączne procesy7. Po pierwsze, po uszkodzeniu aksonów, aksony oddzielone od swoich ciał komórkowych aktywnie dokonują własnej autodestrukcji (śmierci aksonu) poprzez ewolucyjnie zachowaną kaskadę sygnalizującą śmierć aksonu w ciągu jednego dnia po urazie8. Po drugie, otaczający glej i wyspecjalizowane fagocyty angażują się i usuwają powstałe resztki aksonów w ciągu trzech do pięciu dni. Tłumienie sygnalizacji śmierci aksonu skutkuje odciętymi aksonami, które pozostają zachowane przez tygodnie9,10,11,12, podczas gdy tłumienie pochłaniania glejowego kończy się szczątkami aksonów, które utrzymują się tygodniami in vivo13,14,15.
Badania na muchach, myszach, szczurach i danio pręgowanych ujawniły kilka ewolucyjnie zachowanych i niezbędnych mediatorów sygnalizacji śmierci aksonów8. Mutanty śmierci aksonów zawierają odcięte aksony i synapsy, które nie przechodzą śmierci aksonów; Pozostają morfologicznie i funkcjonalnie zachowane przez tygodnie, przy braku wsparcia dla ciała komórkowego9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Odkrycie i scharakteryzowanie tych mediatorów doprowadziło do zdefiniowania szlaku molekularnego powodującego śmierć aksonów. Co ważne, sygnalizacja śmierci aksonu jest aktywowana nie tylko wtedy, gdy akson jest przecięty, zgnieciony lub rozciągnięty24,25; Wydaje się również, że przyczynia się do różnych zwierzęcych modeli schorzeń neurologicznych (np. gdzie aksony degenerują się w sposób niezależny od urazu4, ale z szeregiem korzystnych skutków4,8). Dlatego zrozumienie, w jaki sposób śmierć aksonu powoduje zwyrodnienie aksonów po urazie, może dostarczyć wglądu wykraczającego poza prosty model urazu; Może również zapewnić cele dla interwencji terapeutycznej.
Muszka owocowa Drosophila melanogaster (Drosophila) okazała się nieocenionym systemem sygnalizacji śmierci aksonów. Badania na muchach ujawniły cztery istotne, ewolucyjnie zachowane geny śmierci aksonów: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 i axundead (axed)12. Modyfikacja tych mediatorów – mutacje powodujące utratę funkcji hiw, dsarm i axed oraz nadekspresja dnmnat – silnie blokuje śmierć aksonów na całe życie muchy. Podczas gdy odcięte aksony typu dzikiego ulegają śmierci aksonów w ciągu 1 dnia, odcięte aksony i ich synapsy pozbawione hiw, dsarm lub axed pozostają nie tylko morfologicznie, ale także funkcjonalnie zachowane przez tygodnie. Nie wiadomo jeszcze, czy możliwe jest również zachowanie funkcjonalności poprzez wysoki poziom dmnnat.
Tutaj przedstawimy trzy proste i niedawno opracowane protokoły do badania śmierci aksonów (np. morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps w czasie) w przypadku braku wsparcia dla ciała komórki. Pokazujemy, w jaki sposób osłabiona śmierć aksonów powoduje odcięte aksony, które są morfologicznie zachowane z mutacją utraty funkcji hiw (hiw∆N) i jak osłabiona śmierć aksonu powoduje odcięcie aksonów i synaps, które pozostają funkcjonalnie zachowane przez co najmniej 7 dni z nadmierną ekspresją dnmnat (dnmnatOE). Protokoły te pozwalają na obserwację morfologii poszczególnych aksonów i synaps w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym (odpowiednio OUN i PNS)13,14, podczas gdy funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps w OUN można zobrazować za pomocą prostej konfiguracji optogenetycznej połączonej z pielęgnacją jako odczytem behawioralnym12.

