Name: Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Odkryj metodę kultury ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów w 3D hydrożelach na perfuzowanej platformie mikroprzepływowej. Technika zwiększa żywotność komórek nowotworowych i umożliwia szybsze badania przesiewowe leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, National Cancer Institute, SBIR Phase I (HHSN26120700015C) i P01CA098912.

Tkanka nowotworowa została pobrana za zgodą pacjenta i zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB). Ksenoprzeszczepy zostały wszczepione, wyhodowane i pobrane zgodnie z przyjętym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
UWAGA: Wszystkie prace mają być wykonywane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność. Wszystkie czynności należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej.
1. Przygotowanie materiałów do obróbki PDX
<ol>
	<li>Kleszcze do autoklawu i rękojeść skalpela lub żyletki.</li>
	<li>Rozmrozić roztwór enzymu dysocjującego w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej tego samego dnia, w którym następuje dysocjacja tkanek. 
	UWAGA: Nie zaleca się rozmrażania w temperaturze 37 °C, ponieważ może to dezaktywować niektóre enzymy dysocjacyjne.</li>
	<li>Przygotować co najmniej 100 ml pożywki PDX (zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12 [DMEM-F12] ze 100 j./ml penicyliny i streptomycyny oraz 30% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) i co najmniej 25 ml pożywki do przetwarzania PDX (DMEM-F12 ze 100 j/ml penicyliny i streptomycyny i bez FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.</li>
</ol>
2. Dysocjacja PDX i wstępne oczyszczanie składnika zrębu
<ol>
	<li>Zbierz autoklawowane naczynia, sitka do komórek 70 μm (2−3), okrągłe szalki do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm (2), 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, sterylne stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml i sterylną sól fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Podgrzej pożywkę do 37 °C i pozwól, aby roztwór enzymu dysocjującego osiągnął temperaturę pokojową.</li>
	<li>Gdy tkanka PDX osiągnie średnicę 1,0-1,5 cm u gospodarza myszy, chirurgicznie usuń guz z myszy standardowymi środkami (np. w przyjętym znieczuleniu) i przechowuj na lodzie w probówce o pojemności 50 ml z pożywką hodowlaną PDX (<klasa silna = "xfig">Figura 2A). Przetwarzaj tkankę szybko, wykonując poniższe czynności, aby zmaksymalizować żywotność komórek, najlepiej w ciągu 1-2 godzin po pobraniu.</li>
	<li>Przenieś tkankę nowotworową do wstępnie zważonej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać 6x 30 ml sterylnego PBS w celu usunięcia krwi i zanieczyszczeń. Usuń jak najwięcej płynu i zważ tkankę nowotworową.</li>
	<li>Przenieś tkankę nowotworową do okrągłego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i zmiel na ~1 mm3 kawałki za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela.</li>
	<li>Dodaj 5 ml pożywki do przetwarzania PDX, aby zebrać zawiesinę guza i przenieść do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać naczynie hodowlane kolejnym 5 ml pożywki do przetwarzania PDX, a następnie roztworem enzymu dysocjacyjnego (10 ml / g guza, co najmniej 5 ml), dodając wszystkie płukanki do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając. Delikatnie zakręć probówką w połowie czasu inkubacji.</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół pipetą serologiczną, aby rozbić grudki. Komórki filtracyjne z sitkiem o pojemności 70 μm umieszczonym na nowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Może być konieczne użycie więcej niż jednego sitka.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut do komórek osadzania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2-3 ml pożywki hodowlanej PDX. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Skorzystaj z tabeli 1, aby oszacować wymaganą liczbę zdysocjowanych komórek pochodzących z PDX, potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek na chip. 
	UWAGA: Wartości w tabeli 1 mają służyć jako punkt początkowy. Rzeczywiste wartości będą się różnić ze względu na żywotność tkanek/komórkowość i utratę komórek w wyniku zamrożenia/regeneracji. Guzy PDX są indywidualnymi osobnikami nawet w obrębie danego typu nowotworu, więc wartości te powinny być dostosowane empirycznie.</li>
	<li>Z liczby obliczonej w kroku 2.9, płytka 1−2 x 106 komórek w 5 ml pożywki hodowlanej PDX na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) przez 48 godzin z delikatnym potrząsaniem (50−55 obr./min), aby przyspieszyć tworzenie klastrów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Po utworzeniu się klastra przejdź do sekcji 3 w celu odwirowania.</li>
	<li>Kriokonserwuj nieużywane komórki PDX przed początkową dysocjacją w 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) lub dostępnym na rynku pierwotnym podłożu do zamrażania komórek. 
	UWAGA: Przylegające komórki zrębu myszy można również odzyskać z powierzchni płytki tkankowej, w razie potrzeby, przez krótkie płukanie pożywką hodowlaną i rozszerzanie standardowymi środkami.</li>
	<li>W celu późniejszego wykorzystania kriokonserwowanych komórek nowotworowych PDX/zrębu myszy, rozmrażaj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Policz i umieść płytki na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, jak opisano w kroku 2.10 przed przejściem do sekcji 3. Zwiększ liczbę komórek PDX o ~20%, aby zrekompensować straty żywotności spowodowane krioprezerwacją.</li>
</ol>
3. Separacja klastrów pochodzących z PDX od pojedynczych komórek oparta na wirowaniu w gradicynie gęstości
<ol>
	<li>Przygotować 20 ml roztworu o 100% gradiencie gęstości, dokładnie mieszając 18 ml roztworu wirującego w gradiencie gęstości z 2 ml sterylnego 10-krotnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przygotować po 10 ml roztworów gradientu gęstości 20%, 30%, 40% i 55%, rozcieńczając ten 100% roztwór sterylnym 1x HBSS i dobrze mieszając. 
