Name: Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę montażu i charakteryzacji miceli kompleksu polielektrolitu przy użyciu techniki solnego wyżarzania. Protokół ten umożliwia uzyskanie nanocząstek o niskiej dyspersji rozmiaru i kształtu, co ma zastosowanie w dostarczaniu terapeutycznych kwasów nukleinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Philowi Griffinowi i Terze Lavoie z Zakładu Charakterystyki Miękkiej Materii i Zaawansowanego Ośrodka Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie w Chicago. Dziękujemy również Xiaobing Zuo i Soenke Seifert z Advanced Photon Source w Argonne National Laboratory i NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) za wsparcie. Dziękujemy Jeffowi Tingowi i Michaelowi Lueckheide za ich wkład w tę pracę.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak wspomniano powyżej, przedstawione tutaj protokoły są napisane z naciskiem na oligonukleotydy jako składnik polianionu i pLys-PEG jako kationowo-obojętny kopolimer blokowy, ale przetestowaliśmy je z różnymi polimerami, takimi jak poli(kwas akrylowy), poliglutaminian i PEG-poli(dimetyloamonian winylobenzylu) i uważamy, że będą one ogólnie stosowane dla większości par polielektrolitów. Jednym z parametrów, który może wymagać optymalizacji, jest stężenie soli używane do wyżarzania, ponieważ powinno być na tyle wysokie, a...

