Name: Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj metodę CIS-FSCV do badania regulacji fazywnego uwalniania dopaminy przez receptory w VTA u szczurów. Technika umożliwia manipulację receptorami w nienaruszonym mózgu i pomiar odpowiedzi neurochemicznej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Elizabethtown College (R.J.W, M.L. i L.M.), przez stypendium dla absolwentów NSF (R.J.W.) oraz przez Yale School of Medicine (N.A.).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health (NIH) dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone zarówno przez Elizabethtown College, jak i Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Protokół ten jest specyficzny dla znieczulonego preparatu szczura z wykorzystaniem CIS-FSCV.
1. Przygotowania przedoperacyjne
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu elektrody
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór do zasypywania elektrody, przygotuj roztwór 4 M octanu potasu ze 140 mM chlorku potasu16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie elektrod
	<ol>
		<li>Za pomocą odsysania próżniowego włóż włókno węglowe T-650 (o średnicy 7 μm) do kapilary ze szkła borokrzemianowego (długość = 100 mm, średnica = 1,0 mm, średnica wewnętrzna = 0,5 mm).</li>
		<li>Po umieszczeniu włókna węglowego w szklanej kapilarze umieść szklaną kapilarnę w pionowym ściągaczu elektrod, tak aby element grzejny znajdował się mniej więcej pośrodku kapilary. Ustaw grzałkę na 55 przy wyłączonym magnesie.</li>
		<li>Po pociągnięciu kapilary ostrożnie podnieś górny uchwyt kapilarny, aby końcówka elektrody nie była otoczona elementem grzejnym.</li>
		<li>Za pomocą ostrych nożyczek odetnij włókno węglowe, które nadal łączy dwa kawałki kapilary. W ten sposób powstaną dwie oddzielne mikroelektrody z włókna węglowego.</li>
		<li>Pod mikroskopem świetlnym ostrożnie przetnij odsłonięte włókno węglowe ostrym skalpelem, tak aby włókno węglowe wystawało około 75-100 μm poza koniec szkła.</li>
		<li>Używając mikroskopu świetlnego, upewnij się, że elektroda jest wolna od pęknięć wzdłuż kapilary. Upewnij się również, że uszczelka, w miejscu, w którym włókno węglowe wychodzi z kapilary, jest trudna do zauważenia i wolna od pęknięć. 
		UWAGA: Dobre uszczelnienie pomoże zredukować szumy podczas nagrywania. Zobacz opublikowane badania17,18,19, aby uzyskać bardziej szczegółowy protokół.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja elektrod referencyjnych
	<ol>
		<li>złotą szpilkę do 5 cm srebrnego drutu.</li>
		<li>Przymocuj anodę do metalowego spinacza do papieru lub innego przewodnika, katodę do kołka i przyłóż napięcie (~2 V), podczas gdy spinacz do papieru i srebrny drut są zanurzone w 0,1 M HCl.</li>
		<li>Zatrzymaj napięcie, gdy na srebrnym przewodzie pojawi się biały nalot (AgCl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie elektrody do implantacji
	<ol>
		<li>złoty szpilkę do cienkiego izolowanego drutu (~10 cm długości, <0,50 mm średnicy).</li>
		<li>Usuń ~5 cm izolacji z przewodu naprzeciwko złotego pinu.</li>
		<li>Napełnij elektrodę mniej więcej do połowy roztworem elektrody.</li>
		<li>Włóż izolowany drut do elektrody. 
		UWAGA: Drut powinien stykać się z włóknem węglowym wewnątrz elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Implantacje elektrod
<ol>
	<li>Dorosłym szczurom Sprague Dawley (250-450 g) należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie (1,5 g/kg lub 1 ml/kg objętości) 0,5 g/ml uretanu rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Rozpocząć od początkowej dawki uretanu 1,0-1,2 g/kg. Jeśli zwierzę nadal reaguje na test szkodliwego bodźca (uszczypnięcie ogona) 20 minut po podaniu uretanu, należy podać dodatkowe 0,3−0,5 g/kg uretanu w całkowitej dawce 1,5 g/kg. 
	UWAGA: Aby przygotować roztwór uretanu o stężeniu 0,5 g/ml, dodaj 10 g uretanu do 10 g (~10 ml) soli fizjologicznej. Uretan jest czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Uretan jest ważnym środkiem znieczulającym, ponieważ nie zmienia poziomu dopaminy, podobnie jak inne środki znieczulające, takie jak ketamina/ ksylazyna i hydrat chloralu20,21.</li>
	<li>Gdy zwierzę jest już głęboko znieczulone i nie reaguje na szkodliwe bodźce (np. szczypanie palców), umieść je w ramce stereotaktycznej. Nałóż lubrykant okulistyczny na każde oko szczura. 
	UWAGA: Jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie, ale zaleca się stosowanie dobrej techniki aseptycznej.</li>
	<li>Oczyść skórę głowy szczura za pomocą dwuetapowego peelingu (tj. peelingu jodopowidonowego, a następnie peelingu 70% etanolu; wykonuj z powtórzeniem 3 cykli).</li>
	<li>Odetnij tkankę skóry głowy za pomocą wysterylizowanej pęsety igłowej i nożyczek chirurgicznych. Usuń znaczną ilość tkanki, aby zrobić miejsce na różne implantacje opisane poniżej.</li>
	<li>Delikatnie oczyść powierzchnię czaszki za pomocą wysterylizowanych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Następnie nałóż 2-3 krople 3% nadtlenku wodoru, aby pomóc zidentyfikować lambdę i bregmę.</li>
	<li>Za pomocą wiertarki stereotaktycznej lub ręcznej (1.0 mm, ~20 000 obr./min) wywierć otwór o średnicy 1.5 mm 2.5 mm przed bregmą i 3.5 mm bocznie do bregmy. Częściowo (mniej więcej w połowie, aż znajdzie się na swoim miejscu) wbij (1,59 mm średnicy zewnętrznej, 3,2 mm długości) w ten otwór. Zaleca się stosowanie sterylnej soli fizjologicznej do nawadniania podczas wiercenia, aby zapobiec urazom termicznym.</li>
	<li>W przypadku elektrody referencyjnej wywierć otwór o średnicy 1.0 mm 1.5 mm z przodu i 3.5 mm z boku do bregmy, w lewej półkuli.</li>
	<li>Ręcznie włóż ~2 mm przewodu odniesienia do tego otworu, owijając przewód odniesienia wokół i pod wszczepionej.</li>
	<li>Całkowicie wkręć, przytrzymując elektrodę referencyjną na miejscu.</li>
	<li>W prawej półkuli wywierć otwór o średnicy 1,5 mm 1,2 mm z przodu i 1,4 mm z boku bregmy.</li>
	<li>Delikatnie usuń oponę twardą za pomocą pęsety.</li>
	<li>W przypadku elektrody stymulującej wywierć kwadratowy otwór (2 mm przednio-tylny, 5 mm przyśrodkowo-boczny) wyśrodkowany na 5,2 mm z tyłu i 1,0 mm z boku bregmy.</li>
	<li>Za pomocą stereotaktycznych prętów naramiennych opuść bipolarną elektrodę stymulującą/kaniulę prowadzącą 5 mm poniżej opony twardej. W przypadku krwawienia podczas implantacji elektrody należy użyć sterylnych wacików bawełnianych i gazy, aby zminimalizować krwawienie. 
	UWAGA: Bipolarna elektroda stymulująca stosowana w tej metodzie jest wstępnie wyposażona w kaniulę prowadzącą (Tabela materiałów). Wewnętrzna kaniula używana z tym elementem powinna być przepłukana zębami bipolarnej elektrody stymulującej po całkowitym włożeniu do kaniuli prowadzącej. Pozwoli to na to, aby kaniula wewnętrzna znalazła się bezpośrednio między dwoma bolcami stymulatora, które są oddalone od siebie o około 1 mm. Podobny protokół jest opisany w innym miejscu14.</li>