	UWAGA: Objętości te są wystarczające dla dwóch gradientów o pojemności 15 ml, z których każdy można oddzielić ~15 x 106 komórek. W przypadku oddzielania mniej niż ~15 x 106 komórek, drugi gradient powinien być użyty jako równowaga do wirowania.</li>
	<li>Dodaj 3 ml roztworu gradientu gęstości 55% na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Trzymając probówkę pod kątem, bardzo delikatnie nałóż 3 ml roztworu gradientu gęstości 40% na warstwę 55%, powoli dozując płyn na kątową stronę probówki, aby uniknąć mieszania warstw. Powtórz z roztworem gradientu gęstości 30%.</li>
	<li>Zebrać sklarowany nad osadem kultur rotacyjnych PDX za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, delikatnie przepłukując powierzchnię płytki. Wirować przy 200 x g przez 2 minuty do osadzania komórek.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml roztworu gradientu gęstości 20% zgodnie z liczbą gradientów potrzebnych do oddzielenia komórek. Ostrożnie ułóż roztwór gradientu gęstości 20% z komórkami na wierzchu gradientu (gradientów). Jeśli używasz tylko jednej rurki gradientowej do komórek, przykryj rurkę gradientu równowagi roztworem gradientu o gęstości 20% bez komórek.</li>
	<li>Zakryj probówki i odwiruj w wirówce z wirnikiem kubełkowym przez 30 minut w temperaturze 4 °C, 2 000 x g i hamulcu 0.</li>
	<li>Po odwirowaniu widoczne będą frakcje (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Zebrać 2-3 ml frakcji do świeżych probówek o pojemności 15 ml. Dodaj 3-4 objętości sterylnego 1x HBSS do każdej frakcji i odwróć, aby dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 3 minuty do granulowania komórek. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1−2 ml podłoża do przetwarzania PDX. 
	UWAGA: Żywotne klastry komórek PDX zwykle znajdują się na granicy faz roztworu gradientu gęstości 40−55% (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) z pojedynczymi martwymi / umierającymi komórkami gromadzącymi się na granicy faz roztworu gradientu gęstości 20−40% dla większości testowanych PDX.</li>
	<li>Usunąć małą, reprezentatywną podwielokrotność (50−100 μl) w celu ponownej dysocjacji z równą objętością roztworu enzymu dysocjacyjnego w celu oceny liczby komórek w zgrupowanej zawiesinie komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie hydrożelu i mikroprzepływowe wysiewanie płytek
<ol>
	<li>Rozpuścić roztwory hydrożelu HA (HA-SH modyfikowany tiolem; dikrylan glikolu polietylenowego reagujący z tiolami, PEGDA) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl HBSS do wszystkich studzienek w kolumnach okienka obserwacyjnego (kolumna 3, 7, 11, 15, 19, 23) 2-pasmowej płytki mikroprzepływowej, aby utrzymać wilgotność hodowli i optymalne warunki obrazowania.</li>
	<li>Obliczyć objętość zawiesiny komórek z sekcji 3 potrzebną do uzyskania 50 μl hydrożelu o pożądanej gęstości komórek (tj. 5 000 komórek/μl). W przypadku wysiewu jednej płytki mikroprzepływowej, należy podzielić obliczoną objętość na każdą z 4 sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Hydrożele HA mają stały czas do żelowania. Dostosuj objętość porcji roztworu żelu do wydajności użytkownika podczas dozowania, jeśli wystąpi przedwczesne żelowanie.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem dostosować pH roztworu HA-SH do 8,0 z 1 N NaOH. Przeprowadzić testowe żelowanie, mieszając 40 μl HA-SH z 10 μl PEGDA i monitorując żelowanie w czasie. Żelowanie zwykle rozpoczyna się 5-8 minut po zmieszaniu HA-SH z środkiem sieciującym PEGDA.</li>
	<li>Zawiesinę komórek wirować przez 2 minuty (200 x g, temperatura pokojowa) do komórek osadzanych. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości HA-SH. 
	UWAGA: Końcowy hydrożel to roztwór 4:1 HA-SH:PEGDA (objętościowo), więc komórki należy ponownie zawiesić w 40 μl HA-SH, aby uzyskać 50 μl końcowej objętości.</li>
	<li>Dodać 10 μl PEGDA do jednej porcji komórek w HA. Dobrze wymieszaj i odczekaj 1−3 minuty (w zależności od czasu żelowania z kroku 4.4) przed wysiewem płytki mikroprzepływowej. 