Gdy przeciwnie naładowane polielektrolity są mieszane w roztworze wodnym, przyrost entropii wynikający z uwolnienia ich przeciwjonów powoduje wymieszanie roztworu na fazę skondensowaną bogatą w polimer i supernatant zubożony w polimer1,2,3,4,5, zjawisko znane jako kompleksowanie polielektrolitów. Jeśli neutralny blok hydrofilowy jest sprzężony z jednym lub obydwoma polielektrolitami, zamiast tego następuje separacja faz w nanoskali (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Powstałe w ten sposób samoorganizujące się nanocząstki typu rdzeń-powłoka są różnie określane jako micele kompleksu polielektrolitu (PCM), micele kompleksu polijonowego, kompleksy jonomerów blokowych lub micele z rdzeniem koaceracyjnym przez analogię do micelizacji środków powierzchniowo czynnych, mimo że wszystkie składniki systemu są hydrofilowe6,7. Zdolność PCM do hermetyzacji cząsteczek hydrofilowych, takich jak białka i kwasy nukleinowe, a także szerokie możliwości przestrajania oferowane przez architekturę nośnika kopolimeru blokowego sprawiają, że są one atrakcyjnymi kandydatami do dostarczania cząsteczek terapeutycznych in vivo8,9,10,11,12,13.
Dostarczanie terapeutycznych kwasów nukleinowych do celów komórkowych jest szczególnie ważnym wyzwaniem, dla którego PCM oferują wiele korzyści. Terapeutyczne kwasy nukleinowe (genetyczne DNA, mRNA i oligonukleotydy, takie jak siRNA) mają ogromny potencjał w zakresie poprawy zdrowia ludzkiego, ale muszą pokonać liczne bariery biologiczne i fizyczne, aby wykorzystać ten potencjał14,15,16. Nagie kwasy nukleinowe są rozkładane przez nukleazy surowicy i komórki, są szybko usuwane z krążenia, a ich silny ładunek ujemny utrudnia im przenikanie przez błony komórkowe bez pomocy. Obecne podejścia do pokonywania tych barier obejmują kosztowne modyfikacje chemiczne w celu zapobiegania uszkodzeniom spowodowanym nukleazami i/lub enkapsulacją w różne nanocząstki lipidowe powstałe w wyniku oddziaływań hydrofobowych15,17,18. Chociaż metody te okazały się skuteczne w przypadku miejscowych wstrzyknięć i celowania w wątrobę, stosowanie ogólnoustrojowe wiąże się ze znacznymi ograniczeniami toksyczności, immunogenności i ograniczonej biodystrybucji16. W przeciwieństwie do tego, PCM wykorzystują ujemny ładunek kwasów nukleinowych do ich kondensacji w rdzeniu oddzielonym fazowo, podczas gdy neutralna korona zapewnia barierę steryczną przed degradacją, a także platformę do włączania ligandów w celu zwiększenia celowania lub internalizacji11,19. Badania in vitro i na zwierzętach wykazały, że PCM mogą skutecznie dostarczać różne ładunki kwasów nukleinowych20,21,22,23,24, ale słabości naszej zdolności do przewidywania właściwości PCM, takich jak rozmiar, kształt i stabilność na podstawie właściwości polimerów składowych, utrudniły ich szersze zastosowanie.
Ostatnie prace naszej grupy i innych osób w tej dziedzinie zaczęły rozwiązywać ten problem poprzez rozwijanie relacji struktura-właściwość, a w niektórych przypadkach struktura-właściwość-funkcja dla PCM utworzonych z kwasów nukleinowych i różnych neutralnych kationowo polimerów7,25,26,27. Dwa spójne tematy, które wyłoniły się z tych badań, to znaczenie opracowania dobrze kontrolowanych, powtarzalnych protokołów składania PCM oraz korzyści płynące z zastosowania wielu technik do scharakteryzowania powstałych nanocząstek. Polielektrolity, szczególnie te o dużej gęstości ładunku, takie jak kwasy nukleinowe, oddziałują ze sobą bardzo silnie i wydają się łatwo ulegać kinetycznemu uwięzieniu po zmieszaniu, co powoduje, że preparaty PCM są bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w procedurze i wykazują wysoką polidyspersyjność oraz słabą powtarzalność z partii na partię. Wykazano również, że PCM przyjmują szeroki zakres kształtów i rozmiarów w zależności od konfiguracji na poziomie atomowym ich składników, a uchwycenie tej różnorodności za pomocą dowolnej indywidualnej techniki charakteryzacji jest bardzo trudne, zwłaszcza że niektóre popularne techniki, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), wymagają założeń dotyczących kształtu cząstek do ich interpretacji.
W tym artykule omawiamy projektowanie i wybór materiałów dla PCM, ze szczególnym uwzględnieniem oligonukleotydów i kationowo-neutralnych kopolimerów diblokowych. Następnie opisujemy protokół wyżarzania solnego, który wykorzystuje wysokie stężenia soli, a następnie powolną dializę, aby uniknąć pułapki kinetycznej podczas montażu PCM. Polielektrolity są mieszane w warunkach o wysokiej zawartości soli, w których przyciąganie elektrostatyczne jest przesiewane, a następnie stężenie soli jest powoli obniżane, aby polielektrolity mogły osiąść w najbardziej korzystnych energetycznie konfiguracjach, analogicznie do procesu powolnego chłodzenia wyżarzania termicznego. Korzystając z tego protokołu, regularnie jesteśmy w stanie osiągnąć wyjątkowo niską polidyspersyjność i wysoką powtarzalność dla oligonukleotydowych PCM7,26. Na koniec opisujemy, w jaki sposób cztery oddzielne techniki pomiarowe mogą być wykorzystane do scharakteryzowania PCM w bardzo szerokim zakresie skal długości, od morfologii zewnętrznej po strukturę wewnętrzną: DLS, wielokątowe rozpraszanie światła (MALS), rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Mamy nadzieję, że te protokoły umożliwią większej liczbie badaczy skuteczne zbadanie możliwości tych interesujących nanocząstek.