	<li>Korzystając ze stereotaktycznych prętów ramienia, opuść mikroelektrodę z włókna węglowego 4 mm poniżej opony twardej. To miejsce znajduje się w najbardziej grzbietowej części prążkowia.</li>
	<li>Podłącz przewód odniesienia i włókno węglowe do potencjostatu.</li>
	<li>Zastosuj trójkątny kształt fali (-0,4−1,3 V, 400 V/s) przez 15 minut przy 60 Hz i ponownie przez 10 minut przy 10 Hz. 
	UWAGA: Zazwyczaj, podczas nakładania fal na mikroelektrody z włókna węglowego w mózgu, grupy tlenkowe są dodawane do powierzchni włókna węglowego. Równowaga tej reakcji musi być osiągnięta przed rejestracją; W przeciwnym razie wystąpi znaczny dryf19. Cykliczne obracanie elektrody przy wyższych częstotliwościach (60 Hz) pozwala włóknu węglowemu szybciej osiągnąć równowagę.</li>
</ol>
3. Optymalizacja włókna węglowego i stymulacja lokalizacji elektrod/kaniuli prowadzącej
<ol>
	<li>Ustaw stymulator tak, aby wytwarzał bipolarny przebieg elektryczny o częstotliwości 60 Hz, 24 impulsach, prądzie 300 μA i szerokości impulsu 2 ms/fazę.</li>
	<li>Delikatnie obniżaj stymulator w odstępach co 0,2 mm od 5 mm do 7,8 mm poniżej opony twardej. Przy każdym kroku stymuluj VTA. 
	UWAGA: Na większych głębokościach grzbietowych (5−6 mm) stymulacja mózgu zazwyczaj (~ 80% czasu) powoduje drganie wąsów szczura. Na dalszych głębokościach wąsy przestaną drgać, co następuje między 7,5−8,2 mm poniżej opony twardej. Kiedy wąsy przestaną drgać, elektroda stymulująca znajdzie się w pobliżu lub na VTA. Nie wystąpi to u każdego szczura, a brak drgania wąsów nie powinien być traktowany jako znak, że dwubiegunowa elektroda stymulująca/kaniula infuzyjna jest źle umieszczona. Drganie wąsów może nie wystąpić w przypadku wszystkich środków znieczulających (np. izofluranu).</li>
	<li>Kontynuuj obniżanie bipolarnej elektrody stymulującej/kaniuli prowadzącej, aż stymulacja spowoduje fazowe uwolnienie DA na mikroelektrodzie z włókna węglowego (obecnie w prążkowiu grzbietowym). 
	UWAGA: Uwolnienie DA w prążkowiu grzbietowym nie zawsze nastąpi, jeśli elektroda bipolarna jest wszczepiona do VTA, ale obserwacja uwolnienia DA w prążkowiu grzbietowym po stymulacji VTA jest zwykle dobrym znakiem, że dobry sygnał zostanie zaobserwowany w rdzeniu NAc.</li>
	<li>Opuść mikroelektrodę z włókna węglowego, aż znajdzie się co najmniej 6.0 mm poniżej opony twardej. Jest to najbardziej grzbietowa część rdzenia NAc.</li>
	<li>Stymuluj VTA i zapisz amplitudę piku DA.</li>
	<li>Opuść lub podnieś mikroelektrodę z włókna węglowego w miejscu, które powoduje największe uwolnienie DA.</li>
	<li>Upewnij się, że pik odpowiedzi DA jest wyraźnym pikiem utleniania przy 0,6 V i pikiem redukcji przy -0,2 V. Te szczyty wskazują na DA.</li>
</ol>
4. Połączenie infuzji i stymulacji FSCV
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje oś czasu dla rejestracji przed i po mikroinfuzji VTA.
<ol>
	<li>Po zoptymalizowaniu położenia włókna węglowego i elektrody stymulującej/kaniuli prowadzącej, stymuluj przez ~20−30 min. 
	UWAGA: Przy obecnych parametrach stymulacji nie należy stymulować częściej niż raz na 3 minuty, aby umożliwić ponowne ładowanie pęcherzyków22.</li>
	<li>Po osiągnięciu stabilnej wartości wyjściowej (<20% odchylenia w ciągu pięciu stymulacji), delikatnie opuść kaniulę wewnętrzną ręcznie do kaniuli prowadzącej, która jest wstępnie zamontowana w stymulatorze bipolarnym.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe 2-3 nagrania linii bazowej, aby upewnić się, że samo wprowadzenie kaniuli nie spowodowało zmiany wywołanego sygnału. W niektórych przypadkach wprowadzenie i usunięcie kaniuli wewnętrznej może spowodować uszkodzenie VTA. Jeśli sygnał zmieni się drastycznie w tym okresie bazowym (>20%), wykonaj dodatkowe 3-4 nagrania, aż linia bazowa ponownie się ustabilizuje.</li>
	<li>Za pomocą pompy strzykawkowej i mikrostrzykawki wprowadzić 0,5 μl roztworu (np. 0,9% soli fizjologicznej, N-metylo-D-asparaginianu [NMDA], kwasu (2R)-amino-5-fosfonowalerinowego [AP5]) do VTA w ciągu 2 minut.</li>
	<li>Po infuzji należy pozostawić kaniulę wewnętrzną na co najmniej 1 minutę przed usunięciem. 
	UWAGA: Niektóre leki mogą wymagać pozostawienia kaniuli wewnętrznej na dłuższy czas w zależności od kinetyki leku, a usunięcie kaniuli wewnętrznej może spowodować, że lek przemieści się z powrotem przez kaniulę wewnętrzną. W razie obaw można pozostawić kaniulę wewnętrzną w kaniuli prowadzącej przez cały czas trwania nagrania. W przeciwnym razie nagrywanie może rozpocząć się po upływie tego 1-minutowego interwału.</li>
	<li>Kontynuuj nagrywanie co 3 minuty, aby zmierzyć efekty po infuzji. 
	UWAGA: Jeśli zaparzysz roztwór kontrolny i nie zaobserwujesz żadnego efektu, możliwe jest zaparzenie po raz drugi10. Jeśli występuje zmienione uwalnianie DA spowodowane wprowadzeniem wewnętrznej kaniuli lub wlewu soli fizjologicznej, sygnał zwykle wraca do stanu wyjściowego w ciągu 30 minut.</li>
</ol>
5. Weryfikacja histologiczna umieszczenia elektrod
<ol>
	<li>Pod koniec eksperymentu stwórz małą zmianę w miejscu rejestracji za pomocą mikroelektrody z włókna węglowego.
	<ol>
		<li>Jeśli elektroda musi być zachowana do kalibracji po eksperymencie, należy użyć drutu wolframowego umieszczonego w szklanej kapilarze wystającej ~100 μm poza końcówkę kapilary. W takim przypadku podnieś elektrodę z mózgu, zastąp elektrodę rejestrującą elektrodą wolframową i opuść ją do tej samej współrzędnej grzbietowo-brzusznej. 
		UWAGA: Włókno węglowe może być również używane do uszkodzenia mózgu i zapewni dokładniejsze odwzorowanie lokalizacji miejsca nagrywania; Eksperymentator straci jednak możliwość kalibracji tych elektrod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uszkodzić miejsce nagrywania, przyłóż napięcie za pomocą zasilacza. Zacznij od 1 V i zwiększaj o 1 V co 10 s, aż do osiągnięcia 10 V.</li>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji za pomocą śmiertelnego wstrzyknięcia dootrzewnowego pentobarbitalu (150 mg/kg).</li>
	<li>Perfaktor użyj 4% roztworu formaliny.</li>
	<li>Usuń głowę szczura za pomocą zaostrzonej gilotyny.</li>
	<li>Za pomocą rongeurs usuń tkankę łączną i czaszkę otaczającą mózg i delikatnie usuń mózg z pozostałej tkanki.</li>
	<li>Przechowuj mózg w 4% formalinie przez 1 dzień, a następnie przenieś go do 30% sacharozy. 
	UWAGA: Perfuzja z 4% formaliną nie jest konieczna, aby zobaczyć miejsce zmiany, chociaż jako najlepsza praktyka poprawi rekonstrukcję miejsca zmiany.</li>
	<li>Utwórz wycinki mózgu o grubości 30 μm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Zamontuj plastry na szkiełkach i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Oznacz lokalizację uszkodzenia mikroelektrody z włókna węglowego i lokalizację bipolarnego stymulatora/kaniuli infuzyjnej za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
</ol>

