Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo
3 kwietnia 2020
Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.
Opiszemy opartą na szablonach metodę mikrowzorów jednokomórkowych bez litografii, która pokonuje wiele przeszkód związanych z fotolitografią i miękką litografią. Szablony są wielokrotnego użytku, a proces jest niedrogi i można go dostosować. Metoda ta otworzyła nową drogę dla naukowców niebędących inżynierami do badania kształtu komórki i mechanotransdukcji indukowanej obszarowo w różnych kontekstach fizjologicznych i patologicznych.
Co więcej, protokół ten pozwala na mikrowzorcowanie tysięcy komórek, które można wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i modelowania chorób w naczyniu. Demonstracja wizualna ułatwi implantację dwóch kluczowych etapów: oderwania szkiełka nakrywkowego od hydrożelu, wystarczającego wysuszenia hydrożelu przed umieszczeniem szablonu. Przygotować roztwór hydrożelu poliakrylamidowego w nowej 50-mililitrowej probówce wirówkowej z propylenem, jak opisano w manuskrypcie.
Następnie, aby przygotować 5% roztwór fotoinicjatora, rozpuść składniki w 700 mikrolitrach 100% etanolu. Składniki nie są rozpuszczalne w wodzie, więc upewnij się, że całkowicie rozpuściły się przez wirowanie. Dodaj 300 mikrolitrów PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra.
Pracując na lodzie, rozcieńczyć roztwór podstawowy białka macierzy błony podstawnej lodowatym podłożem DMEM F12 lub 1X PBS do zoptymalizowanego stosunku rozcieńczenia. Przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania. Podczas pracy z matrycą membrany podstawnej należy zawsze pracować na lodzie i używać lodowatych roztworów w schłodzonych końcówkach i rurkach do pipet.
Umieść lampę ławkową UV w okapie bezpieczeństwa biologicznego. Następnie umieść przygotowane wcześniej wysterylizowane folie parafinowe. Jeśli folie parafinowe nie są całkowicie suche, użyj systemu zasysania próżniowego, aby usunąć resztki cieczy.
Za pomocą autoklawowanych kleszczy umieść sześć autoklawowanych szkiełek nakrywkowych na folii parafinowej po sześć na każdej szalce Petriego. Aby przygotować końcowy roztwór poliakryloamidu sieciowany promieniami UV, należy rozcieńczyć roztwór fotoinicjatora roztworem prekursora hydrożelu poliakryloamidowego. Wysterylizuj roztwór za pomocą 50-mililitrowej jednostki filtrującej o wielkości porów 0,22 mikrometra.
Następnie naniej 200 mikrolitrów końcowego roztworu końcowego poliakryloamidu sieciowanego promieniami UV na każde z sześciu szklanych szkiełek nakrywkowych na szalkach Petriego. Używając autoklawowanych kleszczyków, ostrożnie przykryj każde szkiełko nakrywkowe drugim szkiełkiem nakrywkowym, zatrzymując warstwę roztworu między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Umieść szalki Petriego zawierające szkiełka nakrywkowe pod lampą UV z otwartą pokrywką.
Pokrycie białego papieru na powierzchni innej niż biała jest ważne, aby zminimalizować utratę intensywności promieniowania UV. W celu ochrony przed promieniowaniem UV należy przykryć lampę folią aluminiową. Fotopolimeryzuj hydrożele poliakrylamidowe przez pięć minut.
Użyj żyletki, aby ostrożnie oddzielić każdą parę szkiełek nakrywkowych. Napełnić zbiornik zawierający sześć hydrożelowych kompozytów nakrywkowych PBS. Po płukaniu przez pięć minut należy umieścić hydrożelowe szkiełka nakrywkowe z powrotem w folii parafinowej na szalce Petriego.
Uzyskać probówkę Sulfo-SANPAH z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dodaj 1 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego PBS do probówki i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Dozować 200 mikrolitrów rozcieńczonego Sulfo-SANPAH na folię parafinową na szalce Petriego.
Umieścić hydrożelowy kompozyt nakrywkowy na Sulfo-SANPAH z hydrożelem stykającym się z Sulfo-SANPAH. Następnie umieść hydrożelowe kompozyty nakrywkowe pod lampą UV i naświetlaj je na pięć minut, aby aktywować Sulfo-SANPAH. Jeśli Sulfo-SANPAH zmieni kolor z pomarańczowego na brązowy, wskazując na pomyślną aktywację i włączenie, przejdź do następnych kroków w ciągu 10 minut.
Uzupełnij jednorazowy zbiornik polipropylenowy świeżym PBS. Przenieść aktywowane hydrożelowe kompozyty nakrywkowe do zbiornika i krótko je przepłukać w celu usunięcia niezwiązanego Sulfo-SANPAH. Umieść hydrożelowe kompozyty nakrywkowe na folii parafinowej na szalkach Petriego i ostrożnie przetrzyj je sterylnymi, niestrzępiącymi się chusteczkami.