Wybór i przygotowanie polimerów 
Na właściwości PCM duży wpływ mają właściwości fizyczne i chemiczne polimerów składowych, co sprawia, że wybór polimeru jest krytycznym krokiem w procesie projektowania. Najbardziej dobrze scharakteryzowanymi kopolimerami blokowymi dla PCM kwasów nukleinowych są dibloki liniowe, takie jak poli(lizyna)-poli(glikol etylenowy) (pLys-PEG), ale PCM mogą być tworzone między polielektrolitami a różnymi hydrofilowymi polimerami o neutralnym ładunku, które mogą być generowane w sposób wysokoprzepustowy28. Wybór naładowanej grupy silnie wpływa na stabilność parowania jonów i kształt miceli26, a wykazano, że rozmiar PCM zwiększa się wraz z długością naładowanego bloku5,7,26 (Rysunek 2), co pozwala na dostosowanie właściwości PCM do wymagań pożądanego zastosowania. W przypadku dibloków liniowych stwierdziliśmy, że naładowany blok powinien mieć co najmniej 10 ładunków i być silnie naładowany przy pożądanym pH. Dłuższe naładowane bloki mogą sprzyjać tworzeniu się PCM z oligonukleotydami, takimi jak siRNA, które są trudne do skompleksowania z krótszymi blokami21. Udało nam się zaobserwować powstawanie PCM przy długościach bloków do 200, a literatura opisuje dłuższe polimery. Większa elastyczność jest dostępna w wyborze bloków neutralnych24, ale doświadczenie pokazuje, że bardzo krótkie bloki neutralne prowadzą do agregacji, a nie do tworzenia nanocząstek, a minimalna długość neutralnego bloku wzrasta wraz z długością naładowanego bloku. W przypadku pLys-PEG wymagany jest PEG MW wynoszący co najmniej 3 000–5 000 dla długości pLys poniżej ~50, a większe długości są wymagane w miarę dalszego zwiększania naładowanego bloku. Zwiększona długość neutralnego bloku powoduje zwiększenie rozmiaru PCM, szczególnie grubości powłoki, ze względu na steryczne stłoczenie neutralnych polimerów.
Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania PCM z liofilizowanych pLys-PEG o wysokiej czystości i oligonukleotydów o znanej ilości, ale powinien być również łatwo adaptowalny do innych systemów. Przetestowaliśmy go z powodzeniem z kilkoma naładowanymi polipeptydami, w tym poliargininą i kwasem poliglutaminowy, a także kilkoma syntetycznymi polielektrolitami, takimi jak kwas poliakrylowy i poli(winylobenzylotrimetyloamon). Opisujemy również przygotowanie PCM ze stosunkiem stechiometrycznym ładunków polielektrolitowych, ale można to łatwo zmodyfikować. Uważamy, że najłatwiej jest pracować w jednostkach koncentracji ładunku (c.c.), które w naturalny sposób również uwzględniają polimery, które nie są w pełni naładowane. Jeśli którykolwiek z polimerów nie jest dobrze scharakteryzowany, należy zadbać o dokładne określenie długości/masy polimeru i upewnić się, że nadmiar soli nie jest obecny poza tym, który jest potrzebny do neutralizacji ładunku przez dializę, na przykład. Przy obliczaniu stężeń należy również uwzględnić obecność zatrzymanej wody. Stężenie kwasu nukleinowego można wygodnie określić ilościowo za pomocą absorbancji przy 260 nm, a przy obliczaniu cc należy wziąć pod uwagę obecność lub brak końcowych fosforanów.
Podczas używania oligonukleotydów jako polianionów, stan hybrydyzacji i struktura chemiczna pomagają określić skłonność do samoorganizacji i cechy wynikowego PCM5,7,26. Ich optymalizacja, w ramach wymagań dotyczących skuteczności biologicznej w przypadku stosowania PCM do dostarczania, zwiększy prawdopodobieństwo powstania pożądanych struktur. Pomocne narzędzia do analizy hybrydyzacji obejmują funkcje MATLAB dla kwasów nukleinowych, NUPACK29 i IDT OligoAnalyzer. Zalecamy przeanalizowanie sekwencji kandydującej, aby zrozumieć siłę wiązania z 1) sobą w formacji spinki do włosów; 2) inna kopia tej samej sekwencji (samościemniacz); oraz 3) do innych oligonukleotydów obecnych w układzie. Temperatury topnienia DNA i RNA dla określonej sekwencji można również obliczyć za pomocą metody najbliższego sąsiada30,31. Wyżarzanie termiczne kwasów nukleinowych (krok 2.3) denaturuje wszelkie resztkowe struktury drugorzędowe w poszczególnych nukleotydach i sprzyja fałdowaniu równowagi.
Charakterystyka i analiza PCM 
Dostępnych jest wiele technik charakteryzowania nanocząstek, w tym statyczne i dynamiczne rozpraszanie światła, rozpraszanie elektronów lub neutronów pod małymi kątami oraz mikroskopia elektronowa. W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i dwóch technik mikroskopii elektronowej.
DLS mierzy autokorelację fluktuacji czasowych w intensywności rozpraszania pod jednym kątem od ruchu Browna próbki. Dopasowanie tych danych może zapewnić promień hydrodynamiczny i polidyspersyjność dla sferycznych miceli (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) mierzy intensywność rozpraszania statycznego pod wieloma kątami. Ta zależność kątowa opisuje kształt nanocząstki, ale jest ograniczona do skal długości dłuższych niż ~50 nm dla światła widzialnego, co ogranicza jej skuteczność dla mniejszych nanocząstek. Obie techniki opierają się na niedopasowaniu współczynnika załamania światła i opisują przede wszystkim zewnętrzne wymiary nanocząstki.
Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wykorzystuje promieniowanie rentgenowskie jako sondę rozpraszającą, a ich krótsza długość fali pozwala na pomiary w zakresie ~0,1–100 nm. Dopasowanie obserwowanej intensywności rozpraszania do kąta (konwencjonalnie wyrażonego jako przeniesienie pędu q) dostarcza informacji o morfologii PCM (tj. rozmiarze i kształcie), a także o strukturze wewnętrznej. Jeśli dostępna jest kalibracja intensywności bezwzględnej, a intensywność rozpraszania można ekstrapolować do kąta zerowego, można również oszacować masę PCM i liczbę agregacji32, co czyni SAXS niezwykle wszechstronną i wartościową metodą. Rozpraszanie neutronów pod małym kątem (SANS) jest czułe w podobnym zakresie skal długości, ale jest dostępne tylko w specjalistycznych obiektach i nie zostanie wyraźnie omówione w tym artykule33,34,35.
Ostatnie lata przyniosły pojawienie się stacjonarnych instrumentów SAXS, ale stwierdzamy, że źródła synchrotronowe lepiej nadają się do charakteryzacji PCM, ponieważ ich wyższa intensywność pozwala na znacznie szybsze zbieranie danych dla tych próbek o niskim kontraście. Udostępniamy krótki protokół pozyskiwania danych PCM SAXS na linii badawczej 12-ID-B w Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) z perspektywy użytkownika. Protokół ten powinien mieć zastosowanie do większości źródeł synchrotronowych, ale konsultacja z lokalnym personelem przed zaproponowaniem eksperymentu jest wysoce zalecana. Udostępniamy również protokół redukcji i analizy danych za pomocą Irena36, darmowego zestawu makr napisanych dla Igor Pro. Irena zawiera wszechstronny zestaw formatów do modelowania danych SAXS i pozwala na budowę modeli wieloskładnikowych, które są w stanie opisać złożony profil rozpraszania PCM (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4). Irena posiada również obszerną dokumentację i samouczki dostępne online. Przed przystąpieniem do poniższych procedur zalecamy zapoznanie się z nimi, w szczególności z samouczkiem "Modelowanie danych SAXS z dwiema głównymi populacjami rozpraszaczy".
Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są problemem dla rozpraszania promieniowania rentgenowskiego, ale można zastosować kilka środków, aby je zminimalizować. W szczególności zalecamy stosowanie konfiguracji komory przepływowej z pompą strzykawkową i próbką PCM przepływającą podczas pozyskiwania danych, a nie szczelną kapilarą. To również znacznie upraszcza odejmowanie tła. Sugerujemy również wielokrotne naświetlanie przepływającej próbki zamiast jednej dłuższej, aby ograniczyć strumień, który widzi każda pojedyncza objętość próbki i umożliwić porównanie danych dotyczących ekspozycji w celu zidentyfikowania wszelkich uszkodzeń.
W przeciwieństwie do technik rozpraszania, które zazwyczaj wymagają dopasowania do interpretacji, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) zapewnia rzeczywisty obraz wizualny nanocząstek w przestrzeni poprzez przepuszczenie wiązki elektronów przez próbkę i projekcję obrazu na ekranie scyntylacyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). W tym artykule przedstawiamy protokoły dla dwóch technik TEM. Cryo TEM zamraża próbki miceli w cienkiej warstwie szklistego lodu, zachowując konformację strukturalną przy minimalnej ilości obcych substancji, optymalna dla miceli o promieniu ≤ ~ 100 nm. Barwienie ujemne TEM wykorzystuje sól metali ciężkich (np. uranu) do otoczenia próbki po jej wysuszeniu na powierzchni siatki. Gęste barwienie rozproszy więcej elektronów niż próbka, dodając kontrast i tworząc negatywny obraz próbki. Cryo TEM jest zalecany do obrazów o wysokiej jakości. Jest to jednak bardziej kosztowne, czasochłonne i może nie zapewniać wystarczającego kontrastu. Gdy jest to problem, należy użyć próbek barwionych ujemnie. Przykłady każdego z nich są pokazane w Rysunek 5.
Każda z tych technik opisuje nieco inne aspekty nanocząstek, z różnymi mocnymi i ograniczonymi stronami. Rozpraszanie światła jest łatwo dostępne i często jest najszybszym podejściem, ale ma znaczne ograniczenia w zakresie rozdzielczości rozmiaru i kształtu. SAXS może dostarczać informacje w szerokim zakresie długości przy rozsądnie wysokiej przepustowości, ale wymaga specjalistycznego sprzętu do pozyskiwania danych, a także modelowania do ich interpretacji. Obrazy TEM są łatwe do interpretacji, ale mogą mieć ograniczony kontrast i z natury mają niską przepustowość. Nasze doświadczenie pokazuje, że stosowanie wielu technik charakterystyki znacznie zwiększa ilość informacji, które można uzyskać o właściwościach PCM i upraszcza interpretację zestawów danych uzyskanych z każdego z nich z osobna. Na przykład w ramach SAXS i TEM badane jest przede wszystkim gęste jądro PCM, podczas gdy rozpraszanie światła informuje o ogólnych wymiarach nanocząstki. W ten sposób połączenie ich pozwala na pomiar zarówno wielkości rdzenia, jak i korony. Zdolność TEM do pozyskiwania obrazów rzeczywistej przestrzeni kosmicznej może dostarczyć podstawowych danych o prawdziwości, aby umożliwić wybór odpowiednich formatów do modelowania danych SAXS, które w przeciwnym razie mogłyby być niejednoznaczne. W tym artykule opisano protokoły dla wszystkich czterech technik, a przykładowy proces ich użycia do scharakteryzowania nieznanej próbki znajduje się w sekcji Dyskusja.