<ol><li>Grace, A. A., Bunney, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+firing+pattern+in+nigral+dopamine+neurons%3A+burst+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing.</a> Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).</li>
<li>Lester, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+acetylcholine+and+glutamate+receptors+modulate+accumbal+dopamine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release.</a> Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).</li>
<li>Lodge, D. J., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laterodorsal+tegmentum+is+essential+for+burst+firing+of+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mu+Opioid+Receptor+Modulation+of+Dopamine+Neurons+in+the+Periaqueductal+Gray%2FDorsal+Raphe%3A+A+Role+in+Regulation+of+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+functional+cannabinoid+CB2+receptor+in+VTA+dopamine+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats.</a> Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).</li>
<li>Wickham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+studying+phasic+dopamine+signaling+in+brain+reward+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms.</a> Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).</li>
<li>Wightman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+transmitter+metabolites+by+voltammetry+in+cerebrospinal+fluid+following+neural+pathway+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation.</a> Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).</li>
<li>Grace, A. A., Bunney, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+firing+pattern+in+nigral+dopamine+neurons%3A+single+spike+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing.</a> Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).</li>
<li>Mameli-Engvall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+dopamine+neuron-firing+patterns+by+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors.</a> Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).</li>
<li>Wickham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+tegmental+area+alpha6beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+phasic+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+core%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core.</a> Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).</li>
<li>Solecki, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+ventral+tegmental+area+acetylcholine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors+in+cocaine-seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking.</a> Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).</li>
<li>John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+CE+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+amplifies+reward-related+dopamine+signals+in+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum.</a> Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).</li>
<li>Espana, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocretin+1%2Forexin+A+in+the+ventral+tegmental+area+enhances+dopamine+responses+to+cocaine+and+promotes+cocaine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration.</a> Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).</li>
<li>Addy, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-type+calcium+channel+blocker%2C+isradipine%2C+attenuates+cue-induced+cocaine-seeking+by+enhancing+dopaminergic+activity+in+the+ventral+tegmental+area+to+nucleus+accumbens+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).</li>
<li>Hermans, A., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tungsten+tips+as+substrates+for+the+preparation+of+ultramicroelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes.</a> Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).</li>
<li>Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorland%2C+LM+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Mundroff, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14(2002).</li>
<li>Rodeberg, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiker%27s+Guide+to+Voltammetry%3A+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+in+vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloral+hydrate+and+ethanol%2C+but+not+urethane%2C+alter+the+clearance+of+exogenous+dopamine+recorded+by+chronoamperometry+in+striatum+of+unrestrained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats.</a> Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).</li>
<li>Masuzawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+inhibits+ketamine-induced+dopamine+release+in+the+rat+nucleus+accumbens%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study.</a> Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).</li>
<li>Montague, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gain+control+of+dopamine+delivery+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals.</a> Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).</li>
<li>Keithley, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+sensitivity+dopamine+measurements+with+faster-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry.</a> Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).</li>
<li>Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-scan+cyclic+voltammetry+of+5-hydroxytryptamine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine.</a> Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).</li>
<li>Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparison+of+norepinephrine+and+dopamine+release+in+rat+brain+by+simultaneous+measurements+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).</li>
<li>Wenzel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+Dopamine+Signals+in+the+Nucleus+Accumbens+that+Cause+Active+Avoidance+Require+Endocannabinoid+Mobilization+in+the+Midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain.</a> Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).</li>
<li>Spanos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptor-Dependent+Cholinergic+Modulation+of+Mesolimbic+Dopamine+Cell+Bodies%3A+Neurochemical+and+Behavioral+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).</li>
<li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+enhance+subsecond+dopamine+release+in+the+nucleus+accumbens+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats.</a> Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).</li>
<li>Melchior, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+versus+electrical+stimulation+of+dopamine+terminals+in+the+nucleus+accumbens+reveals+local+modulation+of+presynaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release.</a> Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies%2C+Fish%2C+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
<li>Robinson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+rapid+chemical+communication+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Monitoring rapid chemical communication in the brain.</a> Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+extracellular+dopamine+regulation+in+the+subregions+of+the+olfactory+tubercle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).</li>
<li>Ganesana, M., Venton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+transient+adenosine+during+cerebral+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury.</a> PLoS One. 13 (5), e0196932(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CIS-FSCV stanowi wyjątkową okazję do zbadania mechanizmów receptora VTA leżących u podstaw fazowego uwalniania DA. Istnieją dwa kluczowe kroki, aby zapewnić prawidłowe nagrywanie. Po pierwsze, należy uzyskać stabilny zapis linii bazowej, z niewielkim dryftem w wywołanym sygnale DA. Ważnym sposobem na zwiększenie prawdopodobieństwa ustanowienia stabilnego zapisu jest upewnienie się, że elektroda miała wystarczająco dużo czasu na cykle zarówno przy 60 Hz, jak i 10 Hz (zwykle 15 minut przy 60 Hz i 10 minut przy 10 Hz). Podc...

