Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Metoda ta opisuje pełną ścieżkę projektowania, montażu i charakterystyki miceli kompleksu polielektrolitu, które są nanocząstkami powstającymi w wyniku samoorganizacji przeciwnie naładowanych polimerów. Niektóre główne wyzwania związane z samoorganizacją polielektrolitu to unikanie pułapek kinetycznych i charakteryzacja nanocząstek. Opisana przez nas technika wyżarzania solnego pozwala na powtarzalne składanie miceli o niskiej dyspersji zarówno pod względem wielkości, jak i kształtu oraz opisujemy metody charakteryzacji, w tym rozpraszanie światła, rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i mikroskopię elektronową.

Dostarczanie terapeutycznych kwasów nukleinowych jest długotrwałym wyzwaniem dla nanomedycyny. Te micele kompleksu polielektrolitowego wykorzystują silny ładunek ujemny kwasu nukleinowego do sekwestracji ich w rdzeniu miceli, gdzie neutralna korona polimerowa chroni je przed nukleazami i odpowiedzią immunologiczną. Metoda montażu powinna mieć zastosowanie do każdego rodzaju naładowanych polimerów.

Przetestowaliśmy je z kilkoma polianionami i polikationami, a metoda charakterystyki powinna mieć zastosowanie do wszelkich samoorganizujących się nanocząstek, w tym nanocząstek środków powierzchniowo czynnych i innych systemów napędzanych hydrofobicznie. Rozpocznij od inkubacji roztworu oligonukleotydu w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji schłodzić go przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu termicznego wyżarzania kwasów nukleinowych, a następnie dodać 40 mikrolitrów kopolimeru diblokowego o 20 milimolowym stężeniu naładowanym.

Natychmiast wymieszać roztwór i inkubować go przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić wyżarzanie solne, dodaj roztwór chlorku sodu do roztworu oligonukleotydów o końcowym stężeniu jednego molowca i wiruj go przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie włożyć ją do wkładu dializacyjnego.

Przed załadowaniem oznacz wkłady markerem permanentnym i zanurz je w buforze na co najmniej dwie minuty, aby nawodnić membrany. Zdejmij nakrętkę, przekręcając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i załaduj próbkę za pomocą końcówki do pipety z żelem. Delikatnie ściśnij membranę, aby usunąć nadmiar powietrza i załóż nakrętkę.

Umieść wkłady w 1X PBS 0,5 molowej kąpieli dializacyjnej chlorku sodu, upewniając się, że unoszą się na wodzie, a obie membrany są wystawione na działanie kąpieli. Po 24 godzinach przenieś wkłady do 1X PBS i moczyć je przez dodatkowe 24 godziny. Po końcowej dializie odzyskać próbkę, wyjmując wkłady z kąpieli, zdejmując nakrętkę i usuwając próbkę za pomocą końcówki do pipety z żelem.

Umieść próbkę w czystej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówek i wstaw do lodówki, aż będzie gotowa do użycia. Przygotuj próbkę w instrumencie DLS zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie zbieraj dane przez co najmniej jedną minutę, upewniając się, że szybkość zliczania jest stała przez cały czas pozyskiwania. Sprawdź dane autokorelacji.

Długotrwała linia bazowa powinna być płaska, a krzywa autokorelacji powinna być gładka z minimalnym rozrzutem. Szum w danych można poprawić, pozyskując więcej danych. Aby przeprowadzić redukcję i analizę danych za pomocą Irena, zacznij od zaimportowania miceli w zestawach danych w tle.

Wykreślić próbkę i tło razem na skali logarytmicznej i obliczyć stosunek próbki do tła i sprawdzić asymptotę wysokiego Q. Oblicz średni współczynnik w tym zakresie Q i użyj makra manipulowania danymi, aby przeskalować tło za pomocą obliczonego współczynnika. Następnie wykreśl sygnał odjęty w tle przez Q i zapisz dane pod nową nazwą, upewniając się, że nie nadpisujesz oryginalnych danych.