	UWAGA: Umożliwienie reakcji żelowania na początku przed siewem pomaga zminimalizować osiadanie komórek.</li>
	<li>Umieść końcówkę do dozowania objętości 1,5 μl do jednokanałowej pipety powtarzalnej i załaduj komórki roztworem hydrożelu HA. Pamiętaj, aby podwielokrotność hydrożelu była dobrze wymieszana, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.</li>
	<li>Aby umieścić płytkę mikroprzepływową, ustaw końcówkę pipety prostopadle do płytki, delikatnie umieszczając końcówkę na środku wlotu żelu (kolumny 1, 5, 9, 13, 17, 21), aby zapewnić kontakt, ale nie nacisk podczas dozowania roztworu hydrożelu. Działając szybko, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu hydrożelu, dozować 1,5 μl roztworu żelu do każdego wlotu żelu.</li>
	<li>Obserwuj stan napełnienia kanałów mikroprzepływowych, patrząc od góry płytki, od dołu płytki lub pod mikroskopem, i oceń obciążenie, używając Rysunek 3 jako wskazówkę (udane ładowanie w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, wskazówki dotyczące rozmieszczenia pipet w <silna klasa="xfig">Rysunek 3B, nieodebrane ładowanie w <silna klasa="xfig">Rysunek 3C, nie wypełniony, aby zakończyć się na <silna klasa="xfig">Rysunek 3D, przepełnienie w <silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Zidentyfikuj wszelkie niezbędne zmiany w technice, które mogą poprawić sukces napełniania w następnej rundzie chipsów (zobacz dyskusję, aby uzyskać wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6−4.9 z pozostałymi 3 podwielokrotnościami komórek w roztworze HA. Odwróć talerz, przygotowując następną porcję (~1 min). 
	UWAGA: 1-minutowy czas oczekiwania i odwrócenie płytki poprawiają rozkład 3D komórek, zmniejszając osadzanie się komórek podczas żelowania.</li>
	<li>Po napełnieniu wszystkich wiórów inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze, aż do zakończenia żelowania (~45 min).</li>
	<li>Korzystając z dołączonej instrukcji, upewnij się, że perfuzji jest zainstalowany w inkubatorze do hodowli komórkowych z prawidłowymi ustawieniami perfuzji (kąt 14°, odstępy 4 min).</li>
	<li>Dodać 50 μl pożywki PDX do wszystkich wlotów pożywki (kolumny 2, 6, 10, 14, 18, 22) i sprawdzić, czy kanały wypełniły się prawidłowo, odwracając płytkę. Delikatnie postukaj płytką o powierzchnię, aby zachęcić płyn do wypełnienia kanałów mikroprzepływowych.</li>
	<li>Dodać 50 μl DMEM-F12 (10% FBS) dla wszystkich wylotów pożywki (kolumna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Jeśli jakiekolwiek pęcherzyki powietrza są uwięzione w kanale perfuzyjnym, usuń je, delikatnie stukając płytką o powierzchnię.</li>
	<li>Korzystając z mikroskopu i formularza układu płytki (rysunek uzupełniający 1), zarejestruj pomyślne napełnianie wiórów. Wyklucz niewłaściwie wypełnione wióry z dalszego użytku eksperymentalnego.</li>
	<li>Umieść płytkę na uchylnym wahaczu ustawionym na nachylenie 14° i cykl 4-minutowy, aby rozpocząć perfuzję. Pożywkę PDX należy wymieniać co 2 dni (najpierw 50 μl na wlocie, a następnie 50 μl na wylocie).</li>
</ol>
5. Barwienie komórek, obrazowanie i kwantyfikacja obrazu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do oznaczania żywotności komórek zawierający trzy barwniki fluorescencyjne (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, kalceina acetoksymetylowa [AM]).
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe każdego barwnika w następujący sposób: Hoechst 33342 przy 1,6 mM (1 mg/ml) w wodzie dejonizowanej; kalceina AM przy 4 mM w bezwodnym DMSO; homodimer-1 etydyny przy 2 mM w DMSO/H2O (1:4, v/v). 
		UWAGA: Podstawowe roztwory kalceiny AM i homodimeru etydyny-1 znajdują się w zanotowanym zestawie w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Przygotować pojedynczy roztwór roboczy w pożywce HBSS lub pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, zawierający wszystkie trzy barwniki. Zoptymalizuj końcowe stężenie robocze dla każdego typu ogniwa i matrycy, w zakresach 1,6−8,0 μM dla Hoechst 33342, 0,1−10 μM dla kalceiny AM i 0,1−10 μM dla homodimeru etydyny-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i nałożyć roztwór barwnika żywotności roboczej na wybrane wióry mikroprzepływowe (75 μl na wlocie, 25 μl na wylocie) i umieścić z powrotem na perfuzyjnym w inkubatorze do hodowli komórkowych na 1 godzinę.</li>
	<li>Zobrazuj okna obserwacyjne barwionych kultur za pomocą ręcznego lub automatycznego mikroskopu konfokalnego (tabela materiałów) z filtrami fluorescencyjnymi (wymienionymi jako długości fal wzbudzenia/emisji, w nm) w celu obserwacji wszystkich jąder (Hoechst 33342, 350/461), jąder martwych komórek (ethidium homodimer-1, 528/617) i cytoplazmy żywych komórek (calceina AM, 494/517).</li>
	<li>Uchwyć stosy Z 140 μm z krokiem ≤1 μm za pomocą obiektywu pneumatycznego o rozmiarze 20x. Do zobrazowania całego mikrokanału z niewielkim nakładaniem się na siebie potrzebne są trzy pola widzenia. Aby uniknąć podwójnego próbkowania, należy obrazować tylko dwa pola widzenia na chip. 