Fazyjne uwalnianie dopaminy (DA) z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) do jądra półleżącego (NAc) odgrywa istotną rolę w zachowaniach związanych z nagrodą. Neurony VTA DA przełączają się z tonicznego odpalania (3-8 Hz) na odpalanie podobne do wybuchu (>14 Hz)1, co powoduje fazowe uwalnianie DA w NAc. VTA wyraża różne receptory somatodendrytyczne, które są dobrze przygotowane do kontrolowania przejścia z tonicznego na impulsowe2,3,4,5. Określenie, które z tych receptorów i ich odpowiednich wejść kontrolują fazowe uwalnianie DA, pogłębi nasze zrozumienie tego, jak zorganizowane są obwody związane z nagrodą. Celem opisanej tutaj metodologii, połączonej infuzji i stymulacji z szybkoskanującą cykliczną woltamperometrią (CIS-FSCV), jest szybka i solidna ocena funkcjonalności receptorów VTA w sterowaniu fazowym uwalnianiem DA.
Termin połączona infuzja i stymulacja (CIS) odnosi się do farmakologicznego manipulowania receptorami w grupie neuronów (tutaj VTA) i stymulowania tych neuronów do badania funkcji receptora. U znieczulonego szczura stymulujemy elektrycznie VTA do wywołania dużego fazowego sygnału DA (1-2 μM) w rdzeniu NAc, mierzonego za pomocą szybkoskanującej cyklicznej woltamperometrii (FSCV). Wlewy leków farmakologicznych (tj. agonistów/antagonistów receptorów) w miejscu stymulacji mogą być stosowane do pomiaru funkcji receptorów VTA poprzez obserwację późniejszej zmiany w wywołanym fazowym uwalnianiu DA. FSCV to podejście elektrochemiczne, które cieszy się zarówno wysoką rozdzielczością przestrzenną (50-100 μm), jak i czasową (10 Hz) i dobrze nadaje się do pomiaru związanych z nagrodą, fazowych zdarzeń DA6,7. Ta rozdzielczość jest dokładniejsza niż inne pomiary neurochemiczne in vivo, takie jak mikrodializa. W związku z tym, CIS-FSCV jest dobrze przystosowany do oceny regulacji receptora VTA w fazowym uwalnianiu dopaminy.
Jednym z powszechnych sposobów badania funkcji receptora VTA jest użycie kombinacji podejść elektrofizjologicznych, które wyjaśniają, jak te receptory zmieniają szybkość uruchamiania neuronów1,8. Badania te są bardzo cenne w zrozumieniu, jakie receptory są zaangażowane w napędzanie DA po aktywacji. Jednak badania te mogą jedynie sugerować, co może się wydarzyć w dalszej części aksonu (tj. uwolnienie neuroprzekaźnika). CIS-FSCV opiera się na tych badaniach elektrofizjologicznych, odpowiadając na pytanie, w jaki sposób wynik wystrzeliwania serii VTA, fazowego uwalniania DA, jest regulowany przez receptory zlokalizowane na dendrytach VTA i ciałach komórkowych. W związku z tym CIS-FSCV doskonale nadaje się do wykorzystania w tych badaniach elektrofizjologicznych. Na przykład, aktywacja receptora nikotynowego może indukować wystrzeliwanie impulsów w klasie VTA9, a CIS-FSCV u znieczulonego szczura użyto do pokazania, że aktywacja nikotynowego receptora acetylocholiny (nAChR) w VTA kontroluje również fazowe uwalnianie DA w klasie NAc10,11.
Mechanistyczne badanie fazowej regulacji DA jest również powszechnie badane przy użyciu preparatów plastrowych wraz z kąpielą leków. Badania te często koncentrują się na presynaptycznej regulacji fazowego uwalniania DA z zakończeń dopaminy, ponieważ ciała komórkowe są często usuwane z klasy slice<sup="xref">12. Preparaty te są cenne do badania wpływu receptorów presynaptycznych na zakończenia dopaminowe, podczas gdy CIS-FSCV lepiej nadaje się do badania wpływu receptorów somatodendrytycznych na neurony dopaminowe, a także presynaptycznych wejść do VTA. To rozróżnienie jest ważne, ponieważ aktywacja receptora somatodendrytycznego w VTA może mieć inny efekt niż aktywacja receptora presynaptycznego NAc. Rzeczywiście, blokowanie dopaminergicznych presynaptycznych nAChR w NAc może zwiększyć fazowe uwalnianie dopaminy podczas strzelania seryjnego13, podczas gdy odwrotnie jest w VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV to idealne podejście do badania zdolności receptorów VTA do regulowania fazowego uwalniania DA. Co ważne, podejście to można wykonać u nienaruszonego szczura, zarówno znieczulonego, jak i swobodnie poruszającego się. Podejście to jest odpowiednie do badań ostrych, do badania funkcji receptora w jego stanie wyjściowym10,14, a także badań długoterminowych, które mogą ocenić zmiany funkcjonalne w receptorze po ekspozycji na lek lub manipulacji behawioralnej11,15.

