Name: Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Naucz się multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy z wykorzystaniem podgrzewania w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramidu. Ta metoda eliminuje krzyżową reaktywność przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH R00 HD032636.

1. Barwienie pierwszym przeciwciałem
<ol>
	<li>Odwoskuj i ponownie uwodnij szkiełka FFPE w ciągu 5 minut przeznaczonych na każdy z następujących etapów: ksylen lub równoważne odczynniki 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x i woda destylowana 2x, 
	UWAGA: Szkiełka powinny pozostać wilgotne, począwszy od tego etapu ponownego nawodnienia, aż do montażu w ostatnim kroku.</li>
	<li>W celu opcjonalnego pobrania antygenu umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na 8 minut. Aby roztwór pozostał w stanie wrzenia, umieść szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm3 (szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Następnie wyjmij pudełko z końcówkami do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Przenieść szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% polisorbatem 20/80). Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli nie przejdziesz od razu do następnego kroku, przechowuj szkiełka na tym etapie z PBST w słoiku Coplin w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni, jeśli nie przechodzisz natychmiast do następnego kroku.</li>
	<li>Do przygotowania roztworu blokującego należy użyć normalnej surowicy drugorzędowego gatunku gospodarza przeciwciała jako odczynnika blokującego. Można również stosować inne komercyjne odczynniki blokujące. W przypadku stosowania normalnej surowicy zastosowanej w badaniu przedstawionym w tym badaniu, dodaj 100 μl normalnej surowicy osła do 4,9 ml PBST. Roztwór blokujący można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.</li>
	<li>W celu zablokowania strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj je odpowiednią ilością roztworu blokującego. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (500 μl na dwie szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego, aby rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do pożądanego stężenia. Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
	<ol>
		<li>W przypadku 3βHSD dodać 2 μl 3βHSD do 498 μl roztworu blokującego.</li>
		<li>W przypadku TH dodać 0,5 μl przeciwciała TH do 499 μl roztworu blokującego.</li>
		<li>W przypadku β-kateniny dodać 1 μl przeciwciała β-kateniny do 499 μl roztworu blokującego.</li>
		<li>W przypadku 20αHSD dodaj 1 μl przeciwciała 20αHSD do 499 μl roztworu blokującego.</li>
		<li>W przypadku CYP2F2 dodać 2 μl przeciwciała CYP2F2 do 498 μl roztworu blokującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym, strząsając roztwór blokujący ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez noc w temperaturze 4 °C. Podczas inkubacji szkiełka mogą być przykryte małym kawałkiem folii parafinowej, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Następnego ranka myj szkiełka PBST przez 5 minut 3x.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego (500 μl na dwa szkiełka) przy użyciu roztworu blokującego w celu rozcieńczenia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego do pożądanego stężenia (np. 1 μl przeciwciała przeciwko myszom osła lub przeciwciała przeciwko królikowi w 499 μl roztworu blokującego). Roztwór należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Inkubować z drugim przeciwciałem, strząsając PBST ze szkiełek i szybko przykrywając je wystarczającą ilością roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Jeśli problemem jest endogenna biotyna, należy użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą zamiast biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego. Przejdź do kroku 1.14, jeśli używasz przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą w kroku 1.10.</li>
	<li>Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.</li>
	<li>Przygotować roztwór streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (SA-HRP) (500 μl na dwie szkiełka), dodając 0,5 μl SA-HRP do 499 μl PBS. Końcowe stężenie wynosi 1 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować z roztworem SA-HRP. Strząśnij PBST ze szkiełek i szybko przykryj szkiełka odpowiednią ilością roztworu SA-HRP. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć szkiełka PBST przez 5 minut 3x.</li>
	<li>Przygotować roztwór fluoroforu i tyramidu przez rozcieńczenie fluoroforu tyramidu z jego buforem rozcieńczającym zgodnie z instrukcjami producenta (np. 5 μl fluorofor-tyramidu w 496 μl buforu rozcieńczającego).</li>
	<li>Przeprowadzić wytwarzanie sygnału za pomocą tyramidu fluoroforowego, strząsając PBST ze szkiełek i szybko pokrywając szkiełka wystarczającą ilością roztworu fluoroforu-tyramidu. Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji można dostosować w celu uzyskania pożądanej intensywności fluorescencji. Zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x.</li>
	<li>Sygnały można szybko sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić wynik na tym etapie. Jeśli szkiełka nakrywkowe nie są używane, nałóż kroplę glicerolu:PBS (1:1) na każdą sekcję, aby próbki były wilgotne. Myć szkiełka preparatem PBST przez 3 min 2x. Preparaty można przechowywać w PBST w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed przejściem do następnego etapu.</li>
</ol>
2. Usuń pierwsze przeciwciało
<ol>
	<li>Umieścić szkiełka w 275 ml wrzącego roztworu cytrynianu sodu (10 mM, pH = 6,0) na co najmniej 8 minut. Utrzymuj roztwór w stanie wrzenia, umieszczając szkiełka płasko na dnie pudełka z końcówkami do pipet o wymiarach 14 x 9,5 x 9 cm(szer. x dł. x wys.) z pokrywką i podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 70% w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W przez 8 minut. Jeżeli preferowany jest dłuższy czas oddzielania, może być konieczne uzupełnienie buforu wrzącym roztworem cytrynianu sodu, aby szkiełka były przez cały czas zanurzone w roztworze buforowym. Wyjmij pudełko końcówek do pipet z kuchenki mikrofalowej, otwórz pokrywę i pozwól roztworowi ostygnąć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego PBST. Myć PBST przez 5 min 3x. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany natychmiast, przechowuj szkiełka w słoiku Coplin z PBST w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni.</li>
</ol>
3. Barwienie drugim przeciwciałem
<ol>
	<li>Zacznij od kroku blokowania i postępuj zgodnie z tymi samymi procedurami w kroku od 1.5 do kroku 1.14. Na etapach wytwarzania sygnału (krok 1.15 i krok 1.16) należy użyć tyramidu fluoroforowego w innym spektrum fluorescencji. 
	UWAGA: Szkiełka można kilkakrotnie zdejmować przy użyciu tej metody, aby umożliwić barwienie multipleksowe. Ostatnie przeciwciało nie wymaga fluoroforu-tyramidu jako reportera. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem może być użyte do pokazania sygnałów z ostatniego przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Inkubować szkiełka z 2 μg/ml roztworu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub Hoechsta przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, jeśli potrzebne jest barwienie jądrowe. Następnie umyj szkiełka PBST przez 3 minuty 2x.</li>
</ol>
4. Obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego do wykrywania sygnałów
<ol>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe z kroplą podłoża montażowego odpowiedniego do immunofluorescencji.</li>
	<li>Do obrazowania użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć sygnały każdego kanału fluorescencji. Zacznij od kanału barwienia jądrowego (DAPI) i soczewki 4x, aby zlokalizować tkankę na szkiełku.</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw 10x do obrazowania. Dostosuj czas ekspozycji (300 ms) i intensywność źródła światła (intensywność 80%). Dostosuj te ustawienia, jeśli sygnał jest zbyt jasny lub zbyt ciemny. Rób zdjęcia każdego kanału bez przesuwania sceny. Dla każdego kanału może być konieczne ponowne ustawienie ostrości. Scal obrazy z każdego kanału za pomocą oprogramowania mikroskopu lub ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Multipleksowe barwienie immunologiczne jest przydatne do badania kolokalizacji komórkowej dwóch lub więcej antygenów. Ta szeroko stosowana technika daje przekonujące wyniki kolokalizacji, gdy pierwszorzędowe przeciwciała są sprzężone z różnymi reporterami (barwienie bezpośrednie). Jednak barwienie bezpośrednie zwykle zapewnia słabsze sygnały w porównaniu z barwieniem pośrednim, które obejmuje sprzężone przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia przeciwciał pierwszorzędowych. W barwieniu pośrednim wysokiej jakości wynik ba...