<table><tbody><tr><td>Bibuła filtracyjna o średnicy 70 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td>Bibuła filtracyjna do odprowadzania wilgoci podczas przygotowywania siatki</td></tr><tr><td>Siatka TEM z folii węglowej</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki Siatka</td><td>TEM</td><td>CF200-Cu</td></tr><tr><td>Technologia DAWN</td><td>Wyatt Instrument</td><td>DAWN</td><td>MALS</td></tr><tr><td>Oligonukleotyd DNA</td><td>Zintegrowane DNA Nanotechnologies Inc</td><td></td><td>Niestandardowy oligonukleotyd</td></tr><tr><td>Lacey Carbon Siatka TEM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>LC200-Cu</td><td>Siatka TEM</td></tr><tr><td>Metoksy-poli(glikol etylenowy)-blok-poli(chlorowodorek l-lizyny) PEG5k - PLKC50</td><td>Alamanda Polymers Inc</td><td>mPEG5K-b-PLKC50</td><td>Przykładowy kopolimer</td></tr><tr><td>blokowy Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>Ultraczysta woda</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Do pomiaru stężenia kwasów</td></tr> <tr>nukleinowych<td>Pęseta o działaniu ujemnym</td><td>Pęseta Dumont</td><td>N7</td><td>do przygotowania siatki</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996</td><td>Folia laboratoryjna</td></tr><tr><td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki Q210CR1.3</td><td></td><td>Siatka TEM</td></tr><tr><td>Goniometr badawczy i laserowy system rozpraszania światła</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>Instrument BI-200SM</td><td>DLS/MALS</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0,5 ml</td><td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td><td>87723</td> Kuweta do <td>dializy</td></tr><tr><td>o małej objętości Kuweta</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-SVC</td><td>do DLS/MALS</td></tr><tr><td>Solarus 950 Zaawansowany system plazmowy</td><td>Gatan</td><td>Solarus 950</td><td>System plazmowy do siatek TEM</td></tr><tr><td>Talos TEM</td><td>FEI</td><td>Talos</td><td>TEM używany do próbek kriogenicznych</td></tr><tr><td>Tecnai Spirit TEM</td><td>FEI</td><td>Spirit</td><td>TEM stosowany do suchych próbek</td></tr><tr><td>Mrówczan uranylu</td><td>SPI-Chem</td><td>16984-59-1</td><td>Do ujemnych próbek barwiących dla TEM</td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>FEI</td><td>Robot do witryfikacji Vitrobot do przygotowania kriokraty</td><td></td></tr></tbody></table>

montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Micele kompleksu polielektrolitowego (PCM), nanocząstki typu rdzeń-powłoka powstałe w wyniku samoorganizacji naładowanych polimerów w roztworze wodnym, stanowią potężną platformę do badania fizyki oddziaływań polielektrolitu, a także oferują obiecujące rozwiązanie palącego problemu dostarczania terapeutycznych oligonukleotydów in vivo. Opracowanie predykcyjnych zależności struktura-właściwości dla PCM okazało się trudne, częściowo ze względu na obecność silnych pułapek kinetycznych podczas samoorganizacji nanocząstek. W artykule omówiono kryteria wyboru polimerów do budowy PCM oraz przedstawiono protokoły oparte na wyżarzaniu solnym, które umożliwiają montaż powtarzalnych nanocząstek o niskiej polidyspersyjności. Omawiamy również charakterystykę PCM za pomocą rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami i mikroskopii elektronowej.

Aby zilustrować opisane powyżej metody charakteryzacji, przedstawiamy typowe wyniki dla PCM złożonych z oligonukleotydów i kopolimerów blokowych o różnych długościach i składzie chemicznym (Rysunek 1). Rysunek 2 prezentuje przykład tego, jak rozmiar rdzenia PCM (wyznaczony na podstawie SAXS i TEM, Rysunek 4 oraz Rysunek 5) zmieniał się w zależności od długości bloku naładowanego. Ry...