<table><tbody><tr><td>Roztwór do napełniania elektrod/Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF286-5 (28 gauge)</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Sigma</td><td>236497-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P3911-25G</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody dostawy</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Ściągacz elektrod z <td>włókna węglowego</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td>Uwaga: można również stosować ściągacze poziome</td></tr><tr><td>Szklane systemy kapilarne</td><td>AM</td><td>626000</td><td></td></tr><tr><td>Izolowane druty do elektrod</td><td>Weico Drut i Wbudowany</td><td>UL 1423</td><td>Długość; 10 cm; średnica, 0,4 mm; musi być wykonany na zamówienie; materiał izolowany powinien zakrywać 5 cm drutu</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny (do oglądania i cięcia elektrody)</td><td>Fischer Scientific</td><td>M3700</td><td></td></tr><tr><td>Pin</td><td>Phoenix Enterprises</td><td>HWS1646</td><td>Do przylutowania na izolowanym drucie elektrody i elektrodzie odniesienia; łączy się z głowicą</td></tr><tr><td>Putty</td><td>Alcolin</td><td><a target="_blank" href="https://www.dickblick.com/items/23922-1003/">23922-1003</a></td><td>Służy do umieszczania elektrody podczas cięcia włókna węglowego</td></tr><tr><td>Scalpal Blade</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>Do cięcia włókna węglowego na odpowiednią długość</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>Sigma</td><td>327026-4G</td><td></td></tr><tr><td>FSCV Sprzęt/oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>U-Line</td><td>H-3618 (36" x 24" x 42")</td><td></td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroda stymulująca</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>przy zamówieniu poproś o cięcie 22 mm poniżej cokołu</td></tr><tr><td>TarHeel HDCV Software</td><td>University of North Carolina-Chapel Hill</td><td>-</td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank"> https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> do zamawiania informacji</td></tr><tr><td>UEI breakout box</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> do składania zamówień informacje Zasilacz</td></tr><tr><td>UEI</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td><a href="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank">https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/</a> do zamawiania informacji</td></tr><tr><td>Stimulator Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolator bodźca neurologicznego</td><td>Digitimer Sp. z o.o.</td><td>DS4</td><td>Neurolog 800A</td></tr><tr><td>Materiały infuzyjne/stymulacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>Pompa strzykawkowa New Era</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzna kaniula</td><td>PlasticsOne</td><td>C315I/SPC WEWNĘTRZNA 33GA</td><td></td></tr><tr><td>Mikrolitrowa strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>80308</td><td></td></tr><tr><td>Rurki</td><td>PlasticsOne</td><td>C313CT/ RURKI PKG 023 X 050 PE50</td><td></td></tr><tr><td>Materiały chirurgiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do kaniuli</td><td>Kopf Instruments</td><td>1776 P-1</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Vitality Medical</td><td>806</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Kopf Instruments</td><td>1770</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0501</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Jodine</td><td>Vitality Medical</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stoelting</td><td>Bone Anchor Screw/Pkg.of 100</td><td>1,59 mm OD, 3,2 mm długości</td></tr><tr><td>Srebrny drut referencyjny z AgCl</td><td>InVivo Metric</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>Gaza kwadratowa</td><td>Vitality</td><td>Medical 441408</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Instrumenty Kopf</td><td>Model 902 (kierownica z podwójnym ramieniem)</td><td></td></tr><tr><td>Materiały histologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formulin</td><td>Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosondy</td><td>wolframowe</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td>Leki do infuzji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>((2R)-amino-5-fosfonowalerian,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-asparaginian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek mekamylaminy (M9020-5mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9020</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek skopolaminy (S0929-1g)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0929</td><td></td></tr></tbody></table>

skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną fast-scan (cis-fscv) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Fazowe uwalnianie dopaminy (DA) z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) do jądra półleżącego odgrywa kluczową rolę w przetwarzaniu nagrody i uczeniu się przez wzmacnianie. Zrozumienie, w jaki sposób różnorodne wejścia neuronalne do VTA kontrolują fazowe uwalnianie DA, może zapewnić lepszy obraz obwodów, które kontrolują przetwarzanie nagrody i uczenie się przez wzmacnianie. W tym miejscu opisujemy metodę, która łączy infuzje donakologicznego agonistów i antagonistów do kaniuli VTA z fazowym uwalnianiem DA wywołanym stymulacją (połączona infuzja i stymulacja lub CIS), mierzona za pomocą szybkiej woltamperometrii cyklicznej in vivo (FSCV). Stosując CIS-FSCV u znieczulonych szczurów, fazową odpowiedź DA można wywołać poprzez elektryczną stymulację VTA za pomocą elektrody bipolarnej wyposażonej w kaniulę podczas nagrywania w jądrze półleżącym. Farmakologiczni agoniści lub antagoniści mogą być podawani bezpośrednio w miejscu stymulacji w celu zbadania roli określonych receptorów VTA w napędzaniu fazowego uwalniania DA. Główną zaletą CIS-FSCV jest to, że funkcja receptora VTA może być badana in vivo, w oparciu o badania in vitro.