<table><tbody><tr><td>Pęseta (wysoka precyzja, bardzo cienka)</td><td>EMS</td><td>78520-5</td> Nożyczki MicroPoint <td>do ablacji antenowej</td></tr><tr><td>(krawędź tnąca 5 mm)</td><td>EMS</td><td>72933-04</td><td>Uraz skrzydła</td></tr><tr><td>Probówka mikrowirówkowa 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086.0000</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, grubość 1</td><td>Thermo Scientific& handel;</td><td></td><td></td>BB02400600A113MNT0</tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>AA00008032E00MNT10</tr><tr><td>Kamera CMOS USB 2.0 o wysokiej czułości, 1280 x 1024, globalna migawka</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1240M</td><td>Konfiguracja kamery</td></tr><tr><td>Pierścień ustalający SM1 dla &Oslash; Tubusy i mocowania obiektywów 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>25mm 1/1.2" Obiektyw z mocowaniem C</td><td>Adapter Tamron</td><td>M112FM25</td><td></td></tr><tr><td>z zewnętrznymi gwintami M27 x 0,5 i wewnętrznymi gwintami SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A36</td><td></td></tr><tr><td>Asferyczny obiektyw kondensacyjny i Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Filtr długoprzepustowy Premium 25,0 mm, długość fali odcięcia: 700 nm</td> Łącznik <td>Thorlabs</td><td>FELH0700</td><td></td></tr><tr><td>SM1 (1.035"-40), gwint zewnętrzny, 0.5" długi</td><td>tubus obiektywu Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>SM1 bez gwintów zewnętrznych, długość 1", dwa pierścienie ustalające w zestawie</td><td>Thorlabs</td><td>SM1M10</td><td></td></tr><tr><td>850 nm, 900 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1200 mA</td><td>Reflektor LED</td> <td>Thorlabs</td><td>M850L3</td> IR</tr><tr><td>Łącznik SM1 (1.035"-40), Gwint zewnętrzny, 0.5" Długość Tubus</td><td>obiektywu Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>SM1 bez gwintów zewnętrznych, 2" długości, dwa pierścienie ustalające w zestawie Soczewka</td> kondensatora <td>asferycznego Thorlabs</td><td>SM1M20</td><td></td></tr> & <tr><td>Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Filtr długoprzepustowy Premium 25,0 mm, Cut-On Długość fali: 850 nm</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0850</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień ustalający SM1 do &Oslash; Tubusy i mocowania soczewek 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>660 nm, 940 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1200 mA</td><td>Thorlabs</td><td>M660L4</td><td>Czerwony reflektor LED</td></tr><tr><td>Asferyczna soczewka kondensatora i Oslash; 25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>SM1 (1.035"-40) Łącznik, gwint zewnętrzny, 0.5" Long</td><td>Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>SM1 Tubus obiektywu bez gwintu zewnętrznego, 2" długości, dwa pierścienie ustalające w zestawie</td><td>Thorlabs</td><td>SM1M20</td><td></td></tr><tr><td>15 V, 2.4 A Zasilacz ze złączem Jack 3.5 mm do jednego K- lub T-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>LED sterownik</td></tr><tr><td>LED T-Cube, 1200 mA Max Drive Prąd</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 300 mm x 12,7 mm Aluminiowa płyta stykowa, Krany M6 o podwójnej gęstości</td><td>Thorlabs</td><td>MB1530/M</td><td>Podstawa montażowa</td></tr><tr><td>&Oslash; 12,7 mm Uniwersalny uchwyt na słupek, sprężynowa śruba skrzydełkowa blokująca, L = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>UPH75/M</td><td>Mocowanie, 3x (IR LED, czerwona dioda LED, krzywka)</td></tr> <tr><td>i Oslash; Pierścień ślizgowy 1,20" do tubusów obiektywów SM1 i tulei przedłużających C-Mount,</td><td>Thorlabs</td> M4 Tap <td>SM1RC/M</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Słupek optyczny 12,7 mm, SS, śruba dociskowa M4, gwintownik M6, L = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Słupek optyczny 12,7 mm, SS, śruba dociskowa M4, gwintownik M6, L = 40 mm</td> Zacisk kątowy <td>Thorlabs</td><td>TR40/M</td><td></td></tr><tr><td>do &Oslash; Słupki 1/2", 5 mm sześciokątne</td><td>śruba</td> ze sześciokątnym <td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>M6 x 1,0 ze stali nierdzewnej, długość 16 mm, zestaw 25</td><td>Thorlabs</td><td>SH6MS16</td><td>do montażu na podstawie</td></tr><tr><td>USB-6001 14-bitowy 20 kS/s Wielofunkcyjne I/O i NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td>782604-01</td><td>Czerwony