Umieść szablon na wierzchu każdego hydrożelowego kompozytu nakrywkowego. Aby zapewnić szczelne uszczelnienie między szablonem a kompozytem, usuń nadmiar wilgoci, przecierając je autoklawowanymi, niestrzępiącymi się chusteczkami. Ostrożnie dozować rozcieńczony roztwór białka macierzy błony podstawnej, umieszczając 200 mikrolitrów na wierzchu każdego hydrożelowego kompozytu nakrywkowego.
Inkubuj konstrukty przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś kompozyty na płytkę sześciodołkową. Szczelne uszczelnienie między hydrożelem a szablonem można łatwo zweryfikować, obserwując, czy roztwór białka matrycy został zatrzymany na wierzchu szablonu.
Brak szczelnego uszczelnienia prowadzi do szybkiego wycieku roztworu białkowego przez otwory. Całkowicie zanurz kompozyty w PBS. Za pomocą autoklawowanej pęsety ostrożnie oderwij szablony od hydrożeli, nie rozrywając hydrożeli.
Wyjmij PBS ze studzienek i ponownie napełnij studzienki DMEM. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu płytki z inkubatora należy zbadać DMEM.
Jeśli DMEM nie jest mętny, hydrożelowe kompozyty nakrywkowe są gotowe do użycia do powlekania komórek. Stworzono szablony zawierające tablice kwadratów i prostokątów. Z szablonów stworzono mikrowzorzyste podłoża hydrożelowe i uzyskano wyspy białka matrycy.
Uzyskano również wyspy komórkowe. Na przykład wyspy indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych. Stężenie białka macierzy odegrało istotną rolę w generowaniu prawidłowych wzorców.
Optymalne stężenie doprowadziło do jednorodnego rozmieszczenia białek. Nieoptymalne stężenia roztworu białka matrycowego doprowadziły do nieoptymalnego wzorcowania. Bardzo ważne jest, aby użyć przedniej strony szablonu.
Jeśli używana jest tylna strona szablonu, rozmiar wysp białkowych matrycy zwiększa się ze względu na kierunek cięcia laserowego. Podczas gdy użycie tylnej strony szablonu nie wpłynęło znacząco na szerokość prostokątnych wzorów, wysokość znacznie wzrosła, co doprowadziło do zmniejszenia zamierzonych proporcji. Wzory oparte na szablonach zastosowano na podłożach z elastomeru krzemowego.
Wzorzyste kardiomiocyty na podłożach z elastomeru krzemowego uwidoczniono za pomocą immunocytochemii sercowej troponiny T przy małym powiększeniu i białka sarkomerowego alfa-aktyniny przy dużym powiększeniu. Wzór oparty na szablonie zastosowano również do umieszczenia dwóch kardiomiocytów obok siebie na hydrożelach o różnej sztywności. Odkrycie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych i odpowiadających im protokołów różnicowania sprawiło, że jest to idealny model człowieka in vitro do badania onkogenezy i patogenezy.
Jednak głównym ograniczeniem stosowania systemu IPS jest brak struktury mikrośrodowiska, które ma szczególny skład biochemiczny i sztywność do interakcji z komórkami. Wzór można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami immunocytochemicznymi w celu scharakteryzowania struktury i funkcji kardiomiocytów. Analiza typów komórek pochodzących z IPS, w naszym przypadku kardiomiocytów, w bardziej fizjologicznej morfologii otwiera możliwości badania trudnych kardiomiocytów w naczyniu hodowlanym.
Technika ta może być również stosowana w wielu innych systemach, takich jak płyty sitowe o wysokiej zawartości. Kształt i podłoże można łatwo dostosować do zastosowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę mikrowzorowania opartą na szablonach, która nie wymaga litografii i jest dostępna dla badaczy z ograniczonym doświadczeniem w inżynierii biomedycznej. Metoda ta wykorzystuje wielorazowe szablony wycinane laserowo do mikrowzorowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej, co umożliwia modulowanie morfologii komórek, w szczególności kardiomiocytów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Bioinżynieria
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wprowadzenie
- Tradycyjne metody fotolitografii i litografii miękkiej mogą być złożone i kosztowne.
- Ta nowa metoda została zaprojektowana tak, aby była niedroga i możliwa do dostosowania.
- Umożliwia ona badaczom spoza obszaru inżynierii zgłębianie kształtu komórek oraz mechanotransdukcji.
- Mikrowzorowanie można zastosować do tysięcy komórek w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
Cel badania
- Aby zapewnić prostą metodę mikrowzorowania, która będzie dostępna dla szerszego grona badaczy.
- Aby ułatwić badania nad morfologią komórek i mechanotransdukcją w różnych kontekstach.
- Aby umożliwić wysokoprzepustowe przesiewanie leków oraz modelowanie chorób.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu hydrożelu poliakrylamidowego.
- Wykorzystanie szablonów wycinanych laserowo do mikrowzorowania.
- Oddzielenie szkiełka nakrywki od hydrożelu.
- Suszenie hydrożelu przed umieszczeniem szablonu.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne wzorcowanie białek macierzy pozakomórkowej.
- Wykazano możliwość efektywnej modulacji morfologii komórek.