Metoda CIS-FSCV została wykorzystana do zbadania funkcji receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR), nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChRs) oraz muskarynowych receptorów acetylocholiny (mAChRs) w obszarze VTA w kontekście stymulowania fazowego uwalniania DA w jądrze NAc. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane dla kontroli negatywnej, polegającej na infuzji 0,9% soli fizjologicznej, przed (baseline) i 9 min po infuzji (saline). <strong class="xfig...

Celem tego protokołu jest bezpośrednie manipulowanie receptorami brzusznego obszaru nakrywki w celu zbadania ich udziału w subsekundowym uwalnianiu dopaminy.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...

Takie podejście może pomóc w wyjaśnieniu roli specyficznego brzusznego obszaru nakrywki, receptorów somatodendrytycznych i fazowego uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pytania o kontrolę funkcji receptora nad fazowym uwalnianiem dopaminy można rozwiązać w nienaruszonym mózgu. Optymalizacja lokalizacji mikroelektrody z włókna węglowego i stymulatora bipolarnego może być wyzwaniem, a radą dla początkujących jest rozpoczęcie nagrywania w prążkowiu grzbietowym.Ze względu na stosowanie i manipulowanie wieloma rodzajami elektrod, w tym elektrodami rejestrującymi, referencyjnymi i stymulującymi, przydatny będzie wizualny przewodnik po tym, kiedy i gdzie te elektrody są wszczepiane. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, oczyść skórę głowy znieczulonego szczura trzema sekwencyjnymi peelingami jodopowidonowymi i 70% etanolem. Po ostatnim peelingu użyj wysterylizowanej pęsety igłowej i nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć wystarczającą ilość tkanki skóry głowy, aby zrobić miejsce na wszczepione elektrody.Delikatnie oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki za pomocą wysterylizowanych aplikatorów z bawełnianą końcówką przed nałożeniem dwóch do trzech kropli 3% nadtlenku wodoru, aby pomóc zidentyfikować lambda i bregma. Następnie użyj wiertła o średnicy jednego milimetra ustawionego na około 20 000 obrotów na minutę, aby wykonać otwór o średnicy 1,5 milimetra, 2,5 milimetra z przodu i 3,5 milimetra z boku do bregmy. Włóż o średnicy zewnętrznej 1.59 milimetra i długości 3.2 milimetra mniej więcej w połowie do otworu, aż śruba będzie mocno na swoim miejscu.Następnie wywierć otwór elektrody referencyjnej o średnicy jednego milimetra w lewej półkuli, 1,5 milimetra z przodu i 3,5 milimetra z boku do bregmy. Włóż około dwóch milimetrów drutu referencyjnego do otworu, owijając drut wokół i pod wszczepionej. Następnie całkowicie wszczepij, przytrzymując elektrodę referencyjną na miejscu.W prawej półkuli wywierć otwór o średnicy 1,5 milimetra, 1,2 milimetra z przodu i 1,4 milimetra z boku do bregmy i użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć oponę twardą. W przypadku elektrody stymulującej wywierć kwadratowy otwór na dwa milimetry przednio-tylny i pięć milimetrów przyśrodkowo-boczny, wyśrodkowany na 5,2 milimetra z tyłu i jeden milimetr bocznie do bregmy. Używając stereotaktycznych prętów naramiennych, opuść bipolarną kaniulę prowadzącą elektrody stymulującej pięć milimetrów poniżej opony twardej.Używając stereotaktycznych prętów ramienia, opuść mikroelektrodę z włókna węglowego cztery milimetry poniżej opony twardej w najbardziej grzbietowej części prążkowia i podłącz drut odniesienia i włókno węglowe do potencjostatu. Następnie zastosuj trójkątny przebieg o napięciu od minus 0,4 do 1,4 V, 400 V na sekundę przez 15 minut przy 60 Hz, a następnie 10-minutowy bodziec przy 10 Hz. Aby zoptymalizować lokalizację elektrody stymulującej, ustaw stymulator tak, aby wytwarzał bipolarny przebieg elektryczny o częstotliwości 60 Hz, 24 impulsach, prądzie 300 mikroamperów i szerokości impulsu fazowego wynoszącej dwie milisekundy.Delikatnie obniżaj stymulator w krokach co 0,2 milimetra od 5 do 7,8 milimetra poniżej opony twardej, stymulując VTA przy każdym kroku. Kontynuuj obniżanie kaniuli prowadzącej elektrody stymulującej bipolarnie, aż stymulacja spowoduje fazowe uwalnianie dopaminy na mikroelektrodzie z włókna węglowego w prążkowiu grzbietowym. Po zaobserwowaniu uwalniania dopaminy opuść mikroelektrodę z włókna węglowego, aż znajdzie się co najmniej sześć milimetrów poniżej opony twardej w najbardziej grzbietowej części jądra półleżącego.Gdy elektroda jest na swoim miejscu, stymuluj VTA i zapisz amplitudę piku dopaminy, a następnie obniż lub podnieś mikroelektrodę z włókna węglowego do miejsca, które wytwarza największe uwalnianie dopaminy, upewniając się, że szczyt odpowiedzi dopaminy jest reprezentowany jako wyraźny pik utleniania przy 0,6 V i pik redukcji przy minus 0,2 wolta. Po zoptymalizowaniu położenia kaniuli prowadzącej elektrodę z włókna węglowego i elektrody stymulującej, należy stymulować zwierzę co trzy minuty przez 20 do 30 minut. Po osiągnięciu stabilnej linii podstawowej, delikatnie opuść kaniulę wewnętrzną ręcznie do kaniuli prowadzącej wstępnie zamontowanej w stymulatorze bipolarnym i uzyskaj dodatkowe dwa do trzech zapisów linii podstawowej, aby potwierdzić, że wprowadzenie kaniuli nie spowodowało zmiany w wywołanym sygnale.Po ustaleniu wyjściowej odpowiedzi należy użyć pompy strzykawkowej i mikrostrzykawki, aby wprowadzić 0,5 mikrolitra roztworu leku będącego przedmiotem zainteresowania do VTA w ciągu dwóch minut. Po infuzji pozostaw wewnętrzną kaniulę na miejscu na co najmniej jedną minutę przed usunięciem, kontynuując rejestrowanie odpowiedzi co trzy minuty, aby zmierzyć efekty po infuzji. Jak wykazano na tych reprezentatywnych wykresach kolorystycznych, napar z soli fizjologicznej nie zmienia stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy.Wlew NMDA powoduje silny wzrost stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy, podczas gdy konkurencyjny antagonista receptora NMDA, AP5, powoduje znaczny spadek. Zarówno niekompetycyjny antagonista nikotynowego receptora acetylocholiny mekamylamina, jak i nieselektywny kompetycyjny antagonista receptora muskarynowego acetylocholiny skopolamina, powodują znaczny spadek stymulowanego fazowego uwalniania dopaminy. Na tym wykresie można zaobserwować podsumowanie działania badanych leków w czasie.Kaniulę infuzyjną należy ostrożnie wprowadzić do bipolarnej elektrody stymulującej. W przeciwnym razie może dojść do nadmiernych uszkodzeń, prowadzących do sztucznych zmian w fazowym uwalnianiu dopaminy. Podejście to pozwoliło badaczom na dokładniejsze przyjrzenie się specyficznym mechanizmom receptorowym, za pomocą których fazowe uwalnianie dopaminy jest regulowane in vivo.