sterownik reflektora LED</td></tr><tr><td>20k Ohm 1 Gang Liniowy potencjometr do montażu na panelu</td><td>TT Electronics/BI</td><td>P230-2EC22BR20K</td><td>fintuner do wskaźnika</td></tr><tr><td>Emiter IR (860nm), 100 mA promieniowy</td><td>Osram</td><td>475-1365-ND</td> <td>wskaźnika czerwonego światła</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Misc</td></tr><tr><td>All-trans retinal</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Vwr</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merk</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 baza elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning Corp</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning Corp</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GFP kurczaka</td><td>Rockland</td><td>600-901-215</td><td>Przeciwciała</td></tr><tr><td>Goat Dylight anty-Chicken</td><td>Abcam</td><td>ab96947</td><td></td></tr><tr><td>FM7a, B</td><td>BDSC</td><td>RRID:</td>BDSC_785<td>chromosom X</td></tr><tr><td>FRT19A[hs-neo]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_1709</td><td></td></tr><tr><td>hiw[&Delta; N]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_51637</td><td></td></tr><tr><td>hs-FLP[12]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_1929</td><td></td></tr><tr><td>tuba-Gal80[LL1]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5132</td><td></td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_3605</td><td></td></tr><tr><td>20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_55135</td><td><silny>2. chromosom</silny></td></tr><tr><td>5xUAS-Gal4[12B]</td><td>Kioto</td><td>RRID:Kyoto_108492</td><td></td></tr><tr><td>5xUAS-HA::d nmnat</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_39702</td><td></td></tr><tr><td>5xUAS-mCD8::GFP[LL5]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5134</td><td></td></tr><tr><td>ase-FLP[2d]</td><td>Freeman laboratory</td><td>Neukomm et al., 2014 (PNAS)</td><td></td></tr><tr><td>CyO</td><td>BDSC</td><td>RRID:</td><td></td></tr>BDSC_2555 <tr><td>dpr1-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_25083</td><td></td></tr><tr><td>OR22a-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_9952</td><td></td></tr><tr><td>ey-FLP[6]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5577</td><td><silny>3. chromosom</silny></td></tr><tr><td>GMR60E02-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_39250</td><td></td></tr><tr><td>TM3,Sb,e</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_3644</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Zwyrodnienie aksonów jest wspólną cechą chorób neurodegeneracyjnych oraz gdy układy nerwowe są poddawane próbie przez siły mechaniczne lub chemiczne. Jednak nasza wiedza na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zwyrodnienia aksonów pozostaje ograniczona. Zwyrodnienie aksonów wywołane urazem służy jako prosty model do badania, w jaki sposób odcięte aksony dokonują własnego demontażu (śmierć aksonu). W ostatnich latach zidentyfikowano ewolucyjnie zachowaną kaskadę sygnalizującą śmierć aksonów od much do ssaków, która jest wymagana, aby oddzielony akson uległ degeneracji po urazie. I odwrotnie, osłabiona sygnalizacja śmierci aksonów powoduje morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps. W tym miejscu przedstawiamy trzy proste i niedawno opracowane protokoły, które pozwalają na obserwację morfologii aksonów, czyli funkcji aksonalnej i synaptycznej odciętych aksonów, które zostały odcięte od ciała komórki neuronalnej, u muszki owocowej Drosophila. Morfologię można zaobserwować w skrzydle, gdzie częściowe uszkodzenie powoduje śmierć aksonów obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym. Alternatywnie, morfologię aksonów można również zaobserwować w mózgu, gdzie cały pęczek nerwowy ulega śmierci aksonu wywołanej ablacją czułków. Funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps można ocenić za pomocą prostego podejścia optogenetycznego w połączeniu z postsynaptycznym zachowaniem pielęgnacyjnym. Przedstawiamy przykłady wykorzystujące mutację powodującą utratę funkcji wysokiego drutu i nadmierną ekspresję dnmnat, które mogą opóźnić śmierć aksonów o tygodnie lub miesiące. Co ważne, protokoły te mogą być stosowane poza obrażeniami; Ułatwiają one charakterystykę neuronalnych czynników utrzymania, transportu aksonalnego i mitochondriów aksonalnych.