	UWAGA: Warunki obrazowania powinny być zoptymalizowane, aby zapewnić prawidłowe próbkowanie NyQuist. Z doświadczenia autorów wynika, że szybki system obrazowania, oparty na dekonwolucji konwencjonalnego źródła epi-fluorescencji lub trybie skanowania rezonansowego na konfokalu, jest niezbędny do pełnego oznaczenia kompletnego stosu Z, z trzema kolorami lasera, na 96 chipach na płytce w rozsądnym czasie (około 3,5 godziny z automatycznym obrazowaniem, w tym konfiguracją).</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, przetestuj obrazy stosu Z pod kątem żądanych danych ilościowych, takich jak morfologia, stan agregacji lub inne cechy. Aby określić ilościowo żywotność komórek, policz liczbę martwych komórek (kolor czerwony) i całkowitą liczbę jąder komórkowych (kolor niebieski).</li>
</ol>

<ol><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%3A+Official+Journal+of+Korean+Cancer+Association%22%5BJournal%5D)">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+one+patient+paradigm%3A+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX-MI%3A+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li>
<li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li>
<li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856(2016).</li>
<li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseguides%3A+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li>
<li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+CD15%2FSSEA-1%2C+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66(2010).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy metodę przetwarzania i hodowli żywotnych komórek nowotworowych pochodzących z PDX w wysokoprzepustowym, perfundowanym systemie hodowli 3D. Chociaż protokół ten wykorzystuje tkankę PCa PDX, jest równie skuteczny w przypadku innych nowotworów pochodzenia nabłonkowego. Charakterystyka guza różni się między poszczególnymi liniami PDX, nawet w obrębie tej samej tkanki pochodzenia (prostata, pierś itp.). Niektóre linie PCa PDX są bardziej zwłókniałe i trudne do wyizolowania żywych komórek, podczas gdy i...

W ciągu ostatniej dekady, dziedzina badań nad rakiem wykazała nowy entuzjazm dla ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) jako narzędzia do oceny zależności od szlaku komórek nowotworowych i podatności na leki1. Najczęstsze modele PDX są ustalane przez podskórne lub ortotopowe wszczepienie ludzkich komórek nowotworowych - fragmentu guza, klastra zdysocjowanych komórek pochodzących z guza lub próbki izolowanych krążących komórek nowotworowych (CTC) - do gospodarza gryzonia. Jeśli "pobranie" guza się powiedzie, komórki ksenoprzeszczepu będą się namnażać, unaczyniać i w inny sposób wchodzić w interakcje z tkanką gospodarza, tworząc guz, który można pobrać w optymalnym rozmiarze, podzielić i ponownie wszczepić do innych gospodarzy. Wśród ich wielu zalet jako systemu modelowego, PDX zazwyczaj zachowują znaczną część heterogeniczności natywnej populacji komórek nowotworowych i umożliwiają ocenę specyficznych dla człowieka ścieżek i odpowiedzi komórek2,3. Kontekst in vivo umożliwia interakcję guza z naczyniami krwionośnymi i innymi sąsiednimi zrębami oraz podsumowuje cechy tkanki, takie jak dynamika dyfuzji leków, napięcie tlenu i wpływ macierzy zewnątrzkomórkowej, które biologicznie i mechanicznie wpływają na progresję guza. Negatywnym aspektem PDX jest ich zależność od żywiciela gryzonia, zarówno w celu ekspansji guza, jak i ostatecznie w celu testowania hipotez. Ponieważ wiele PDX nie może przystosować się do tradycyjnej dwuwymiarowej (2D) hodowli polistyrenu do hodowli tkankowych bez utraty wielu pożądanych cech, badacze mieli minimalny kompromis między tą stosunkowo kontrolowaną metodą in vitro a znacznym wzrostem kosztów, obiektów i wymagań czasowych dotyczących stosowania PDX in vivo.
Opisaliśmy wiele modeli in vitro, które implementują hodowlę komórek 3D w matrycy wspomagającej, a ostatnio rozszerzyliśmy tę pracę, aby zademonstrować hodowlę ex vivo PDX pochodzących z mnogiego raka prostaty (PCa), zarówno samodzielnie, jak i w kokulturze z fibroblastami pochodzącymi ze szpiku kostnego4,5. Matryce hydrożelowe na bazie kwasu hialuronowego (HA) zapewniają konfigurowalne i biologicznie istotne wsparcie dla obu typów komórek, z łatwą kontrolą właściwości hydrożelu i przejrzystością optyczną do obrazowania za pomocą hydrożelu głębokość6.