W barwieniu immunologicznym multipleksowym, bezpośrednie barwienie za pomocą sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych może dostarczyć pouczających wyników. Bez użycia przeciwciał drugorzędowych, metoda bezpośredniego barwienia wiąże się z niskim ryzykiem fałszywych sygnałów kolokalizacji z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak sprzężone reportery (fluorofor, enzymy) lub biotyna na pierwszorzędowym przeciwciałie ograniczają jego przyszłe zastosowanie. Alternatywnie, pośrednie barwienie immunologiczne zwykle zapewnia silniejsze sygnały przy użyciu niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego z znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Idealnie byłoby, gdyby niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe stosowane w barwieniu immunologicznym multipleksowym pochodziły od różnych gatunków gospodarzy, aby uniknąć reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jednak odpowiednia kombinacja przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od różnych gatunków gospodarzy nie zawsze jest dostępna.
Ustanowiono kilka metod mających na celu wyeliminowanie ryzyka reakcji przeciwciała drugorzędowego z niepożądanym przeciwciałem pierwotnym. Jedną z powszechnych metod jest użycie przeciwciała monomerycznego F(ab) w celu zablokowania wszelkich pozostałych epitopów wiążących na pierwszym pierwszorzędowym kompleksie przeciwciał przed barwieniem drugim pierwotnym przeciwciałem1. Usuwanie przeciwciał, które jest podobne do paska i reprobacji arkusza Western blot, usuwa wcześniej wybarwiony kompleks przeciwciał bez usuwania osadzania się wykrywalnych cząsteczek reporterowych, takich jak tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)2 i fluorescencyjne osadzanie tyramidu3. Dzięki tej metodzie cząsteczki reporterowe w różnych kolorach mogą pokazać wynik multipleksu na tym samym szkiełku. Barwienie multipleksowe jest również możliwe do osiągnięcia poprzez całkowite usunięcie wcześniej zdeponowanych warstw przeciwciał i wyrównanie następnie uzyskanych obrazów z innych przeciwciał4,5. Wszystkie te metody dają wiarygodne wyniki, chociaż każda z nich ma swoje ograniczenia i wymaga skomplikowanych procedur lub specjalnego systemu obrazowania.
Obecny protokół pokazuje zastosowanie metody usuwania przeciwciał z wykorzystaniem powszechnie dostępnych. Protokół ten może być stosowany do wykonywania multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie (FFPE) za pomocą dwóch nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany osioł anty-mysz</td><td>JacksonImmuno</td><td>715-066-151</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Biotynylowany osioł anty-królik</td><td>JacksonImmuno</td><td>711-066-152</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 &mu; g / ml w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona z peroksydazą chrzanową</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa, 700 W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anty-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz anty-TH</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-25269</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>JacksonImmuno</td><td>017-000-121</td><td>2% surowica w PBST</td></tr><tr><td>Królik anty-20&alfa; HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Królik anty-3&beta; HSD</td><td>TransGenic</td><td>KO607</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik anty-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik anty-&beta;-katenina</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Streptawidyna Peroksydaza chrzanowa (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tyramid</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>TSA Fluoresceina Tyramid</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr></tbody></table>

podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Barwienie immunologiczne jest szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, aby pokazać wzór ekspresji komórkowej danego białka. Multipleksowe barwienie immunologiczne umożliwia znakowanie przy użyciu wielu przeciwciał pierwszorzędowych. Aby zminimalizować reaktywność krzyżową przeciwciał, barwienie immunologiczne multipleksowe przy użyciu barwienia pośredniego wymaga nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od różnych gatunków gospodarzy. Jednak odpowiednia kombinacja przeciwciał różnych gatunków nie zawsze jest dostępna. W tym miejscu opisujemy metodę stosowania nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza (np. W tym przypadku oba przeciwciała pochodzą od królika) do immunofluorescencji multipleksowej na mysich odcinkach nadnerczy zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Metoda ta wykorzystuje tę samą procedurę i odczynniki, które są używane na etapie pobierania antygenu, aby usunąć aktywność wcześniej wybarwionego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał. Preparaty barwiono pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym przy użyciu ogólnego protokołu barwienia immunologicznego, po którym nastąpił etap wiązania z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym. Następnie zastosowano metodę wytwarzania sygnału peroksydazy awidyny-biotyny z fluoroforem-tyramidem jako substratem. Immunoaktywność pierwszego pierwszorzędowego kompleksu przeciwciał została usunięta przez zanurzenie w mikrofalowym wrzącym roztworze cytrynianu sodu na 8 minut. Nierozpuszczalne osadzanie się fluoroforu i tyramidu pozostało na próbce, co pozwoliło na zabarwienie szkiełka innymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. Chociaż ta metoda eliminuje większość sygnałów fałszywie dodatnich, może pozostać pewne tło z reaktywności krzyżowej przeciwciał. Jeżeli próbki są wzbogacone endogenną biotyną, można zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą w celu zastąpienia biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich z odzyskanej endogennej biotyny.

Wyniki uzyskano z próbek poddanych wszystkim opisanym etapom, w tym etapowi 1.2 dotyczącemu odsłaniania antygenów. Wszystkie użyte tutaj przeciwciała wtórne były biotynilowane. W celu opracowania sygnałów z pierwszego i drugiego przeciwciała pierwszorzędowego zastosowano fluorofor-tyramidę. Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kostkę FITC (dla fluorescencji zielonej), kostkę TxRED (dla Cy3) oraz kostkę DAPI (dla DAPI).
<p class="jove_content" f...

Ustalono kilka różnych metod barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tym miejscu opisujemy zastosowanie usuwania przeciwciał za pośrednictwem mikrofal i tyramidu fluoroforowego do blokowania reaktywności krzyżowej przeciwciał podczas multipleksowego barwienia immunologicznego na utrwalonych w formalinie odcinkach nadnerczy myszy zatopionych w parafinie.

Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Barwienie immunologiczne jest szeroko stosowane w badaniach biomedycznych w celu określenia lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Multipleksowe barwienie immunologiczne może wykryć wiele celów na tej samej próbce przy użyciu różnych przeciwciał pierwszorzędowych. Zaletą tej metody jest zastosowanie powszechnie dostępnych w celu wyeliminowania reaktywności krzyżowej przeciwciał, co pozwala na barwienie immunologiczne przy użyciu dwóch lub więcej nieznakowanych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza.Procedurę zademonstrują Sophia Zheng, doktorantka, i Qiongxia Lyu, wizytujący naukowiec z mojego laboratorium. Przed barwieniem należy odwoskować i ponownie nawodnić szkiełka zatopione w parafinie utrwalone w formalinie, zanurzając je w każdym roztworze zgodnie ze wskazaniami. Po drugim zanurzeniu w wodzie destylowanej umieść szkiełka w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na dnie pudełka z końcówką do pipet z pokrywką i umieść pudełko w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W i mocy 75% na osiem minut.Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej przed umyciem szkiełek trzema pięciominutowymi płukaniami świeżego PBST w słoiku z koplinu. W celu zablokowania wszelkich niespecyficznych miejsc wiązania, po ostatnim praniu należy strząsnąć nadmiar PBST z każdego szkiełka i przykryć szkiełka odpowiednią ilością odpowiedniego roztworu blokującego. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze wytrząsnąć nadmiar roztworu blokującego z każdego szkiełka i dodać 250 mikrolitrów pierwszego badanego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej próbki.Aby zapobiec wysychaniu próbek, szkiełka mogą być przykryte kawałkiem folii parafinowej. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze, umyj szkiełka trzykrotnie świeżym PBST przez pięć minut na mycie. Strząśnij nadmiar PBST, a następnie szybko przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał drugorzędowych na jednogodzinną inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdej szkiełka. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej umyj szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST. Następnie strząśnij nadmiar PBST i przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu fluoroforu i tyramidu.Minutę później zanurz szkiełka w świeżym PBST, a następnie trzy dwuminutowe mycia w świeżym PBST. Po ostatnim umyciu nałóż kilka kropli roztworu glicerol-PBS jeden do jednego na skrawki i sprawdź obecność sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby usunąć pierwszy kompleks przeciwciał, umieść szkiełka oznaczone przeciwciałami w 275 mililitrach wrzącego roztworu cytrynianu sodu na co najmniej osiem minut, jak pokazano.Pod koniec zabiegu otwórz pokrywkę i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie umyj szkiełka trzykrotnie PBST przez pięć minut na mycie. Aby wybarwić drugie białko docelowe będące przedmiotem zainteresowania, po zablokowaniu niespecyficznego wiązania, jak pokazano, oznacz każdą próbkę 250 mikrolitrami drugiego podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w świeżym PBST na jedno przemycie, a następnie przykryj każde szkiełko 250 mikrolitrami odpowiedniego roztworu przeciwciał wtórnych na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w świeżym PBST, jak pokazano, i dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanej peroksydazy chrzanowej streptawidyny do każdej szkiełka. Aby opracować sygnał dla drugiego białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania, po trzech płukaniach PBST, potraktuj szkiełka tyramidem sprzężonym z fluoroforem w innym spektrum fluorescencji. Aby zatrzymać rozwój sygnału tyramidu, zanurz szkiełka w PBST.Następnie wybarwić próbki odpowiednim barwnikiem jądrowym. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, każdy szkiełko znakowane barwnikiem jądrowym należy zamocować kroplą odpowiedniego podłoża mocującego w szkiełku nakrywkowym. Użyj obiektywu 4X, aby zlokalizować tkankę na szkiełku.Przełącz się na obiektyw 10X do obrazowania i dostosuj czas ekspozycji do 100 do 400 milisekund przy źródle światła o intensywności od 40 do 80%. Następnie uzyskaj obrazy w każdym kanale bez przesuwania stołu montażowego. Obrazy z każdego kanału można łączyć w celu utworzenia multipleksowego obrazu fluorescencyjnego.Bez usuwania między pierwszym i wtórnym barwieniem przeciwciał, drugie barwienie hydroksylazy tyrozynowej odbierze sygnały z pierwszego docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania, co spowoduje fałszywie dodatnie barwienie hydroksylazą tyrozyny, na przykład w tej próbce w korze nadnerczy. Aby usunąć reaktywność krzyżową przeciwciał w peroksydazie chrzanowej z pierwszego barwienia immunologicznego, można przeprowadzić jednominutowe i ośmiominutowe usuwanie za pośrednictwem mikrofal, co daje czyste wyniki podwójnego barwienia. W ujemnych próbkach kontrolnych nie wychwytuje się żadnego istotnego sygnału.Ośmiominutowe oddzielanie we wrzącym buforze cytrynianowym jest również wystarczające do wyeliminowania reaktywności krzyżowej przeciwciał dla wielu przeciwciał powszechnie stosowanych w nadnerczach. W niektórych przypadkach słaby sygnał fałszywie dodatni jest nadal wykrywalny, a wydłużenie czasu leczenia mikrofalowego o 20 minut nadal może nie usunąć całkowicie reaktywności krzyżowej przeciwciał. Podczas obrazowania fluorescencyjnego ważne jest, aby nie przesuwać stolika podczas przełączania kanałów.Może być jednak konieczne ponowne ustawienie ostrości w celu uzyskania wyraźnych obrazów każdego kanału. Dla każdego kanału należy dostosować czas ekspozycji, aby upewnić się, że sygnały są odpowiednio naświetlone i nie ma prześwietlonych pikseli lub obszarów na obrazach. Podczas procedury barwienia ważne jest, aby szkiełka były nawilżone po dewoskowaniu i Szkiełka można kilkakrotnie zdjąć przy użyciu tych samych metod usuwania, aby umożliwić barwienie multipleksowe.