Powyżej opisaliśmy trzy metody badania morfologii i funkcji przerwanych aksonów oraz ich synaps. Pierwsza metoda umożliwia obserwację pojedynczych aksonów w układzie nerwowym obwodowym (PNS) z wysoką rozdzielczością. Wymaga ona klonów generowanych techniką MARCM14,31. W tym przypadku przeprowadziliśmy krzyżówki w celu wygenerowania klonów MARCM typu dzikiego oraz mutantów highwire (Rysunek 4A). Proste nacięcie w połowie skrzydła indukuje uszkodzenie aksonów neuronów znajdujących się dystalnie (np. po zewnętrznej stronie skrzydła), podczas gdy neurony proksymalne (np. między miejscem nacięcia a klatką piersiową) pozostają nieuszkodzone. Podejście to umożliwia jednoczesną obserwację obumierania aksonów oraz nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym (Rysunek 1A, Rysunek 4B). Zastosowaliśmy tło genetyczne skutkujące niewielką liczbą klonów znakowanych GFP (np. dwa w każdym eksperymencie14). Przedstawiamy przykłady aksonów typu dzikiego 1 oraz 7 dni po uszkodzeniu, aby ukazać odpowiednio: aksony kontrolne, aksony w fazie obumierania oraz fragmenty aksonalne usuwane przez otaczającą glej. Ponadto powtórzyliśmy procedurę uszkodzenia aksonów u mutantów highwire, analizując wyniki 7 dni po uszkodzeniu.
Nieuszkodzone skrzydła kontrolne zawierają dwa klony typu dzikiego, a tym samym dwa aksony typu dzikiego oznakowane GFP (Rysunek 4B, typ dziki, kontrola nieuszkodzona). Jeden dzień po przecięciu środkowej części skrzydła za pomocą mikronożyczek, dochodzi do śmierci aksonów w aksonach oznakowanych GFP, których ciała komórkowe znajdują się dystalnie względem miejsca cięcia, podczas gdy aksony z ciał komórkowych zlokalizowanych proksymalnie służą jako kontrola wewnętrzna w obrębie tego samego pęczka nerwowego (Rysunek 4B, typ dziki, 1 dzień po urazie). Należy zwrócić uwagę na ślad debris aksonalnych w górnej części wskazany strzałką. 7 dni po urazie aksonalnym, debris aksonalne oznakowane GFP zostaje usunięte przez otaczającą gleję, podczas gdy nieuszkodzone aksony kontrolne oznakowane GFP pozostają w pęczku nerwowym (Rysunek 4B, typ dziki, 7 dni po urazie, strzałka). W przeciwieństwie do tego, aksony mutantów highwire, które zostały przecięte 7 dni wcześniej, pozostają zachowane morfologicznie, co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami11,14 (Rysunek 4B, highwire, 7 dni po urazie, strzałka). Wyniki te demonstrują wysoką rozdzielczość wizualną skrzydła Drosophila. Śmierć aksonów może być obserwowana obok nieuszkodzonych kontroli w tym samym pęczku nerwowym. Podczas gdy aksony typu dzikiego ulegają śmierci aksonalnej w ciągu 1 dnia po urazie, a powstałe debris zostaje usunięte w ciągu 7 dni, mutanty highwire z deficytem śmierci aksonalnej pozostają zachowane morfologicznie przez 7 dni.