- Podejście to umożliwia zastosowania wysokoprzepustowe.
- Prezentacje wizualne ułatwiają zrozumienie protokołu.
Wnioski
- Ta metoda bez użycia litografii upraszcza proces mikrowzorowania.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w dziedzinie biologii komórki i mechanotransdukcji.
- Protokół ten nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań w badaniach biomedycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda mikrowzorowania oparta na szablonach, niewymagająca litografii, niweluje bariery dostępności w analizach pojedynczych komórek, umożliwiając szerszym zespołom badawczo-rozwojowym badanie mechanotransdukcji i determinacji losu komórek bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy z zakresu mikrofabrykacji. Dzięki wspieraniu wysokoprzepustowego wzorowania tysięcy komórek, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w procesach walidacji celów i przesiewania fenotypowego. Podejście to zmniejsza złożoność techniczną oraz koszty, ułatwiając skalowalną adaptację w początkowych etapach odkrywania leków oraz w rozwoju modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modulację kształtu i rozmiaru komórek w celu badania szlaków mechanotransdukcji w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia solidną, niedrogą platformę do funkcjonalnej walidacji celów z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z iPSC oraz innych typów komórek.
- Wiarygodność prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez generowanie ilościowych odczytów morfologicznych i funkcjonalnych, które ograniczają ryzyko związane z założeniami mechanistycznymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszej oceny związków poprzez tworzenie standaryzowanych podłoży mikrowzorowanych z kontrolowaną prezentacją macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki zastosowaniu wielokrotnego użytku szablonów wycinanych laserowo oraz spójnego wzorowania białek na bazie hydrożeli.
- Skalowalność: Wspiera gotowość do wysokoprzepustowych przesiewów poprzez tworzenie macierzy obejmujących do 2 000 komórek na eksperyment, co ułatwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz profilowanie fenotypowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla chorób: Ma zastosowanie do kardiomiocytów pochodnych z iPSC, umożliwiając badanie prostokątnych morfologii przypominających komórki dorosłe, które lepiej modelują fizjologiczną mechanotransdukcję w kontekście chorób serca.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi, umożliwiając ocenę struktury i funkcji komórek przy różnych sztywnościach podłoża, co wspiera dopasowanie biomarkerów i postępy dostosowane do poziomu ryzyka.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność w relacjach fenotyp-genotyp poprzez izolację wpływu geometrii komórki na szlaki sygnalizacyjne, co zwiększa wartość prognostyczną dla translacji in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację wiodących związków (lead identification), zapewniając ustandaryzowane przygotowanie komórek do analiz mechanistycznych i fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie precyzyjnej kontroli kształtu i powierzchni komórek w celu badania mechanotransdukcji w modelach pochodzących z iPSC.
- Screening: Zapewnia gotowość testów i wyniki ilościowe dzięki powtarzalnemu mikrowzorcowaniu tysięcy komórek, co umożliwia niezawodny screening związków w zastosowaniach modelowania chorób.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, takie jak orientacja komórek, tworzenie wysp białkowych i parametry morfologiczne, które pomagają zespołom porównywać warunki w ramach perturbacji genetycznych lub farmakologicznych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie wzorcowania na substratach o regulowanej sztywności (np. elastomerze krzemowym) w celu oceny odpowiedzi zależnych od sztywności, istotnych dla włóknistych lub niedokrwiennych modeli serca.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje podejście oparte na szablonach jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w różnych projektach, redukując redundantne przygotowania i umożliwiając adopcję międzyzespołową w platformach mechanobiologii i screeningu fenotypowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki kontrolowanemu mikrowzorcowaniu pojedynczych komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu wielokrotnego użytku szablonów oraz wzorcowaniu opartego na hydrożelach, kompatybilnym ze standardowymi procedurami hodowli komórkowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania fenotypowych odpowiedzi zależnych od kształtu, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach w programach skoncentrowanych na układzie sercowo-naczyniowym i mechanotransdukcji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez generowanie wysokotreściowych danych powiązanych z morfologią, które stanowią podstawę do wyboru celu i optymalizacji wiodących związków.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu hodowli komórkowych i biologii molekularnej; nie jest wymagane specjalistyczne szkolenie z zakresu mikrowytwarzania.
- Metoda zależy od dostępu do źródła światła UV, wytwarzania szablonów wycinanych laserowo (możliwość zlecenia na zewnątrz) oraz standardowych odczynników do hydrożeli (np. akryloamidu, Sulfo-SANPAH).
- Konieczna jest standaryzacja orientacji szablonów i przygotowania hydrożelu w obrębie zespołu, aby zapewnić spójne wzorowanie białek i kontrolę współczynnika proporcji.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują kompatybilność podłoża (np. szkło, elastomery) oraz optymalizację białek macierzy pozakomórkowej dla konkretnych typów komórek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego obchodzenia się z szablonem, aby uniknąć rozdarcia hydrożelu, oraz precyzyjne przestrzeganie czasu aktywacji Sulfo-SANPAH w celu zapewnienia efektywnej immobilizacji białek.
