Dwa różne paradygmaty preferencji miejsca w czasie rzeczywistym wykorzystujące optogenetykę w brzusznym obszarze nakrywki myszy
February 12th, 2020
Tutaj prezentujemy dwa łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku dla paradygmatów preferencji miejsca z wykorzystaniem optogenetyki u myszy. Korzystając z tych dwóch różnych konfiguracji, zachowania związane z preferencjami i unikaniem mogą być solidnie oceniane w ramach tego samego aparatu z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową oraz w prosty sposób.
Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół oceny nagradzających lub awersyjnych właściwości stymulacji genetycznej określonego obszaru mózgu. Technika ta może szybko zareagować, jeśli stymulacja określonych komórek jest satysfakcjonująca lub awersyjna. Opisujemy konfigurację do stymulacji brzusznego obszaru nakrywki, ale nasze protokoły można łatwo dostosować do zmiany określonych parametrów w odniesieniu do różnych badanych regionów.
Na początek użyj jednopłytkowych mikrokontrolerów do sterowania źródłem lasera. Załaduj skrypt na płytkę mikrokontrolera za pomocą odpowiedniego połączeniowego do komputera. Skrypt zawiera zewnętrzną modulację pochodzącą z oprogramowania śledzącego przez skrzynkę TTL oraz wyjście do lasera w celu kontrolowania parametrów stymulacji.
Użyj sieciowego, aby podłączyć skrzynkę TTL do płyty. Upewnij się, że laser jest ustawiony na sterowanie za pomocą modulacji zewnętrznej i podłącz laser do płyty za pomocą FC/PC. Podłącz odpowiednie piny do uziemionych części płytki.
Aby podłączyć źródło lasera do światłowodu, najpierw podłącz źródło lasera do złącza obrotowego. Podłącz krosowy do złącza obrotowego. Ustabilizuj złącze obrotowe nad aparatem, ale poza obszarem nagrywania.
Upewnij się, że długość światłowodowego jest odpowiednia, aby mysz mogła bez trudu poruszać się na arenie. Aby skalibrować ustawienie areny, użyj linijki, aby zmierzyć określoną część aparatu fizycznego. W oprogramowaniu narysuj linię odpowiadającą mierzonej części.
Na karcie Draw Scale to Calibrate (Rysuj skalę do kalibracji) wprowadź znaną już wartość. Zaprojektuj arenę, narysuj obszar, w którym zostanie zarejestrowany ruch myszy. Utwórz strefy, narysuj strefy, które ostatecznie zostaną przypisane jako sparowane laserowo, niesparowane laserowo i neutralne.
Naciśnij przycisk Zatwierdź ustawienie, aby zweryfikować ustawienia i upewnić się, że nie ma sprzecznych parametrów, na przykład stref poza areną. Upewnij się, że kontrola sprzętowa jest włączona i ustaw czas eksperymentu na 30 minut na opcję powtarzania do w ustawieniach pola referencyjnego. Przypisz komorę jako sparowaną laserowo, w której wejście myszy spowoduje wyzwolenie sygnału TTL przez oprogramowanie śledzące do płytki mikrokontrolera przy ustawieniach stanu.
Aby zmodyfikować konfigurację dla podejścia opartego na preferencjach przedziału neutralnego, po ustawieniu areny i czasu przypisz obie strefy A i B jako sparowane laserowo, dodając, gdy punkt środkowy znajduje się w dowolnej ze stref A i strefy B dla pola warunków związanego z ustawieniami dla przedziałów A i B. Aby skonfigurować ustawienia wykrywania, użyj manekina przypominającego mysz. Umieść manekina w jednej komorze aparatu i użyj automatycznego ustawienia z dynamicznym odejmowaniem.
Wyjmij smoczek i umieść go w przeciwległej komorze. Upewnij się, że manekin jest w pełni wykryty. Umieść manekina w komorze sparowanej laserowo.
Aby sprawdzić, czy stymulacja działa, rozpocznij akwizycję przy użyciu wcześniej skonfigurowanych ustawień kontroli próbnej i sprawdź, czy stymulacja została wyzwolona tak, jak powinna. Następnie umieść manekina w niesparowanej lub neutralnej komorze i sprawdź, czy stymulacja została zatrzymana. Użyj pokrętła na laserze, aby ustawić moc lasera na 10 miliwatów.
Podłącz implant światłowodowy do patchcordu światłowodowego za pomocą ceramicznej tulei i umieść mysz w neutralnej komorze aparatu trzykomorowego. Poczekaj, aż mysz zostanie wykryta przez oprogramowanie. Usuń pionowe drzwi przesuwne uniemożliwiające zwierzęciu wejście do głównych komór.
Pozwól zwierzęciu na swobodną eksplorację bez żadnych zakłóceń. Cały eksperyment z preferencjami miejsca w czasie rzeczywistym odbywa się w ośmiu sesjach. Myszy DAT-Cre, którym wstrzyknięto wirusa AAV rodopsyny kanałowej EYFP w brzuszną część nakrywki, przetestowano pod kątem celowania w neurony dopaminergiczne.