<img alt="Schemat analizy ekspresji genetycznej i porównanie regeneracji nerwów po urazie w typie dzikim i u mutantów highwire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Metoda badania obumierania aksonów neuronów sensorycznych znakowanych GFP w skrzydle. (A) Schemat krzyżówek w celu wytworzenia klonów typu dzikiego i highwire w skrzydle (odpowiednio pokolenie P0 i F1). Samice dziewice znajdują się po lewej stronie, samce po prawej. Szczegóły genotypów znajdują się w Tabeli materiałów. (B) Przykłady aksonów znakowanych GFP w grupie kontrolnej i po urazie. Pole widzenia zostało wskazane na (Rycynie 1A). Od lewej do prawej: aksony kontrolne typu dzikiego bez urazu, aksony typu dzikiego 1 dzień po urazie, aksony typu dzikiego 7 dni po urazie oraz aksony mutantów highwire 7 dni po urazie. Strzałki wskazują przerwane aksony, pasek skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Druga metoda opisuje sposób wizualizacji całych pęczków aksonów projektujących do OUN, gdzie tworzą one synapsy, które należą do neuronów znajdujących się w lewej i prawej antenie (Rycina 2A-C). W tym przypadku przeprowadzono krzyżówki w celu wygenerowania klonów MARCM typu dzikiego oraz mutantów highwire (Rycina 5A). Nieuszkodzone, znakowane GFP aksony oraz ich synapsy mogą być wizualizowane w czasie od kilku dni do kilku tygodni w przypadku braku urazu (Rycina 5B, typ dziki, nieuszkodzona kontrola). Alternatywnie, zwierzęta mogą zostać poddane ablacji 3go segmentu anteny, a następnie można obserwować w czasie (od kilku godzin do kilku dni) przerwane, znakowane GFP aksony i ich synapsy. Skupiono się na czasie 7 dni po ablacji anteny, ponieważ w tym punkcie czasowym aksony i ich synapsy uległy obumarciu, a powstałe szczątki zostały usunięte przez otaczającą gleję. Jeśli przeprowadzona zostanie jednostronna ablacja prawej anteny, prawy pęczek aksonów zostaje przerwany, ulega rozpadowi, a powstałe szczątki są całkowicie usuwane 7 dni po urazie (Rycina 5B, typ dziki, ablacja jednostronna, 7 dni po urazie, strzałki), co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami13. Alternatywnie można usunąć zarówno prawą, jak i lewą antenę, co spowoduje przerwanie obu pęczków aksonów, a po 7 dniach od urazu aksony i ich synapsy znikają (Rycina 5B, typ dziki, ablacja obustronna, 7 dni po urazie, strzałka). W przeciwieństwie do tego, jednostronna ablacja prawej anteny u mutantów highwire prowadzi do zachowania przerwanych aksonów 7 dni po urazie, co jest zgodne z wcześniejszymi ustaleniami11,14 (Rycina 5B, highwire, ablacja jednostronna, 7 dni po urazie, strzałka). Wyniki te wykazują, że przerwane aksony typu dzikiego ulegają obumarciu, a powstałe szczątki są usuwane w ciągu 7 dni, podczas gdy u mutantów highwire z deficytem obumierania aksonów proces ten nie zachodzi, a aksony pozostają zachowane morfologicznie przez 7 dni.
<img alt="Schemat inżynierii genetycznej z genotypami Drosophila; obrazy mikroskopowe regeneracji po ablacji neuronów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Podejście do badania obumierania aksonów neuronów sensorycznych znakowanych GFP w mózgu. (A) Schemat krzyżówek w celu uzyskania klonów typu dzikiego oraz highwire w mózgu (odpowiednio pokolenie P0 i F1). Samice dziewice znajdują się po lewej stronie, samce po prawej. Szczegóły genotypów znajdują się w Tabeli materiałów. (B) Przykłady aksonów znakowanych GFP w grupie kontrolnej i uszkodzonych. Od lewej do prawej: kontrole typu dzikiego bez uszkodzeń, typ dziki 7 dni po jednostronnej ablacji anteny, typ dziki 7 dni po obustronnej ablacji anteny oraz mutanty highwire 7 dni po jednostronnej ablacji anteny. Strzałki wskazują przerwane pęczki aksonów, pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Trzecia metoda umożliwia obserwację zachowania funkcji przerwanych aksonów oraz ich synaps w OUN. Opiera się ona na manipulacji podzbiorem neuronów JO zlokalizowanych w 2nd segmencie anteny, które są wystarczające do wywołania czyszczenia anteny. Ekspresja przesuniętej w stronę czerwieni channelrhodopsyny (CsChrimson) w neuronach JO, w połączeniu z suplementacją dietetyczną all-trans-retinalu, jest wystarczająca do wywołania prostego postsynaptycznego zachowania czyszczenia po ekspozycji na czerwone światło12,30. W tym przypadku przeprowadziliśmy krzyżówki w celu uzyskania neuronów JO typu dzikiego oraz neuronów JO z nadekspresją dnmnat (dnmnatOE) (Rycina 6A). Muchy typu dzikiego oraz muchy posiadające neurony JO z osłabioną śmiercią aksonów (dnmnatOE) wykazują silne zachowanie czyszczenia przed urazem. Jednak 7 dni po urazie (np. obustronnej ablacji 2nd segmentu anteny), w przypadku much typu dzikiego optogenetyka nie wywołuje już czyszczenia z powodu indukowanej urazem degeneracji aksonów i synaps, podczas gdy zwierzęta z osłabioną śmiercią aksonów nadal czyszczą anteny (Rycina 6B, Film 1,2). Osłabiona śmierć aksonów jest zatem w stanie funkcjonalnie zachować przerwane aksony i ich synapsy przez 7 dni.