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Metoda ta opisuje pełną ścieżkę projektowania, montażu i charakterystyki miceli kompleksu polielektrolitu, które są nanocząstkami powstającymi w wyniku samoorganizacji przeciwnie naładowanych polimerów. Niektóre główne wyzwania związane z samoorganizacją polielektrolitu to unikanie pułapek kinetycznych i charakteryzacja nanocząstek. Opisana przez nas technika wyżarzania solnego pozwala na powtarzalne składanie miceli o niskiej dyspersji zarówno pod względem wielkości, jak i kształtu oraz opisujemy metody charakteryzacji, w tym rozpraszanie światła, rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem i mikroskopię elektronową.Dostarczanie terapeutycznych kwasów nukleinowych jest długotrwałym wyzwaniem dla nanomedycyny. Te micele kompleksu polielektrolitowego wykorzystują silny ładunek ujemny kwasu nukleinowego do sekwestracji ich w rdzeniu miceli, gdzie neutralna korona polimerowa chroni je przed nukleazami i odpowiedzią immunologiczną. Metoda montażu powinna mieć zastosowanie do każdego rodzaju naładowanych polimerów.Przetestowaliśmy je z kilkoma polianionami i polikationami, a metoda charakterystyki powinna mieć zastosowanie do wszelkich samoorganizujących się nanocząstek, w tym nanocząstek środków powierzchniowo czynnych i innych systemów napędzanych hydrofobicznie. Rozpocznij od inkubacji roztworu oligonukleotydu w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji schłodzić go przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu termicznego wyżarzania kwasów nukleinowych, a następnie dodać 40 mikrolitrów kopolimeru diblokowego o 20 milimolowym stężeniu naładowanym.Natychmiast wymieszać roztwór i inkubować go przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić wyżarzanie solne, dodaj roztwór chlorku sodu do roztworu oligonukleotydów o końcowym stężeniu jednego molowca i wiruj go przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie włożyć ją do wkładu dializacyjnego.Przed załadowaniem oznacz wkłady markerem permanentnym i zanurz je w buforze na co najmniej dwie minuty, aby nawodnić membrany. Zdejmij nakrętkę, przekręcając ją w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i załaduj próbkę za pomocą końcówki do pipety z żelem. Delikatnie ściśnij membranę, aby usunąć nadmiar powietrza i załóż nakrętkę.Umieść wkłady w 1X PBS 0,5 molowej kąpieli dializacyjnej chlorku sodu, upewniając się, że unoszą się na wodzie, a obie membrany są wystawione na działanie kąpieli. Po 24 godzinach przenieś wkłady do 1X PBS i moczyć je przez dodatkowe 24 godziny. Po końcowej dializie odzyskać próbkę, wyjmując wkłady z kąpieli, zdejmując nakrętkę i usuwając próbkę za pomocą końcówki do pipety z żelem.Umieść próbkę w czystej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówek i wstaw do lodówki, aż będzie gotowa do użycia. Przygotuj próbkę w instrumencie DLS zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie zbieraj dane przez co najmniej jedną minutę, upewniając się, że szybkość zliczania jest stała przez cały czas pozyskiwania. Sprawdź dane autokorelacji.Długotrwała linia bazowa powinna być płaska, a krzywa autokorelacji powinna być gładka z minimalnym rozrzutem. Szum w danych można poprawić, pozyskując więcej danych. Aby przeprowadzić redukcję i analizę danych za pomocą Irena, zacznij od zaimportowania miceli w zestawach danych w tle.Wykreślić próbkę i tło razem na skali logarytmicznej i obliczyć stosunek próbki do tła i sprawdzić asymptotę wysokiego Q. Oblicz średni współczynnik w tym zakresie Q i użyj makra manipulowania danymi, aby przeskalować tło za pomocą obliczonego współczynnika. Następnie wykreśl sygnał odjęty w tle przez Q i zapisz dane pod nową nazwą, upewniając się, że nie nadpisujesz oryginalnych danych.Otwórz makro modelowania, a następnie załaduj i wykreśl odjęte dane w tle. Aby znaleźć przybliżony model zewnętrznej powierzchni kompleksu polielektrolitu miceli lub PCM, wybierz przepływ do umiarkowanego zakresu Q w kontrolkach danych, upewniając się, że uwzględniono oscylacje, jeśli są obecne. W kontrolkach modelu wybierz pierwszą populację rozproszenia i upewnij się, że jest ona jedyną używaną.Wybierz rozkład rozmiaru dla modelu, wybierz żądany typ rozkładu i wybierz współczynnik kształtu. Ten przykład dotyczy elastycznego cylindra, który należy dodać ręcznie w ramach współczynnika kształtu użytkownika. Pobierz i dodaj elastyczny współczynnik kształtu cylindra, a następnie wprowadź nazwy funkcji i wartości początkowe dla parametrów jeden i dwa, które odpowiadają odpowiednio długości cylindra i długości Kuhna.Cylindry te są dłuższe niż te, które mogą być rozwiązane przez SAXS, więc parametr długości cylindra jest ustalony na dużą wartość. Ustaw początkowe parametry wyszukiwania, wprowadzając wartości w polach skali, średniej wielkości i szerokości. Następnie kliknij przycisk Oblicz model, aby narysować wynikowy współczynnik kształtu.Po znalezieniu rozsądnych parametrów kliknij przycisk Dopasuj model, aby wykonać nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do danych. Następnie należy zamodelować rozproszenie poszczególnych polimerów w rdzeniu PCM. Dostosuj elementy sterujące danymi, aby wybrać zakres Q, w którym występuje nadmierne rozpraszanie, który zwykle mieści się w zakresie od umiarkowanego do wysokiego.Dodaj drugą rozproszoną populację i upewnij się, że jest to jedyna używana populacja. Wybierz ujednolicony poziom modelu, dostosuj współczynniki GDA G i RG, aby upewnić się, że model nie przewiduje nadmiernego rozpraszania przy niskim Q i użyj makra dopasowania PB między kursorami, aby uzyskać wstępne przypuszczenie dla tych parametrów. Jeśli chodzi o współczynnik kształtu, należy wykonać nieliniowe dopasowanie dla modelu ujednoliconego poziomu.Jeśli pik dyfrakcyjny jest obecny, należy dodać trzeci model dla piku dyfrakcyjnego w zakresie Q będącym przedmiotem zainteresowania. Po uzyskaniu przybliżonych wartości dopasowania dla poszczególnych populacji rozpraszających, włącz wszystkie trzy razem i zoptymalizuj połączone dopasowanie. Na koniec sprawdź, czy każda wartość pozostaje fizycznie uzasadniona i zapisz dopasowanie, wybierając opcję Przechowuj w folderze.Wynikiem tej procedury powinien być złożony model, który dobrze opisuje dane dotyczące rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w szerokim zakresie skal rozmiarów. Protokół ten został wykorzystany do zaprojektowania, złożenia i scharakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitu kwasu nukleinowego lub PCM. Rozmiar rdzenia miceli zależy przede wszystkim od długości naładowanego bloku kopolimeru blokowego i jest w dużej mierze niezależny od długości homopolimeru.Uzyskano dane dotyczące dynamicznego rozpraszania światła dla sferycznych PCM utworzonych ze stosunkowo długich kopolimerów blokowych w krótkich jednoniciowych oligonukleotydach. Funkcja autokorelacji rozpadła się do płaskiej wartości z pojedynczą skalą czasową, co spowodowało pojedynczy pik wielkości w rozkładzie wielkości repIS. Złożone widma promieniowania rentgenowskiego małych aniołów lub widma intensywności SAXS można dokładnie dopasować, łącząc modele dla wielu korelacji przestrzennych, które są obecne, a wielokątowe rozpraszanie światła można wykorzystać do rozszerzenia pomiarów rozpraszania na dłuższe skale.PCM o różnej morfologii można również obrazować za pomocą mikroskopii elektronowej w celu sprawdzenia, czy promienie i kształt rdzenia są zgodne z wartościami uzyskanymi z dopasowania danych SAXS. Podczas dopasowywania danych SAXS ważne jest, aby uwzględnić każdą funkcję rozpraszania i używać metod uzupełniających, takich jak TEM, aby upewnić się, że używasz właściwego współczynnika kształtu.