Myszy spędzały średnio około 70% swojego czasu w przedziale sparowanym laserowo, w przeciwieństwie do niesparowanego przedziału na poziomie 20%, a neutralnego w przedziale na 10%Odwrotny fenotyp behawioralny zaobserwowano u myszy Vglut2-Cre, którym wstrzyknięto rodopsynę kanałową AAV EYFP w brzusznym obszarze nakrywki. Myszy unikały przedziału sparowanego ze stymulacją i spędzały więcej czasu w niesparowanym. Podczas piątego i ósmego dnia uwarunkowanych reakcji myszy nie wykazywały wyraźnego unikania wcześniej sparowanego przedziału.
Aby jeszcze bardziej zademonstrować nagradzającą lub awersyjną rolę określonych neuronów, opisana metoda może być uzupełniona innymi metodami, takimi jak paradygmaty operonowe lub substymulacja fotogenetyczna. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z wirusami i podczas korzystania ze źródeł laserowych.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia dwa protokoły paradygmatów preferencji miejsca przy użyciu optogenetyki u myszy, umożliwiające ocenę zachowań preferencyjnych i unikania z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowań
- Optogenetyka
Tło
- Rozumienie właściwości stymulacji mózgu jako nagradzających i odstraszających jest kluczowe w neuronaukach.
- Optogenetyka pozwala na precyzyjną kontrolę aktywności neuronów.
- Paradygmaty preferencji miejsca są powszechnie stosowane do oceny reakcji behawioralnych na stymulatory.
- To badanie koncentruje się na brzusznym obszarze siatkowatym i jego roli w przetwarzaniu wzmacniania.
Cel badania
- Opracowanie protokołów do oceny wpływu stymulacji optogenetycznej na zachowanie myszy.
- Ocenienie, jak konkretna stymulacja neuronalna wpływa na preferencje i unikanie.
- Dostarczenie elastycznego setupu, który można dostosować do różnych obszarów mózgu.
Stosowane metody
- Wykorzystanie mikrokontrolerów jednopłytkowych do kontroli stymulacji laserowej.
- Kalibracja aren eksperymentalnych dla dokładnego śledzenia ruchów myszy.
- Implementacja sygnałów TTL do synchronizacji stymulacji z zachowaniem myszy.
- Ocenienie reakcji behawioralnych w wielu sesjach z różnymi genotypami myszy.
Główne wyniki
- Myszy DAT-Cre wykazywały preferencję dla przedziału sparowanego z laserem, spędzając tam 70% czasu.
- Myszy Vglut2-Cre wykazywały unikanie przedziału sparowanego z laserem.
- Reakcje behawioralne różniły się w różnych dniach testowania.
- Metoda może być uzupełniona innymi technikami dla dalszej walidacji.
Wnioski
- Protokoły zapewniają niezawodną metodę badania wpływu konkretnej stymulacji neuronalnej na zachowanie.
- Wyniki wskazują na odrębne fenotypy behawioralne w oparciu o tło genetyczne.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć te odkrycia przy użyciu dodatkowych metodologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Assessing the rewarding or aversive properties of neuronal stimulation is critical for target validation in neuroscience-driven drug discovery. Real-time place preference paradigms enable rapid, causal interrogation of specific neural circuits, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This approach provides quantitative behavioral readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables causal testing of whether stimulation of a defined neuronal population produces reward or aversion phenotypes.
- Operational Value: Provides real-time, quantitative behavioral readouts with high temporal resolution to support hypothesis interrogation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking neuronal activation to measurable behavioral outputs relevant to neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized, reproducible behavioral assay for screening neuromodulatory targets using optogenetic stimulation.
- Quantitative Output: Generates time-in-compartment metrics that serve as dependent variables for evaluating stimulation effects across genotypes or conditions.
- Scalability: Protocol can be adapted to different brain regions and stimulation parameters, enabling cross-target screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventral tegmental area stimulation models mesolimbic pathway function, relevant to reward-related disorders and addiction therapeutics.
- Translational Continuity: Real-time behavioral readouts bridge acute neuromodulation studies with longer-term conditioned place preference assessments.
- Mechanistic De-risking: Helps distinguish direct neuronal effects from compensatory network responses, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where circuit-level target validation precedes lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining if optogenetic activation of specific neurons drives reward or aversion behaviors.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating neuromodulatory targets across different genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (time spent in laser-paired, unpaired, neutral compartments) for statistical comparison of stimulation effects.
- Translational Research: Connects acute neuronal stimulation effects to behavioral phenotypes with relevance to preclinical models of reward processing.
- Enterprise Reuse: Framework can be standardized across labs and adapted to various brain regions, promoting platform-level reuse in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into neuronal causality, reducing false positives in target selection.
- Operational Value: Enables high-throughput behavioral assessment with automated tracking and real-time stimulation control.
- Strategic Value: Improves confidence in target modulation strategies, supporting better resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral validation of circuit-specific effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral vector delivery, and stereotaxic surgery for precise neuronal targeting.
- Depends on integrated hardware including microcontrollers, lasers, rotary joints, fiber optics, and behavioral tracking software.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and data analysis groups for consistent setup and calibration.
- Must account for variability in opsin expression, fiber placement, and laser power delivery across subjects.
- Limited to acute behavioral effects; does not assess chronic adaptation or compensatory mechanisms without complementary longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