Otwórz makro modelowania, a następnie załaduj i wykreśl odjęte dane w tle. Aby znaleźć przybliżony model zewnętrznej powierzchni kompleksu polielektrolitu miceli lub PCM, wybierz przepływ do umiarkowanego zakresu Q w kontrolkach danych, upewniając się, że uwzględniono oscylacje, jeśli są obecne. W kontrolkach modelu wybierz pierwszą populację rozproszenia i upewnij się, że jest ona jedyną używaną.

Wybierz rozkład rozmiaru dla modelu, wybierz żądany typ rozkładu i wybierz współczynnik kształtu. Ten przykład dotyczy elastycznego cylindra, który należy dodać ręcznie w ramach współczynnika kształtu użytkownika. Pobierz i dodaj elastyczny współczynnik kształtu cylindra, a następnie wprowadź nazwy funkcji i wartości początkowe dla parametrów jeden i dwa, które odpowiadają odpowiednio długości cylindra i długości Kuhna.

Cylindry te są dłuższe niż te, które mogą być rozwiązane przez SAXS, więc parametr długości cylindra jest ustalony na dużą wartość. Ustaw początkowe parametry wyszukiwania, wprowadzając wartości w polach skali, średniej wielkości i szerokości. Następnie kliknij przycisk Oblicz model, aby narysować wynikowy współczynnik kształtu.

Po znalezieniu rozsądnych parametrów kliknij przycisk Dopasuj model, aby wykonać nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do danych. Następnie należy zamodelować rozproszenie poszczególnych polimerów w rdzeniu PCM. Dostosuj elementy sterujące danymi, aby wybrać zakres Q, w którym występuje nadmierne rozpraszanie, który zwykle mieści się w zakresie od umiarkowanego do wysokiego.

Dodaj drugą rozproszoną populację i upewnij się, że jest to jedyna używana populacja. Wybierz ujednolicony poziom modelu, dostosuj współczynniki GDA G i RG, aby upewnić się, że model nie przewiduje nadmiernego rozpraszania przy niskim Q i użyj makra dopasowania PB między kursorami, aby uzyskać wstępne przypuszczenie dla tych parametrów. Jeśli chodzi o współczynnik kształtu, należy wykonać nieliniowe dopasowanie dla modelu ujednoliconego poziomu.

Jeśli pik dyfrakcyjny jest obecny, należy dodać trzeci model dla piku dyfrakcyjnego w zakresie Q będącym przedmiotem zainteresowania. Po uzyskaniu przybliżonych wartości dopasowania dla poszczególnych populacji rozpraszających, włącz wszystkie trzy razem i zoptymalizuj połączone dopasowanie. Na koniec sprawdź, czy każda wartość pozostaje fizycznie uzasadniona i zapisz dopasowanie, wybierając opcję Przechowuj w folderze.

Wynikiem tej procedury powinien być złożony model, który dobrze opisuje dane dotyczące rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w szerokim zakresie skal rozmiarów. Protokół ten został wykorzystany do zaprojektowania, złożenia i scharakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitu kwasu nukleinowego lub PCM. Rozmiar rdzenia miceli zależy przede wszystkim od długości naładowanego bloku kopolimeru blokowego i jest w dużej mierze niezależny od długości homopolimeru.

Uzyskano dane dotyczące dynamicznego rozpraszania światła dla sferycznych PCM utworzonych ze stosunkowo długich kopolimerów blokowych w krótkich jednoniciowych oligonukleotydach. Funkcja autokorelacji rozpadła się do płaskiej wartości z pojedynczą skalą czasową, co spowodowało pojedynczy pik wielkości w rozkładzie wielkości repIS. Złożone widma promieniowania rentgenowskiego małych aniołów lub widma intensywności SAXS można dokładnie dopasować, łącząc modele dla wielu korelacji przestrzennych, które są obecne, a wielokątowe rozpraszanie światła można wykorzystać do rozszerzenia pomiarów rozpraszania na dłuższe skale.

PCM o różnej morfologii można również obrazować za pomocą mikroskopii elektronowej w celu sprawdzenia, czy promienie i kształt rdzenia są zgodne z wartościami uzyskanymi z dopasowania danych SAXS. Podczas dopasowywania danych SAXS ważne jest, aby uwzględnić każdą funkcję rozpraszania i używać metod uzupełniających, takich jak TEM, aby upewnić się, że używasz właściwego współczynnika kształtu.