assembly-and-characterization-of-polyelectrolyte-complex-micelles

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Ten artykuł opisuje proces wytwarzania polimerowych, samoorganizujących się nanocząstek za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego. Wykorzystanie niskoenergetycznego światła widzialnego do kontrolowania polimeryzacji pozwala na powtarzalne tworzenie samoorganizujących się miceli przypominających robaki przy wysokiej zawartości części stałych.

Łatwa synteza robakopodobnych miceli za pomocą polimeryzacji dyspersyjnej za pośrednictwem światła widzialnego przy użyciu katalizatora fotoredoks

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Tutaj prezentujemy protokół do przygotowania i wizualizacji struktur drugorzędnych (np. włókien, architektur toroidalnych i nanosfer) pochodzących z polikarmidów spiralnych. Wykazano, że morfologia charakteryzująca się zarówno mikroskopią sił atomowych (AFM), jak i skaningową mikroskopią elektronową (SEM) zależy od struktury molekularnej, stężenia i wybranego rozpuszczalnika.

Samoorganizujące się morfologie otrzymane z helikalnych kopolimerów polikarbodimidu i ich pochodnych triazolowych

Samoorganizacja sterowana krystalizacją (CDSA) wykazuje unikalną zdolność do wytwarzania cylindrycznych nanostruktur o wąskich rozkładach długości. Wykazano organokatalizowaną polimeryzację ε-kaprolaktonu z otwarciem pierścienia oraz późniejsze wydłużenia łańcuchów metakrylanu metylu i N,N-dimetyloakrylamidu. Przedstawiono żywy protokół CDSA, który wytwarza cylindry monodyspersyjne o długości do 500 nm.

Synteza monodyspersyjnych cylindrycznych nanocząstek poprzez samoorganizację biodegradowalnych kopolimerów blokowych sterowaną krystalizacją

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Opisujemy eksperymentalne szczegóły syntezy wzorcowych i rekonfigurowalnych cząstek z dwuwymiarowych (2D) prekursorów. Metodologia ta może być stosowana do tworzenia cząstek o różnych kształtach, w tym wielościanów i urządzeń chwytających, w skalach długości od mikro do centymetrów.

Inspirowany origami samomontaż wzorzystych i rekonfigurowalnych cząstek

Poznaj metodę montażu i charakteryzacji miceli kompleksu polielektrolitu przy użyciu techniki solnego wyżarzania. Protokół ten umożliwia uzyskanie nanocząstek o niskiej dyspersji rozmiaru i kształtu, co ma zastosowanie w dostarczaniu terapeutycznych kwasów nukleinowych.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Przeglądaj więcej filmów