Dojrzałe tkanki nowotworowe PDX stanowią zmienną mieszaninę heterogenicznych ludzkich komórek nowotworowych i zrębu myszy (fibroblasty, komórki śródbłonka itp.). Aby zbadać specyficzny dla typu komórki wkład w progresję guza in vitro, korzystne może być dysocjowanie guzów, oddzielenie populacji komórek i eksperymentalne włączenie ich w zorganizowany sposób w celu przeanalizowania ścieżek komunikacji międzykomórkowej. Mieszane populacje komórek w pofermentach tkankowych mają różną zgodność z określonymi warunkami hodowli. Na przykład żywotność fibroblastów związanych z nowotworem wymaga albo przylegania do powierzchni, albo matryc 3D funkcjonalizowanych ligandami integrynowymi, podczas gdy komórki PDX pochodzące z nabłonka zazwyczaj nie mają tych wymagań, zamiast tego faworyzują interakcje komórka-komórka. Różnice te można wykorzystać do osiągnięcia skutecznego oddzielenia komórek PDX od zanieczyszczających komórek zrębu myszy. Rotacyjna hodowla pofermentów tkankowych umożliwia przyleganie komórek zrębu do powierzchni hodowli tkankowej, podczas gdy adhezje komórka-komórka napędzają komórki PDX unoszące się nad obracającą się powierzchnią hodowli, tworząc wielokomórkowe klastry w supernatancie w ciągu 24−48 godzin. Specyficzne cechy tych skupisk różnią się w zależności od PDX (np. duże, ciasne, wysoce kuliste grona lub mniejsze, luźniejsze agregaty przypominające kiście winogron), ale zazwyczaj mają biologicznie istotne rozmiary (średnica 50−250 μm), wystarczające do oceny interakcji komórkowych, które opierają się na kontaktach międzykomórkowych.
Pobieranie i przetwarzanie guza nieuchronnie prowadzi do pewnego stopnia obustronnej śmierci komórki, albo z powodu krótkotrwałych uszkodzeń spowodowanych zakłóceniami mechanicznymi/enzymatycznymi, albo długotrwałej niezgodności subpopulacji z wybranymi warunkami hodowli. Pomimo użyteczności hodowli rotacyjnej jako początkowej separacji masowej, martwe lub umierające komórki są nieuchronnie przenoszone z klastrami PDX i mogą wpływać na wynikową hodowlę. Te martwe komórki są często pojedynczymi komórkami PDX, które nie zostały zintegrowane w klaster, fibroblastami zrębu myszy, które nie mogą przetrwać w wybranych warunkach hodowli, lub szczególnie delikatnymi komórkami śródbłonka. Takie umierające komórki mogą wpływać na wyniki eksperymentalne od "ocalałych" i mogą znacząco wpływać na kwantyfikację, np. za pomocą testów przesiewowych żywotności opartych na obrazach fluorescencyjnych. Aby poprawić selekcję żywych komórek PDX z tej metody, dostosowaliśmy metody wirowania z krokami gęstości, aby łatwo usunąć pojedyncze martwe/umierające komórki z mieszanin PDX i zachować głównie żywe klastry wielokomórkowe.
Aby wzbogacić badania wynikowych klastrów pochodzących z PDX w hodowli 3D, wykorzystaliśmy platformę do hodowli perfuzyjnej opartą na mikrofluidyce, OrganoPlate (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), która jest wysokoprzepustową platformą narządów na chipie, która pozwala na jednoczesną hodowlę do 96 indywidualnych perfuzjonowanych, 3D kultur na 384-dołkowej mikropłytce (Rysunek 1A)7,8. W 2-pasmowej płytce mikroprzepływowej pojedynczy chip tkankowy jest połączony dwoma kanałami mikroprzepływowymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, kanał żelowy: czerwony, kanał perfuzyjny: niebieski), które obejmują cztery dołki w rzędzie. Dwa kanały mikroprzepływowe są oddzielone krótkim plastikowym grzbietem zwanym Phaseguide, który zapobiega przelewaniu się jednego kanału do sąsiedniego kanału, a jednocześnie pozwala na bezbłonowe połączenie między zawartością żelu a kanałem perfuzyjnym9. Ponieważ spód płytki mikroprzepływowej składa się ze szkła klasy mikroskopowej, kultury można oglądać w oknie obserwacyjnym przez spód płytki za pomocą mikroskopu standardowego lub automatycznego. Perfuzja jest ustalana w płytce mikroprzepływowej za pomocą programowalnego kołyska, wykorzystującego grawitację do kierowania mediów przez kanały mikroprzepływowe między studzienkami zbiornika (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Przepływ perfuzyjny naśladuje dokładniej mikrośrodowisko guza niż hodowla statyczna, umożliwiając włączenie naprężeń ścinających i zwiększoną dystrybucję gazów i składników odżywczych. Korzyści płynące z utrzymywania perfundowanej hodowli komórek rakowych w płytce mikroprzepływowej zostały wcześniej opisane, ponieważ perfundowane hodowle raka piersi wykazywały optymalną żywotność w porównaniu ze statyczną hodowlą 3D tych samych komórek7.
Niniejszy raport opisuje dostosowaną metodę wirowania gradientu gęstości do izolowania żywych wielokomórkowych klastrów PDX i demonstruje jej użyteczność w tworzeniu kultur 3D PDX na perfuzyjnych płytkach mikroprzepływowych. Ponieważ coraz więcej laboratoriów badawczych poszukuje metod ułatwiających korzystanie z PDX, przewidujemy, że przedstawione tutaj protokoły okażą się natychmiast użyteczne.