combined-infusion-stimulation-with-fast-scan-cyclic-voltammetry-cis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.

Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Szybko-skanująca cykliczna woltamperometria może monitorować in vivo neurotransmisję dopaminy w kontekście leków, chorób i innych eksperymentalnych manipulacji. W niniejszej pracy opisano implementację QNsim1.0, oprogramowania do modelowania elektrycznie stymulowanych odpowiedzi dopaminy zgodnie z ilościowym modelem neurobiologicznym w celu ilościowego oszacowania dynamiki uwalniania i wychwytu zwrotnego dopaminy.

Modelowanie danych szybkiego skanowania woltamperometrii cyklicznej na podstawie elektrycznie stymulowanych danych neurotransmisji dopaminy przy użyciu QNsim1.0

W niniejszym artykule omawiamy metodologię oraz kwestie istotne dla łączenia TMS i fMRI w celu zbadania wpływu stymulacji mózgu na sieć stanu spoczynkowego.

Połączenie przezczaszkowej stymulacji magnetycznej i fMRI w celu zbadania sieci aktywności spoczynkowej (Default Mode Network)

W niniejszym artykule badamy wpływ stymulacji TMS w trybie Theta-Burst na plastyczność kory mózgowej u osób cierpiących na zespół kruchego chromosomu X oraz u osób w spektrum autyzmu.

TMS: Wykorzystanie protokołu Theta-Burst do badania mechanizmów plastyczności u osób z zespołem kruchego chromosomu X i autyzmem

Interfejs elektroda-tkanka w elektrodach do rejestracji sygnałów neuronalnych może być charakteryzowany za pomocą spektroskopii impedancyjnej (EIS) oraz woltamperometrii cyklicznej (CV). Zastosowanie polaryzacji napięciowej zmienia właściwości elektrochemiczne interfejsu elektroda-tkanka i może poprawić zdolność rejestracji. Polaryzacja napięciowa, EIS, CV oraz rejestracje neuronalne są metodami komplementarnymi.

Polaryzacja napięciowa, woltametria cykliczna i spektroskopia impedancyjna dla interfejsów neuronalnych

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Poznaj metodę CIS-FSCV do badania regulacji fazywnego uwalniania dopaminy przez receptory w VTA u szczurów. Technika umożliwia manipulację receptorami w nienaruszonym mózgu i pomiar odpowiedzi neurochemicznej w czasie rzeczywistym.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki (Wideo) | JoVE Journal

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Przeglądaj więcej filmów