Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Takie podejście może pomóc w wyjaśnieniu roli specyficznego brzusznego obszaru nakrywki, receptorów somatodendrytycznych i fazowego uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pytania o kontrolę funkcji receptora nad fazowym uwalnianiem dopaminy można rozwiązać w nienaruszonym mózgu. Optymalizacja lokalizacji mikroelektrody z włókna węglowego i stymulatora bipolarnego może być wyzwaniem, a radą dla początkujących jest rozpoczęcie nagrywania w prążkowiu grzbietowym.

Ze względu na stosowanie i manipulowanie wieloma rodzajami elektrod, w tym elektrodami rejestrującymi, referencyjnymi i stymulującymi, przydatny będzie wizualny przewodnik po tym, kiedy i gdzie te elektrody są wszczepiane. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, oczyść skórę głowy znieczulonego szczura trzema sekwencyjnymi peelingami jodopowidonowymi i 70% etanolem. Po ostatnim peelingu użyj wysterylizowanej pęsety igłowej i nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć wystarczającą ilość tkanki skóry głowy, aby zrobić miejsce na wszczepione elektrody.

Delikatnie oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki za pomocą wysterylizowanych aplikatorów z bawełnianą końcówką przed nałożeniem dwóch do trzech kropli 3% nadtlenku wodoru, aby pomóc zidentyfikować lambda i bregma. Następnie użyj wiertła o średnicy jednego milimetra ustawionego na około 20 000 obrotów na minutę, aby wykonać otwór o średnicy 1,5 milimetra, 2,5 milimetra z przodu i 3,5 milimetra z boku do bregmy. Włóż o średnicy zewnętrznej 1.59 milimetra i długości 3.2 milimetra mniej więcej w połowie do otworu, aż śruba będzie mocno na swoim miejscu.

Następnie wywierć otwór elektrody referencyjnej o średnicy jednego milimetra w lewej półkuli, 1,5 milimetra z przodu i 3,5 milimetra z boku do bregmy. Włóż około dwóch milimetrów drutu referencyjnego do otworu, owijając drut wokół i pod wszczepionej. Następnie całkowicie wszczepij, przytrzymując elektrodę referencyjną na miejscu.

W prawej półkuli wywierć otwór o średnicy 1,5 milimetra, 1,2 milimetra z przodu i 1,4 milimetra z boku do bregmy i użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć oponę twardą. W przypadku elektrody stymulującej wywierć kwadratowy otwór na dwa milimetry przednio-tylny i pięć milimetrów przyśrodkowo-boczny, wyśrodkowany na 5,2 milimetra z tyłu i jeden milimetr bocznie do bregmy. Używając stereotaktycznych prętów naramiennych, opuść bipolarną kaniulę prowadzącą elektrody stymulującej pięć milimetrów poniżej opony twardej.

Używając stereotaktycznych prętów ramienia, opuść mikroelektrodę z włókna węglowego cztery milimetry poniżej opony twardej w najbardziej grzbietowej części prążkowia i podłącz drut odniesienia i włókno węglowe do potencjostatu. Następnie zastosuj trójkątny przebieg o napięciu od minus 0,4 do 1,4 V, 400 V na sekundę przez 15 minut przy 60 Hz, a następnie 10-minutowy bodziec przy 10 Hz. Aby zoptymalizować lokalizację elektrody stymulującej, ustaw stymulator tak, aby wytwarzał bipolarny przebieg elektryczny o częstotliwości 60 Hz, 24 impulsach, prądzie 300 mikroamperów i szerokości impulsu fazowego wynoszącej dwie milisekundy

Delikatnie obniżaj stymulator w krokach co 0,2 milimetra od 5 do 7,8 milimetra poniżej opony twardej, stymulując VTA przy każdym kroku. Kontynuuj obniżanie kaniuli prowadzącej elektrody stymulującej bipolarnie, aż stymulacja spowoduje fazowe uwalnianie dopaminy na mikroelektrodzie z włókna węglowego w prążkowiu grzbietowym. Po zaobserwowaniu uwalniania dopaminy opuść mikroelektrodę z włókna węglowego, aż znajdzie się co najmniej sześć milimetrów poniżej opony twardej w najbardziej grzbietowej części jądra półleżącego.

Gdy elektroda jest na swoim miejscu, stymuluj VTA i zapisz amplitudę piku dopaminy, a następnie obniż lub podnieś mikroelektrodę z włókna węglowego do miejsca, które wytwarza największe uwalnianie dopaminy, upewniając się, że szczyt odpowiedzi dopaminy jest reprezentowany jako wyraźny pik utleniania przy 0,6 V i pik redukcji przy minus 0,2 wolta. Po zoptymalizowaniu położenia kaniuli prowadzącej elektrodę z włókna węglowego i elektrody stymulującej, należy stymulować zwierzę co trzy minuty przez 20 do 30 minut. Po osiągnięciu stabilnej linii podstawowej, delikatnie opuść kaniulę wewnętrzną ręcznie do kaniuli prowadzącej wstępnie zamontowanej w stymulatorze bipolarnym i uzyskaj dodatkowe dwa do trzech zapisów linii podstawowej, aby potwierdzić, że wprowadzenie kaniuli nie spowodowało zmiany w wywołanym sygnale.

Po ustaleniu wyjściowej odpowiedzi należy użyć pompy strzykawkowej i mikrostrzykawki, aby wprowadzić 0,5 mikrolitra roztworu leku będącego przedmiotem zainteresowania do VTA w ciągu dwóch minut. Po infuzji pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu na co najmniej jedną minutę przed usunięciem, kontynuując rejestrowanie odpowiedzi co trzy minuty, aby zmierzyć efekty po infuzji. Jak wykazano na tych reprezentatywnych wykresach kolorystycznych, napar z soli fizjologicznej nie zmienia stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy.

Wlew NMDA powoduje silny wzrost stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy, podczas gdy konkurencyjny antagonista receptora NMDA, AP5, powoduje znaczny spadek. Zarówno niekompetycyjny antagonista nikotynowego receptora acetylocholiny mekamylamina, jak i nieselektywny kompetycyjny antagonista receptora muskarynowego acetylocholiny skopolamina, powodują znaczny spadek stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy. Na tym wykresie można zaobserwować podsumowanie działania badanych leków w czasie.

Kaniulę infuzyjną należy ostrożnie wprowadzić do bipolarnej elektrody stymulującej. W przeciwnym razie może dojść do nadmiernych uszkodzeń, prowadzących do sztucznych zmian w fazowym uwalnianiu dopaminy. Podejście to pozwoliło badaczom na dokładniejsze przyjrzenie się specyficznym mechanizmom receptorowym, za pomocą których fazowe uwalnianie dopaminy jest regulowane in vivo.