microwaving-fluorophore-tyramide-for-multiplex-immunostaining-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje test do przeprowadzania multipleksowego barwienia immunologicznego przy użyciu pierwotnych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza. W tej metodzie wycinek tkanki nadnerczy poddawany jest dwuetapowemu procesowi barwienia immunologicznego. Początkowo wycinek jest barwiony przeciwciałami specyficznymi dla markerów w korze, a następnie usuwa się związane przeciwciało i ponownie barwi przeciwciałami specyficznymi dla markerów w rdzeniu.

Multipleksowa metoda barwienia immunologicznego przy użyciu pierwszorzędowych przeciwciał od tego samego gatunku gospodarza

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Tutaj prezentujemy metodę izolowania nadnerczy od myszy, naprawiania tkanek, dzielenia ich na sekcje i przeprowadzania barwienia immunofluorescencyjnego.

Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia pozwala na wykrywanie in situ wielu markerów jednocześnie przy użyciu wielokrotnej inkubacji przeciwciał antygenowych, skanowania obrazu oraz dopasowywania i integracji obrazu. W tym miejscu przedstawiamy protokół operacyjny identyfikacji substratów komórek odpornościowych za pomocą tej technologii w próbkach raka płuc i sparowanych próbkach przerzutów do mózgu.

Multipleksowa cykliczna immunohistochemia fluorescencyjna

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Naucz się multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy z wykorzystaniem podgrzewania w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramidu. Ta metoda eliminuje krzyżową reaktywność przeciwciał.

Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza (Wideo) | JoVE Journal

Podgrzewanie w kuchence mikrofalowej i fluorofor-tyramamid do multipleksowego barwienia immunologicznego nadnerczy myszy − przy użyciu niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych od tego samego gatunku gospodarza

Przeglądaj więcej filmów