<img alt="Schematy konstruktów genetycznych i wykresy analizy behawioralnej u Drosophila, pokazujące reakcję na czerwone światło." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Podejście do wizualizacji funkcji aksonalnych i synaptycznych po aksotomii. (A) Schematy krzyżowań w celu uzyskania neuronów sensorycznych JO typu dzikiego oraz nadekspresujących dnmnat (odpowiednio generacje P0 i F1). Samice dziewice znajdują się po lewej stronie, samce po prawej. Szczegóły genotypów znajdują się w Tabeli materiałów. (B) Indywidualne etogramy zachowań pielęgnacyjnych indukowanych optogenetycznie. Góra: indywidualne etogramy much typu dzikiego przed urazem oraz 7 dni po urazie (kolor niebieski). Dół: indywidualne etogramy much nadekspresujących dnmnat (dnmnatOE) w neuronach JO przed urazem oraz 7 dni po urazie (kolor czerwony). Każdy przedział wskazuje co najmniej jedno zachowanie pielęgnacyjne w ciągu 1 s. Czarna linia oznacza sumę wszystkich przedziałów. (C) Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, p &gt; 0,001 (jednoczynnikowa ANOVA, porównania wielokrotne z testem post hoc Tukeya). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Film 1: Reprezentatywne zachowanie pielęgnacyjne typu dzikiego wywołane optogenetycznie przed oraz 7 dni po ablacji czułków. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_1_wild_type.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Reprezentatywne zachowanie pielęgnacyjne wywołane optogenetycznie u much z nadekspresją dnmnat w neuronach JO przed oraz 7 dni po ablacji czułków. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_2_nmnat.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Ogólnym celem tego protokołu uszkodzenia Drosophila jest obserwacja zarówno zachowania morfologii aksonów i synapty, jak i funkcji synaptycznych aksonów i ich synaps. Testy te mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania czynników utrzymania neuronów, badania transportu aksonalnego lub analizy organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach. Test częściowego uszkodzenia skrzydła pozwala na obserwację uszkodzonych aksonów ulegających zwyrodnieniu obok nieuszkodzonych aksonów kontrolnych w tym samym pęczku nerwowym w skrzydle Drosophila.Ten test obrażeń można łatwo przećwiczyć wcześniej u much typu dzikiego, wykonując cięcie mniej więcej na środku skrzydła za pomocą mikronożyczek. Uraz wewnętrzny pozwala na ocenę morfologii aksonów i za pomocą optogenetyki do wizualizacji funkcjonalnego zachowania aksonów i ich synaps. Ablacja czułka wymaga pewnych rąk.Zaleca się również wcześniejsze przećwiczenie usuwania czułków u much typu dzikiego. W przypadku uzależnienia, każda dostępna konfiguracja optogenetyczna jest odpowiednia do aktywacji neuronów w locie z kapeluszem. W przeciwnym razie prostą konfigurację można łatwo zbudować od podstaw.Na początek użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu do wykonania krzyżówek w temperaturze pokojowej. Przenoś pokolenie P0 do nowych fiolek co trzy do czterech dni. Świeżo zamknięte dorosłe potomstwo F1 należy codziennie zbierać do nowych fiolek i starzać je przez siedem do 14 dni.Po znieczuleniu użyj mikronożyczek, aby przeciąć wewnętrzną żyłę skrzydła mniej więcej na środku skrzydła. Użyj jednego skrzydła do leczenia kontuzji, a drugiego skrzydła jako kontroli dopasowanej do wieku. Zastosuj jedną kontuzję na skrzydło i upewnij się, że zranisz 15 skrzydeł.Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Następnie za pomocą pipety rozprowadź 10 mikrolitrów oleju halowęglowego 27 wzdłuż całego szkiełka podstawowego. Jeden lub siedem dni po urazie użyj mikronożyczek, aby odciąć rannego, a także nieuszkodzone skrzydło kontrolne.Użyj pęsety, aby chwycić skrzydło pośrodku, zamontuj maksymalnie cztery skrzydła w oleju halowęglowym 27 i przykryj je szkiełkiem osłonowym. Obrazy neuronów oznaczonych GFP w skrzydle można łatwo uzyskać za pomocą obracającego się dysku. Jednak czas akwizycji musi być wykonany w czasie krótszym niż osiem minut po zamontowaniu skrzydeł, ponieważ czasza nie jest zamocowana.Natychmiast zobrazuj skrzydło za pomocą mikroskopu z obracającym się dyskiem. Zdobądź serię przekrojów optycznych wzdłuż osi Z z krokiem co 0,33 mikrometra i skompresuj stosy Z w jeden plik do kolejnych analiz. Skrzyżuj pięć dziewiczych samic i pięć samców z odpowiedniego genotypu i zbierz pokolenie F1, tak jak poprzednio.Po znieczuleniu użyj pęsety, aby oblamować prawy trzeci segment czułka do jednostronnej ablacji lub zarówno lewy, jak i prawy trzeci segment czułka do ablacji obustronnej. Powoduje to usunięcie ciał komórek neuronalnych znakowanych GFP, podczas gdy ich projekcje aksonalne pozostają w OUN. W zależności od neuronów znakowanych GFP użytych w technice, ważne jest, aby wiedzieć, czy ciała komórkowe znajdują się w trzecim, czy w drugim segmencie anteny do późniejszego testu urazu.Odzyskaj muchy w fiolkach zawierających żywność. Po znieczuleniu użyj pęsety, aby chwycić szyję i innej pęsety, aby przymocować klatkę piersiową. Delikatnie odciągnij szyję i głowę od klatki piersiowej.Za pomocą pęsety, która została zanurzona w roztworze utrwalającym, przenieś wszystkie głowice do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego 4% paraformaldehydu i 0,1 trytonu X100 w PBS. Zamocuj głowice na 20 minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę mikrowirówki na lodzie, a głowice grawitują do dna probówki mikrowirówki.Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać jeden mililitr buforu płuczącego zawierającego 0,1% triton X100 w PBS. Umieść rurkę na obracającym się kole w temperaturze pokojowej, aby myć przez dwie minuty. Powtórz pranie jeszcze cztery razy, aby usunąć resztki roztworu utrwalającego.Po przygotowaniu mózgów zaopatrz się w szkiełko podstawowe, przyklej do niego taśmę laboratoryjną i wytnij z taśmy kształt przypominający literę T. Użyj końcówki do pipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów w miejscu, w którym odcięto trzy milimetry końcówki, aby poszerzyć otwór pipety. Odpipetować mózg zawierający odczynnik zapobiegający blaknięciu na szkiełko i przykryć mózgi szkiełkiem podstawowym.Użyj gliny, aby przygotować dwie małe równe bułki. Upewnij się, że gliniane rolki nie są wyższe niż wysokość szklanego zjeżdżalni. Przyklej gliniane bułki do szkiełka i umieść kanapkę z mózgiem zawierającą szkiełko nakrywkowe na glinianych bułkach.Postępuj zgodnie z rękopisem. Aby przygotować muchy do optogenetyki, najpierw rozpuść pokarm dla much w kuchence mikrofalowej. Po ostygnięciu pokarmu, przed zestaleniem, dodaj 20 milimoli całego trans-Retinalu w etanolu do końcowego stężenia 200 mikromolowych.Dobrze wymieszaj i natychmiast wlej pokarm do pustych fiolek. Przykryj fiolki zawierające zestalony pokarm zatyczkami lub wacikami. Owinąć fiolki folią aluminiową.Następnie należy przechowywać fiolki zawierające żywność w ciemnym, chłodnym pomieszczeniu. Użyj pięciu dziewiczych samic i pięciu samców z odpowiedniego genotypu, aby wykonać krzyżówki w temperaturze pokojowej i zebrać pokolenie