<table><tbody><tr><td>1N NaOH</td><td></td><td></td><td>dowolna odpowiednia klasa kultur tkankowych</td></tr><tr><td>60 mm okrągłe szalki</td><td></td><td></td> do hodowli tkankowych, <td>wszelkie odpowiednie</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych,</td><td></td><td></td><td>dowolne odpowiednie</td></tr><tr><td>70 &mikro; m sitka do komórek</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R z odpowiednim wirnikiem i wiadrami do stożkowych probówek wirówkowych 15/50 ml</td><td>lub równoważnych</td></tr><tr><td>Roztwór wirujący z gradientem gęstości</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td></td><td></td><td>dowolny odpowiedni stopień hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Roztwór enzymu dysocjacyjnego</td><td>StemCell Technologies</td><td>07921</td><td>ACCUMAX</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039021</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td>dowolny odpowiedni</td></tr><tr><td>zestaw hydrożelowy HA</td><td>ESI BIO</td><td>GS311</td><td>HyStem (kwas hialuronowy-SH i PEGDA)</td></tr> <tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B Hausser BrightLine</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H1398</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Oxford Instruments</td><td>Imaris 9.3</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>ŻYWE/MARTWE Zestaw żywotności/cytotoksyczności komórek (Calcein-AM/ Ethidium Homodimer-1)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli mikroprzepływowej</td><td>Mimetas</td><td>9603-400-B</td><td>2-torowy mikroskop OrganoPlate</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>pipeta wielokanałowa</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>lub równoważna tkanka</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>nowotworowa pochodząca z PDXuzyskane na podstawie zatwierdzenia IRB dla tkanek ludzkich i zatwierdzenia IACUC dla gospodarza zwierzęcego</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Wahacz perfuzyjny</td><td>Mimetas</td><td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td><td></td></tr><tr><td>paski pH (pH 5-9)</td><td></td><td></td> <td>dowolny odpowiedni</td></tr><tr><td>roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td>dowolne odpowiednie</td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa XY</td><td></td><td>Wytrząsarka oscylacyjna VWR Advanced 3500</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Skalpel Uchwyt</td><td></td><td></td><td>dowolny</td></tr><tr><td>odpowiedni Jednokanałowa pipeta powtarzalna</td><td>Eppendorf</td><td>22260201</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne, 15 ml stożkowe probówki</td><td></td><td></td> wirówkowe <td>dowolne</td></tr><tr><td>Sterylne, 50 ml stożkowe probówki</td><td></td><td></td> wirówkowe <td>dowolne odpowiednie</td></tr></tbody></table>

zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3d ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), powstające podczas bezpośredniego wszczepiania tkanki nowotworowej pacjenta do myszy z obniżoną odpornością, pozostają biologicznie stabilne, zachowując w ten sposób cechy molekularne, genetyczne i histologiczne, a także heterogeniczność pierwotnego guza. Jednak wykorzystanie tych modeli do przeprowadzania wielu eksperymentów, w tym badań przesiewowych leków, jest zaporowe zarówno pod względem kosztów, jak i czasu. Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli są powszechnie postrzegane jako platformy, w których komórki nowotworowe zachowują swoją integralność biologiczną poprzez interakcje biochemiczne, morfologię i architekturę. Nasz zespół ma duże doświadczenie w hodowli komórek PDX in vitro przy użyciu matryc 3D złożonych z kwasu hialuronowego (HA). W celu oddzielenia komórek zrębu fibroblastów myszy związanych z PDX używamy hodowli rotacyjnej, w której komórki zrębu przylegają do powierzchni płytek poddanych hodowli tkankowej, podczas gdy zdysocjowane komórki nowotworowe PDX unoszą się i łączą w wielokomórkowe klastry. W supernatancie unoszą się również pojedyncze, często martwe komórki, które stanowią wyzwanie w zbieraniu żywotnych klastrów PDX do dalszej enkapsulacji w hydrożele do hodowli komórek 3D. Aby oddzielić te pojedyncze komórki od klastrów żywych komórek, zastosowaliśmy wirowanie w gradionym gradieniu gęstości. Opisany tutaj protokół pozwala na wyczerpanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek ze zdrowej populacji klastrów komórkowych, które zostaną wykorzystane do dalszych eksperymentów in vitro. W naszych badaniach włączamy kultury 3D do płytek mikroprzepływowych, które pozwalają na perfuzję pożywki podczas hodowli. Po ocenie powstałych kultur za pomocą opartego na obrazie fluorescencyjnym testu żywotności komórek oczyszczonych i nieoczyszczonych, nasze wyniki pokazują, że ten dodatkowy etap separacji znacznie zmniejszył liczbę niezdolnych do życia komórek z naszych hodowli.

Programowalny kołyskowy system perfuzyjny przygotowano w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z płaszczem wodnym, a dwukanałowe płytki mikroprzepływowe przygotowano w standardowej komorze z laminarem w celu załadunku (Rycina 1). Guz PDX MDA-PCA-18b powiększono in vivo, pobrano po osiągnięciu maksymalnego rozmiaru i poddano dysocjacji zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu, aby utworzyć zawiesinę komórkową w stanie zbliżonym do pojedynczych komórek (Rycina 2A</s...

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Ulepszone metody hodowli próbek nowotworów pochodzących od pacjentów są niezwykle ważne, ponieważ dziedzina ta odchodzi od stosowania konwencjonalnych linii komórkowych. Protokół ten pozwala na hodowlę in vitro komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta na platformie, która jest podatna na badania przesiewowe o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości, w przeciwieństwie do modeli raka in vivo. Platforma zawierająca PDX pozwala nam ocenić bardziej heterogeniczne systemy odzwierciedlające rodzime nowotwory.Może to dać wgląd w mechanizmy działania leków i umożliwić szybsze badania przesiewowe leków. Metodę można rozszerzyć poprzez włączenie zrębu, śródbłonka i komórek odpornościowych. Te kokultury mogą jeszcze bardziej odzwierciedlać rodzimą populację nowotworów i architekturę.Przećwicz ładowanie płytek mikroprzepływowych łatwymi do rozprężania liniami komórkowymi, aby stać się wysoce biegłym, zanim przejdziesz do cenniejszych komórek, takich jak PDX. Wyrównanie podczas dozowania płytek ma ogromny wpływ na sukces, a wizualna demonstracja może łatwo przekazać tę koncepcję. Aby rozpocząć, przenieś tkankę nowotworową do wstępnie zważonej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Spłucz sześć razy 30 mililitrami sterylnego PBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Usuń jak najwięcej płynu i zważ tkankę nowotworową. Przenieś tkankę nowotworową do 60-milimetrowego okrągłego naczynia do hodowli tkankowej i użyj sterylnej żyletki lub skalpela, aby zmielić ją na jednomilimetrowe kawałki.Dodaj pięć mililitrów pożywki technologicznej PDX, aby zebrać zawiesinę guza. Dodaj pięć mililitrów roztworu enzymu dysocjacyjnego, aby zebrać zawiesinę guza. Przepłucz naczynie hodowlane kolejnymi pięcioma mililitrami roztworu enzymu dysocjacyjnego.Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki technologicznej PDX. Inkubować 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. W połowie czasu inkubacji delikatnie zakręć rurką.Po inkubacji delikatnie pipetować w górę i w dół pipetą serologiczną, aby rozbić grudki. Umieść sitko do komórek o średnicy 70 mikronów na nowej sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów i przefiltruj komórki. Następnie wirować z prędkością 1 200 obr./min przez dwie minuty, aby granulować komórki.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w dwóch do trzech mililitrach pożywki hodowlanej PDX. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Skorzystaj z tej tabeli, aby oszacować wymaganą liczbę skojarzonych komórek pochodzących z PDX, potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek na chip.Płytka od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej PDX na dołek sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności z delikatnym potrząsaniem przy 50 do 55 obr./min, aby ułatwić tworzenie klastrów. Po uformowaniu się klastrów przystąp do wirowania.Najpierw przygotuj 20 mililitrów roztworu gradientu gęstości 100%, dokładnie mieszając 18 mililitrów roztworu wirującego gradientu gęstości z dwoma mililitrami sterylnego 10X HBSS w sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówce. Rozcieńczyć ten 100% roztwór sterylnym 1X HBSS, aby uzyskać po 10 mililitrów roztworów gradientu gęstości 20%30%40% i 55%. Dodaj trzy mililitry roztworu gradientu gęstości 55% na dno 15-mililitrowej stożkowej rurki.Trzymając probówkę pod kątem, powoli dozuj trzy mililitry roztworu gradientu gęstości 40% na kątową stronę probówki i na wierzch warstwy 55%. Powtórz z roztworem gradientu o gęstości 30%. Następnie zebrać supernatant kultur rotacyjnych PDX za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej do probówki, delikatnie spłukując powierzchnię płytki.Wirować z prędkością 1 200 obr./min przez dwie minuty, aby osadzać komórki. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórek w trzech mililitrach roztworu gradientu o gęstości 20%. Ostrożnie ułóż roztwór gradientu o gęstości 20% z komórkami na wierzchu gradientu w 15-mililitrowej probówce.Zakryj probówki i odwiruj w wirówce z wirnikiem z wirnikiem obrotowym przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 2 000 razy G i zero przerwy. Po odwirowaniu widoczne są frakcje. Żywotne hodowle komórkowe PDX znajdują się zwykle na styku roztworu gradientu gęstości od 40 do 55%.Zbierz od dwóch do trzech mililitrów każdej frakcji do świeżych 15-mililitrowych probówek. Dodaj trzy do czterech objętości sterylnego 1X HBSS do każdej frakcji i odwróć, aby dokładnie wymieszać. Wirować przy 1 000 razy G przez trzy minuty, aby osadzać komórki.Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym do dwóch mililitrów podłoża technologicznego PDX. Przenieś małą porcję od 50 do 100 mikrolitrów do probówki i dodaj równą objętość roztworu enzymu dysocjacyjnego w celu redysocjacji.Oceń liczbę komórek w zgrupowanej zawiesinie komórek. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Roztwory hydrożelu kwasu hialuronowego należy rozpuścić zgodnie z zaleceniami producenta.Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów HBSS do wszystkich studzienek w kolumnach okienka obserwacyjnego dwupasmowej płytki mikroprzepływowej, aby utrzymać wilgotność hodowli i optymalne warunki obrazowania. Oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną na 50 mikrolitrów hydrożelu o pożądanej gęstości komórek, na przykład 5 000 komórek na mikrolitr. Aby wysiać jedną płytkę mikroprzepływową, podwielokrotność obliczonej objętości należy podzielić na każdą z czterech sterylnych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH roztworu HA tiolu do ośmiu z 1 normalnym wodorotlenkiem sodu. Przeprowadzić testowe żelowanie, mieszając 40 mikrolitrów tiolu HA z 10 mikrolitrami PEGdA i monitorując żelowanie w czasie. Następnie odwirować podwielokrotności zawiesiny komórkowej przez dwie minuty w temperaturze 200 razy G i temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 mikrolitrach tiolu HA, aby uzyskać końcową objętość 50 mikrolitrów. Dodać 10 mikrolitrów PEGdA do jednej podwielokrotności komórek tiolu HA. Dobrze wymieszaj i odczekaj od jednej do trzech minut przed wysianiem płytki mikroprzepływowej.Przymocuj końcówkę do dozowania 1,5 mikrolitra do jednokanałowej pipety powtarzalnej i załaduj komórki roztworem hydrożelu HA. Pamiętaj, aby podwielokrotność wodoru była dobrze wymieszana, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Aby wysadzić płytkę mikroprzepływową, ustaw końcówkę pipety prostopadle do ostrza, delikatnie umieszczając końcówkę na środku wlotu żelu, aby zapewnić kontakt, ale bez nacisku podczas dozowania 1,5 mikrolitra roztworu hydrożelu.Obserwuj stan napełnienia kanałów mikroprzepływowych, patrząc od góry płytki, od dołu płytki lub za pomocą mikroskopu. Oceń obciążenie, korzystając z tego rysunku jako wskazówki. Minutę po załadowaniu odwróć płytkę, przygotowując się do następnej porcji.Powtórzyć wysiew płytki mikroprzepływowej dla pozostałych trzech porcji komórek w roztworze HA. Po napełnieniu wszystkich frytek inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze przez 45 minut, aż do zakończenia żelowania. Następnie, korzystając z dołączonej instrukcji, upewnij się, że perfuzyjny jest zainstalowany w inkubatorze do hodowli komórkowych z prawidłowym ustawieniem obfitości pod kątem 14 stopni i w odstępach czterominutowych.Dodaj 50 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych PDX do wszystkich wlotów pożywki. Delikatnie postukaj płytką o powierzchnię, aby zachęcić płyn do wypełnienia kanałów mikroprzepływowych. Następnie odwróć płytkę, aby sprawdzić, czy kanały są prawidłowo wypełnione.Dodaj 50 mikrolitrów DMEM/F-12 dla wszystkich mediów. Jeśli jakiekolwiek pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione w kanale perfuzyjnym, usuń je, delikatnie stukając płytką o powierzchnię. Korzystając z mikroskopu i formy układu płytki, zarejestruj sukces napełniania wiórów.Wyklucz niewłaściwie wypełnione wióry z dalszego użytku eksperymentalnego. Umieść płytkę na uchylnym wahaczu ustawionym na 14 stopni i czterominutowy cykl, aby rozpocząć perfuzję. Co dwa dni wymieniaj pożywkę hodowlaną PDX, najpierw 50 mikrolitrów we wlotach, a następnie 50 mikrolitrów w wylotach.W tym badaniu programowalny perfuzyjny zainstalowano w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z płaszczem wodnym, a dwutorowe łopatki mikroprzepływowe przygotowano w standardowej komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu loading. 3D oceny żywotności i morfologii mikroprzepływowych kultur PDX zarówno w warunkach nierozdzielonych, jak i oddzielonych wirowaniem w gradiacji gęstości. Pierwszego dnia kultury, które poddano metodzie separacji, wykazywały dziesięciokrotnie mniej pojedynczych martwych komórek w porównaniu z kulturami nierozdzielonymi.Co ważne, rozdzielone klastry składały się przede wszystkim z żywych komórek. Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w rozkładzie wielkości klastra. Kultury utrzymywano następnie na płytce mikroprzepływowej przez siedem dni.Całkowita liczba żywych komórek pozostała stała, a klastry zachowały około 80% żywotności przez cały okres życia hodowli. Pamiętaj, że każda linia PDX jest unikalna, więc łatwość trawienia guza, rozmiar fenotypowy i morfologia klastrów oraz lokalizacja klastra w procesie oczyszczania gradientowego będą się różnić. Hodowle PDX założone przy użyciu tej metody mogą być oznaczane za pomocą testów żywotności opartych na obrazie lub czytniku płytek, utrwalone i znakowane immunofluorescencyjnie lub zdysocjowane w celu zebrania lizatów komórkowych dla innych protokołów.Metoda ta pozwoli naukowcom na odtworzenie mikrośrodowiska guza w celu zbadania biologii lub reakcji komórek nowotworowych na leki. Użytkownicy powinni ukończyć standardowe szkolenie z zakresu ludzi i patogenów przenoszonych przez krew przed rozpoczęciem pracy z tkankami ludzkimi. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

enhanced-viability-for-ex-vivo-3d-hydrogel-cultures-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Odkryj metodę kultury ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów w 3D hydrożelach na perfuzowanej platformie mikroprzepływowej. Technika zwiększa żywotność komórek nowotworowych i umożliwia szybsze badania przesiewowe leków.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów