Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

Barwienie immunologiczne jest szeroko stosowane w badaniach biomedycznych w celu określenia lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Multipleksowe barwienie immunologiczne może wykryć wiele celów na tej samej próbce przy użyciu różnych przeciwciał pierwszorzędowych. Zaletą tej metody jest zastosowanie powszechnie dostępnych w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej przeciwciał, co pozwala na barwienie immunologiczne przy użyciu dwóch lub więcej nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza.

Procedurę zademonstrują Sophia Zheng, doktorantka, i Qiongxia Lyu, wizytujący naukowiec z mojego laboratorium. Przed barwieniem należy odwoskować i ponownie nawodnić szkiełka zatopione w parafinie utrwalone w formalinie, zanurzając je w każdym roztworze zgodnie ze wskazaniami. Po drugim zanurzeniu w wodzie destylowanej umieść szkiełka w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na dnie pudełka z końcówką do pipet z pokrywką i umieść pudełko w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W i mocy 75% na osiem minut.

Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej przed umyciem szkiełek trzema pięciominutowymi płukaniami świeżego PBST w słoiku z koplinu. W celu zablokowania wszelkich niespecyficznych miejsc wiązania, po ostatnim praniu należy strząsnąć nadmiar PBST z każdego szkiełka i przykryć szkiełka odpowiednią ilością odpowiedniego roztworu blokującego. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze wytrząsnąć nadmiar roztworu blokującego z każdego szkiełka i dodać 250 mikrolitrów pierwszego badanego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej próbki.

Aby zapobiec wysychaniu próbek, szkiełka mogą być przykryte kawałkiem folii parafinowej. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze, umyj szkiełka trzykrotnie świeżym PBST przez pięć minut na mycie. Strząśnij nadmiar PBST, a następnie szybko przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych na jednogodzinną inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdej szkiełka. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST. Następnie strząśnij nadmiar PBST i przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu fluoroforu i tyramidu.

Minutę później zanurz szkiełka w świeżym PBST, a następnie trzy dwuminutowe mycia w świeżym PBST. Po ostatnim umyciu nałóż kilka kropli roztworu glicerol-PBS jeden do jednego na skrawki i sprawdź obecność sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby usunąć pierwszy kompleks przeciwciał, umieść szkiełka oznaczone przeciwciałami w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na co najmniej osiem minut, jak pokazano.

Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie umyj szkiełka trzykrotnie PBST przez pięć minut na mycie. Aby wybarwić drugie białko docelowe będące przedmiotem zainteresowania, po zablokowaniu niespecyficznego wiązania, jak pokazano, oznacz każdą próbkę 250 mikrolitrami drugiego podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w świeżym PBST na jedno przemycie, a następnie przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdej szkiełka. Aby opracować sygnał dla drugiego białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania, po trzech płukaniach PBST, potraktuj szkiełka tyramidem sprzężonym z fluoroforem w innym spektrum fluorescencji. Aby zatrzymać rozwój sygnału tyramidu, zanurz szkiełka w PBST.

Następnie wybarwić próbki odpowiednim barwnikiem jądrowym. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, każdy szkiełko znakowane barwnikiem jądrowym należy zamocować kroplą odpowiedniego podłoża mocującego w szkiełku nakrywkowym. Użyj obiektywu 4X, aby zlokalizować tkankę na szkiełku.

Przełącz się na obiektyw 10X do obrazowania i dostosuj czas ekspozycji do 100 do 400 milisekund przy źródle światła o intensywności od 40 do 80%. Następnie uzyskaj obrazy w każdym kanale bez przesuwania stołu montażowego. Obrazy z każdego kanału można łączyć w celu utworzenia multipleksowego obrazu fluorescencyjnego.

Bez usuwania między pierwszym i wtórnym barwieniem przeciwciał, drugie barwienie hydroksylazy tyrozynowej odbierze sygnały z pierwszego docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania, co spowoduje fałszywie dodatnie barwienie hydroksylazą tyrozyny, na przykład w tej próbce w korze nadnerczy. Aby usunąć reaktywność krzyżową przeciwciał w peroksydazie chrzanowej z pierwszego barwienia immunologicznego, można przeprowadzić jednominutowe i ośmiominutowe usuwanie za pośrednictwem mikrofal, co daje czyste wyniki podwójnego barwienia. W ujemnych próbkach kontrolnych nie wychwytuje się żadnego istotnego sygnału.

Ośmiominutowe oddzielanie we wrzącym buforze cytrynianowym jest również wystarczające do wyeliminowania reaktywności krzyżowej przeciwciał dla wielu przeciwciał powszechnie stosowanych w nadnerczach. W niektórych przypadkach słaby sygnał fałszywie dodatni jest nadal wykrywalny, a wydłużenie czasu leczenia mikrofalowego o 20 minut nadal może nie usunąć całkowicie reaktywności krzyżowej przeciwciał. Podczas obrazowania fluorescencyjnego ważne jest, aby nie przesuwać stolika podczas przełączania kanałów.

Może być jednak konieczne ponowne ustawienie ostrości w celu uzyskania wyraźnych obrazów każdego kanału. Dla każdego kanału należy dostosować czas ekspozycji, aby upewnić się, że sygnały są odpowiednio naświetlone i nie ma prześwietlonych pikseli lub obszarów na obrazach. Podczas procedury barwienia ważne jest, aby szkiełka były nawilżone po dewoskowaniu i Szkiełka można kilkakrotnie zdjąć przy użyciu tych samych metod usuwania, aby umożliwić barwienie multipleksowe.