F1, jak poprzednio, w aluminiowych fiolkach zawierających 200 mikromolowców, wszystkie trans-Retinal w pokarmie dla much. Następnie zbierz muchy, stukając je z fiolek zawierających żywność do pustej fiolki bez jedzenia.Schłodzić fiolkę w wodzie zawierającej lód przez około 30 sekund. Muchy zasypiają. Teraz szybko umieść pojedyncze muchy w małych komorach pokrytych szkiełkiem nakrywkowym, aby przeprowadzić optogenetykę.W ciemnym pomieszczeniu wykonaj protokół składający się z 30 sekund, w których czerwone światło jest nieobecne, a następnie 10 sekund ekspozycji na czerwone światło z częstotliwością 10 Hz. Powtórz tę procedurę łącznie trzy razy, a następnie w dodatkowym 30-sekundowym odstępie, gdy czerwone światło jest nieobecne. Zbieraj pojedyncze muchy z każdej komory na podkładkach z dwutlenku węgla.Aby narazić je na uraz czułka, należy dokonać ablacji zarówno lewego, jak i prawego drugiego segmentu czułka. Powoduje to usunięcie ciał komórkowych neuronów narządów Johnstona, podczas gdy wypustki aksonalne pozostają w OUN. Odzyskaj muchy w pokrytych aluminium fiolkach zawierających 200 milimolowych wszystkich trans-retinal.W odpowiednich punktach czasowych, na przykład siedem dni po ablacji czułków, poddaj muszki kolejnemu testowi pielęgnacyjnemu. W protokole tym przedstawiono trzy metody badania morfologii i funkcji odciętych aksonów i ich synaps. Pierwsza metoda pozwala na wysokorozdzielczą obserwację poszczególnych aksonów w obwodowym układzie nerwowym.Schematyczne skrzyżowania do generowania klonów typu dzikiego i wysokiego drutu w skrzydle są pokazane tutaj. Kontrola w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP jest również przedstawiona za pomocą strzałek wskazujących odcięte aksony. Przedstawiono drugie podejście do badania śmierci aksonów neuronów czuciowych znakowanych GFP w mózgu.Schematyczne krzyżówki do generowania klonów typu dzikiego i highwire w mózgu są pokazane tutaj. Przykłady kontroli w uszkodzonych aksonach oznaczonych GFP są przedstawione ze strzałkami wskazującymi odcięte wiązki aksonów. Trzecia metoda demonstruje podejście do wizualizacji funkcji aksonalnych i synaptycznych po aksotomii.Schematyczne krzyżowanie w celu wygenerowania neuronów czuciowych narządów Johnstona typu dzikiego i dnmnat z nadekspresją jest pokazane tutaj. Muchy typu dzikiego to muchy zawierające neurony narządów Johnstona z osłabioną śmiercią aksonów. Obaj zachowywali silne zachowanie pielęgnacyjne przed kontuzją.Jednak siedem dni po urazie, pielęgnacja nie została wywołana przez optogenetykę u much typu dzikiego, podczas gdy zwierzęta z osłabioną śmiercią aksonów kontynuowały pielęgnację. Tutaj używamy mutacji utraty funkcji lub naszej ekspresji genów, aby zaobserwować zachowanie morfologii aksonów lub funkcji synaptycznej. Można zastosować inne metody modyfikacji, takie jak interferencja RNA knock down lub specyficzne tkankowo nokauty za pośrednictwem CRISPR-Cas9.Metody te mogą być stosowane w kontekście niezależnym od urazu. Pozwalają one na obserwację i charakterystykę czynników utrzymania neuronów podczas starzenia, transportu aksonalnego i organelli aksonalnych w nienaruszonych aksonach.

morphological-functional-evaluation-axons-their-synapses-during-axon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Poznaj metody oceny morfologii i funkcji aksonów oraz synaps podczas degeneracji w Drosophila melanogaster. Protokoły te pozwalają badać czynniki utrzymania neuronów i transport aksonalny.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów