Name: Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę oceny transdukcji peptydów penetrujących komórki w myszach CD1 przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo i eks vivo. Protokół ten pozwala maksymalizować dane z jednego zwierzęcia, redukując liczbę potrzebnych osobników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.Z. i K.S.F. są wspierani przez American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, oraz przez grant przyznany w ramach Pitt Innovation Challenge (PInCh®), przez Instytut Nauk Klinicznych i Translacyjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Pittsburghu zatwierdził wszystkie protokoły na zwierzętach określone w tej publikacji przed podjęciem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach.
UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak przeprowadzić badania biodystrybucji ex vivo za pomocą optycznego obrazowania fluorescencyjnego, a następnie badań biodystrybucji in vivo poprzez osadzenie organów w parafinie, sekcję i wykonanie mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż CTP jest używany jako przykład, metodę tę można zastosować do dowolnego znakowanego fluorescencyjnie CPP.
1. Obrazowanie in vivo
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj CTP przy użyciu technik syntezy fazy stałej9,10 z zakładu syntezy peptydów przy użyciu L-aminokwasów z N-końcem znakowanym Cy5.5 i C-końcem amidowym dla zwiększenia stabilności. 
	UWAGA: Wszystkie zsyntetyzowane CPP powinny być scharakteryzowane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i/lub desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI) przed użyciem11.</li>
	<li>Sporządzić 1 mM lub 10 mM roztwór podstawowy CTP w dimetylosulfotlenku (DMSO), podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C, w stanie chronionym przed światłem. 
	UWAGA: Peptydy są dostarczane w postaci liofilizowanego proszku. Liofilizowany proszek może być przechowywany przez długi czas (6 miesięcy-2 lata) w temperaturze -20 °C, chroniony przed światłem i w warunkach higroskopijnych. W przypadku poddawania w DMSO i przechowywania należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Zważ i znieczul 6-tygodniowe samice myszy CD1 za pomocą 2 μl/g masy tkanki roztworu ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny) podawanego domięśniowo (tylna noga) lub dootrzewnowo (lewy dolny kwadrant). 
	UWAGA: Roztwory ketaminy/ksylazyny powinny być świeże w dniu użycia. Niewykorzystane ketamina/ksylazyna powinny zostać odpowiednio zutylizowane, a ilości zużyte w stosunku do ilości wyrzuconych powinny być rejestrowane w dzienniku, ponieważ ketamina jest substancją kontrolowaną. Odpowiedni poziom znieczulenia zostanie osiągnięty w ciągu 5-7 minut, co ocenia się na podstawie braku reakcji na uszczypnięcie palca.</li>
	<li>Obliczyć dawkę 10 mg/kg Cy5.5-CTP, rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do nie więcej niż 200 μl i wstrzyknąć albo zaoczodoczoczo, albo przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki insulinowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Pozwól peptydowi krążyć przez określony czas, w zakresie od 15 min do 6 godzin.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji metodą inhalacyjną o wysokim stężeniu CO2 zgodnie z zaleceniami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt i otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby umieścić małe nacięcie w bocznej, wolnej ścianie prawego przedsionka i wstrzyknij 3 ml 10% buforowanego fosforanu formaliny za pomocą igły 26 G w podwójnym celu: perfuzji, mocowania narządów myszy i wypłukiwania czerwonych krwinek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Wypreparuj serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, jelito grube, jelito cienkie, pęcherz moczowy, jajniki/jądra i mózg i umieść je w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki do obrazowania optycznego ex vivo (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów i kliknij przycisk Inicjalizuj, aby przygotować system do obrazowania próbek. Otwórz kreatora obrazowania, wybierz fluorescencję, następnie parę filtrów, a następnie wybierz barwnik Cy5.5 z listy barwników, aby zastosować filtry wzbudzenia 580 nm i emisji 620 nm. Wybierz ręczne ustawienia parametrów ekspozycji, a następnie ustaw pozycję stage na B, ustaw czas ekspozycji na 1 sekundę, ustaw F/stop na 8 i ustaw binning na mały. 
	UWAGA: Filtry emisji wzbudzenia będą się różnić w zależności od użytej etykiety. Wzbudzenie i emisję używanej etykiety można wprowadzić ręcznie, aby oprogramowanie przypisało filtry wzbudzenia i emisji. Upewnij się, że liczby mieszczą się w przedziale 600-60 000, aby uniknąć nasycenia. W zależności od używanego systemu może być dostępna automatyczna optymalizacja pozyskiwania. Jeśli system ma kompensację do porównywania obrazów uzyskanych przy różnych ustawieniach, można użyć ustawień automatycznych. Jeśli żadna kompensacja nie jest dostępna, ustawienia będą musiały zostać określone, zapisane i używane spójnie we wszystkich próbkach.</li>
	<li>Gdy system zostanie całkowicie zainicjowany, ułóż interesujące nas narządy na 12-dołkowej płytce i umieść ją w komorze obrazowania optycznego, upewniając się, że próbki są ułożone zgodnie z oczekiwaniami dla obrazów. Wybierz opcję pobierz, a następnie wybierz lokalizację zapisu obrazów. Informacje o myszy można zapisać w wyskakującym oknie edycji etykiet obrazów.</li>
	<li>Po zobrazowaniu należy wyjąć próbki z komory i przechowywać w 10% buforowanym fosforanie formaliny w objętości co najmniej 20 razy większej niż objętość tkanki w fiolkach scyntylacyjnych z ochroną przed światłem w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Określ ilościowo obrazy, ustawiając jednostki na wydajność promieniowania, a następnie wybierając zwrot z inwestycji 4x3 i dostosowując tak, aby równomiernie dopasować każdą studzienkę do jednego kwadratu zwrotu z inwestycji, a następnie klikając pomiar. Otwórz kartę pomiarów ROI siatki, wybierz eksport i zapisz pomiary jako plik .cvs.</li>
</ol>
2. Histologia
UWAGA: Wykonaj kroki 1.1−1.8, aby uzyskać różne organy. Alternatywnie, te same narządy, które zostały zobrazowane, można natychmiast umieścić w formalinie i użyć do sekcji, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li>Przechowywać każdy narząd indywidualnie w 10% buforowanym fosforanie formaliny przez co najmniej 48 godzin przed przetworzeniem w celu badania histologicznego.</li>
	<li>Gdy po 48 godzinach narządy zostaną wystarczająco utrwalone, przenieś narządy do kaset do przetwarzania tkanek i osadzania i umieść w maszynie do przetwarzania tkanek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Ustaw maszynę przetwórczą tak, aby odwadniała tkankę w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie 80% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut, 100% etanolu przez 15 minut, 100% etanolu przez 20 minut, a na końcu 100% etanolu przez 20 minut.</li>
	<li>Oczyść tkankę z ksylenu 2x, pozostawiając 30 minut na każdy zabieg z ksylenem.</li>
	<li>Naciekać oczyszczoną tkankę woskiem parafinowym 4x w temperaturze 60 °C przez 30 minut przy każdym zabiegu.</li>
	<li>Zanurz w parafinie za pomocą metalowych form. Napełnij formę stopioną parafiną (utrzymywaną w temperaturze 65 °C) i przenieś na zimną płytę. Gdy parafina na dnie formy zacznie krzepnąć, umieść narząd w parafinie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy jako podkład i przepełnij stopioną parafiną. Pozostawić do ostygnięcia, aż stwardnieje. Następnie przechowuj blok w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez noc, pozwalając woskowi na dalsze kurczenie się w celu łatwego wyjęcia z form. 
	UWAGA: Bloki mogą być teraz przechowywane w RT z ochroną przed światłem.</li>
	<li>Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 38 °C z wodą destylowaną. Ustaw mikrotom o kącie nachylenia ostrza 6° i grubości przekroju 10 μm.</li>
	<li>Zamontuj bloki tkanek w mikrotomie i rozpocznij cięcie, aż do uzyskania skrawków zawierających tkankę. Następnie umieść klocki twarzą do dołu w wodzie na 5 minut lub do momentu, gdy tkanka wchłonie trochę wilgoci (np. gdy w bloku pojawi się cienki biały kontur tkanki [<silna klasa="xfig">Rysunek 1G]). 
	UWAGA: Ostrze należy często wymieniać, aby zapewnić jakość sekcji.</li>
	<li>Umieść tkankę na płaskim bloku lodu na 10 minut, a następnie umieść ją z powrotem w mikrotomie w tej samej orientacji, co w kroku 2.9. Zacznij robić sekcje i pozwól, aby obcięte sekcje utworzyły długie wstęgi po 6−10 sekcji każda. Wyrzuć nieoptymalne taśmy parafinowe, aż zostanie wyprodukowana wysokiej jakości taśma o długości wystarczającej do zakrycia szkiełka. Zoptymalizuj cięcie, dostosowując prędkości cięcia, nawilżenie tkanek i temperaturę kąpieli wodnej, aby uniknąć ścinania lub marszczenia skrawków tkanki. 
	UWAGA: Odcinki, które mają, z których wypadła tkanka, rozdarcia w tkance lub napięte zmarszczki i fałdy w tkance należy wyrzucić.</li>
	<li>Ostrożnie wybierz wysokiej jakości wstążkę za pomocą kleszczyków o krawędziach i unosić się na powierzchni łaźni wodnej o temperaturze 38 °C. Pozostaw skrawki na powierzchni, aż się wygładzą, uważając, aby nie pozostawić ich zbyt długo, aby zapobiec rozpadowi parafiny i rozdarciu sekcji.</li>
	<li>Umieść spłaszczone sekcje na powierzchni czystych szkiełek podstawowych. Umieść szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 °C na 30 minut, aby wosk się rozpuścił. 
	UWAGA: Szkiełka te mogą być przechowywane w RT z ochroną przed światłem.</li>
	<li>Odparafinować szkiełka w ksylenie 3x, 10 min na każdy zabieg.</li>
	<li>Ponownie uwodnić tkankę w 100% etanolu przez 5 minut, następnie 95% etanolu przez 5 minut, 70% etanolu przez 5 minut, 50% etanolu przez 5 minut, a na koniec 1x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) przez 5 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc. 
	UWAGA: Szkiełka te mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze pokojowej, o ile są chronione przed światłem.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą 125 μl podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI), jądrowej sondy fluorescencyjnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1I). Suche szkiełka przez noc w RT, chronione przed światłem. 
	UWAGA: Wysuszone szkiełka można przechowywać przez długi czas w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	<li>Preparaty obrazowe przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. 
	UWAGA: Należy unikać nasyconych obrazów, ponieważ nie są one przydatne ilościowo. Regulację ustawień ekspozycji i wzmocnienia można obniżyć, aby uniknąć nasycenia. Należy pamiętać, aby używać tych samych ustawień we wszystkich porównywanych próbkach. Unikaj wybielania tkanki, ograniczając czas ekspozycji.</li>
</ol>

<ol><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+functional+domains+of+chemically+synthesized+human+immunodeficiency+virus+tat+trans-activator+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.</a> Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+penetrating+peptides%3A+therapeutic+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges.</a> Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tissue-specific+protein+transduction+domains+using+peptide+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display.</a> Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cardiac+specific+protein+transduction+domain+by+in+vivo+biopanning+using+a+M13+phage+peptide+display+library+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice.</a> PLoS One. 5 (8), e12252(2010).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Targeting+Peptide%2C+a+Novel+Cardiac+Vector%3A+Studies+in+Bio-Distribution%2C+Imaging+Application%2C+and+Mechanism+of+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction.</a> Biomolecules. 8 (4), E147(2018).</li>
<li>Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+of+modern+solid+phase+Peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis.</a> Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).</li>
<li>Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+peptides+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of peptides on solid phase.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).</li>
<li>Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Synthetic+Peptides+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).</li>
<li>Arms, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+Limitations+of+Current+Techniques+for+Analyzing+the+Biodistribution+of+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 802(2018).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+your+label+wisely%3A+water-soluble+fluorophores+often+interact+with+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
<li>McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Ex+Vivo+Whole-organ+Imaging+and+Quantitative+Tissue+Histology+to+Determine+the+Bio-distribution+of+Fluorescently+Labeled+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

M.Z. i Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) posiadają patent na zastosowanie peptydu ukierunkowanego na serce jako wektora sercowego (domena celowania w białko specyficzne dla serca, U.S. Patent Serial No. 9,249,184). M.Z. pełni również funkcję dyrektora naukowego i zasiada w zarządzie startupu Vivasc Therapeutics Inc. i posiada w nim znaczne udziały w przyszłości.

Modele zwierzęce są niezbędne do przedklinicznego opracowywania leków na każdym etapie procesu, począwszy od identyfikacji nowych CPP, poprzez badania biodystrybucji, mechanizm transdukcji, aż po ostateczne testy skuteczności dostarczonego ładunku przy użyciu tych nowych CPP jako wektorów. Istnieje wiele powszechnie stosowanych metod oceny biodystrybucji, takich jak histologia, obrazowanie medycyny nuklearnej (SPECT i PET) oraz obrazowanie optyczne in vivo12. Metody obrazowania jądrowego mogą być kłopotliwe ze względu na ograniczoną dostępność systemów SPECT i PET dla małych zwierząt, a także możliwość wytwarzania koniugatów znakowanych radioaktywnie i leków, co wymaga specjalistycznej wiedzy radiochemika. Natomiast etykiety fluorescencyjne są znacznie prostsze i mogą być opłacalne w obsłudze. Opisany w artykule protokół pozwala na szybką analizę biodystrybucji przy użyciu wielu metod. Fluorescencyjne obrazowanie optyczne całego narządu ex vivo pozwala na natychmiastowe porównanie fluorescencji w różnych tkankach i grupach badanych oraz może określić wychwyt narządowy i czas do szczytowego wychwytu w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania w sposób półilościowy. Ilościowa histologia tkanek wymaga bardziej rozległego przetwarzania w celu leczenia, cięcia, obrazowania i analizowania tkanek, ale dostarcza więcej danych na poziomie mikroskopowym i jest obecnie standardową techniką. Warto zauważyć, że bezpośrednie, ilościowe porównanie obu technik nie jest możliwe, ponieważ autofluorescencja obserwowana przy każdej technice dla różnych narządów i długości fal wzbudzenia różni się znacznie.
Ważną częścią tego protokołu jest wybór odpowiedniego fluoroforu do oznaczania potencjalnych CPP do eksperymentów. Jednym z potencjalnych problemów jest nakładanie się widm, co może być problematyczne, gdy potrzebnych jest wiele fluoroforów. Fluorescencyjne media montażowe DAPI i Cy5.5 nie mają nakładających się widm. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, w których potrzebnych jest wiele fluoroforów, należy dokładnie rozważyć ryzyko nakładania się spektralnego. W zależności od stosowanego systemu, wybór fluoroforów może być ograniczony. Dlatego kluczowa jest wiedza na temat możliwości systemu. Fluorescencyjne systemy optyczne najlepiej sprawdzają się w przypadku fluoroforów dalekiej czerwieni lub bliskiej podczerwieni ze względu na wysoką absorpcję tkankową krótszych fal13. Fluorofory z zakresu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji mają poważne ograniczenie, ponieważ na długości fali wzbudzenia obserwuje się znaczną autofluorescencję narządów, szczególnie w tkance mózgu i wątroby. W zależności od warunków eksperymentu, niektórych fluoroforów najlepiej unikać. Niektóre rozpuszczalne w wodzie fluorofory organiczne mają silną interakcję z dwuwarstwami lipidowymi, co może powodować wyniki fałszywie dodatnie. W związku z tym wskazane jest podjęcie kroków w celu ustalenia, czy fluorofor ma silne powinowactwo do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania14. Kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest wybór odpowiedniej metody koniugacji fluoroforu, który może być ważnym parametrem wpływającym na wyniki. CPP mogą być znakowane fluorescencyjnie na końcu N lub C poprzez wiązanie kowalencyjne między N-końcem peptydu a grupą karboksylową barwnika, taką jak Cy5.5-NHS. Należy zachować ostrożność, ponieważ mechanizm transdukcji większości CPP nie jest szczegółowo poznany, a koniugacja na jednym końcu może wpływać na mechanizm wychwytu bardziej niż na drugim końcu. Inną możliwością znakowania CPP jest biotynylacja N-końca w celu sprzężenia z fluorescencyjnie znakowaną streptawidyną. Stosowanie tej strategii ma tę wygodę, że pozwala na wykorzystanie różnych fluorescencyjnych koniugatów streptawidyny. Jednak możliwym ograniczeniem tej strategii jest to, że kompleks biotyna-streptawidyna jest dużym konstruktem, który może potencjalnie zakłócać transdukcję.
Fluorescencyjne systemy obrazowania optycznego są skuteczną strategią skutecznego porównywania fluorescencji w różnych narządach i zabiegach, ale nie są w stanie uzyskać ilościowego pomiaru bezwzględnych stężeń w tkance. Wynika to z efektów rozpraszania światła w tkance, które są dodatkowo potęgowane przez naturalnie występującą różnorodność rozmiarów i gęstości tkanek oraz różnice w unaczynieniu, ze zmiennym rozpraszaniem fluorescencji. Autofluorescencja tkanek może być również czynnikiem, ze względu na naturalnie występujące źródła biochemiczne, takie jak kolagen, lub źródła dietetyczne, takie jak chlorofil w żywności13.
Histologia jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru biodystrybucji i może być potencjalnie wykorzystana do dokładnego pomiaru i porównania wychwytu w różnych tkankach w czasie. Dzięki tej metodzie unika się problemów z rozpraszaniem światła, ponieważ wszystkie tkanki są cięte na tę samą grubość15. Główną zaletą tej metody jest możliwość dołączenia dodatkowych znaczników fluorescencyjnych po sekcji immunologicznej. Chociaż dodanie innego fluoroforu może sprawić, że obrazowanie będzie trudniejsze, zastosowanie znaczników fluorescencyjnych może być przydatne do lokalizacji CPP w określonych przedziałach wewnątrzkomórkowych, takich jak lizosomy lub mitochondria. Przeciwciało można zastosować w eksperymencie mikroskopii konfokalnej w celu określenia, czy transdukowany kandydat na CPP kolokalizuje się ze strukturą będącą przedmiotem zainteresowania, co może pokazać potencjał CPP jako czynnika dostarczającego. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że przygotowanie preparatów z próbek narządów może być czasochłonne, pracochłonne i podatne na błędy ludzkie12,15. Podczas obrazowania preparatów należy uważać, aby nie obrazować tego samego miejsca zbyt długo, aby uniknąć fotowybielania. Niektóre fotowybielanie będzie nieuniknione, w zależności od wrażliwości fluoroforu. Na każdym etapie niniejszego protokołu należy dołożyć starań, aby chronić próbki przed światłem otoczenia i odpowiednio je przechowywać16. Zalecamy przechowywanie preparatów w temperaturze 4 °C, w stanie chronionym przed światłem, do przyszłego obrazowania.
Dostępnych jest wiele metod pomiaru biodystrybucji kandydującego CPP, które wymagają specjalistycznego sprzętu i mogą dać porównywalne wyniki, chociaż mogą wymagać bardziej złożonego znakowania CPP. Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje dwie kompatybilne metody do wydajnego generowania danych o biodystrybucji w kontekście żywego systemu, umożliwiając jednocześnie uzyskanie bardziej szczegółowych informacji na temat internalizacji peptydów w komórkach z tej samej próbki, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badania o połowę. Metody te zostały wykorzystane do wygenerowania powyższych danych, które pokazują, że obie metody mogą być stosowane sekwencyjnie u tego samego zwierzęcia oraz jakość danych generowanych przez każdą z nich. Nasze wyniki podkreślają również niemożność bezpośredniego skorelowania wyników między tymi dwiema technikami w sposób ilościowy.

Błona plazmatyczna komórki jest półprzepuszczalną barierą, która jest niezbędna dla integralności i przetrwania komórki oraz służy do regulowania wnętrza komórki poprzez kontrolowanie ruchu substancji do komórki. Chociaż ma to zasadnicze znaczenie dla przetrwania, stanowi również barierę w dostarczaniu ładunku do komórki. W 1988 roku wykazano, że białko trans-aktywatora transkrypcji (Tat) ludzkiego wirusa niedoboru odporności wnika do hodowanych komórek i promuje ekspresję genów wirusa1,2, przy czym domeny odpowiedzialne za tę transdukcję są ograniczone do bogatego w argininę i lizynę regionu 13-aminokwasowego trzeciej helisy3 Nazwano je peptydami penetrującymi komórki (CPP). Następnie przeprowadzono badania wykazujące zdolność peptydu Tat do przenoszenia funkcjonalnej β-galaktozydazy do wielu typów komórek4. Od czasu wstępnego opisu liczba peptydów penetrujących komórki dramatycznie wzrosła. Te domeny transdukcyjne są naturalnie występującymi lub syntetycznymi krótkimi peptydami, zwykle o długości 6-20 aminokwasów, które są w stanie przenosić funkcjonalne ładunki przez błony komórkowe. Ładunki te mogą obejmować inne małe peptydy, białka o pełnej długości, kwasy nukleinowe, nanocząstki, cząstki wirusowe, cząsteczki fluorescencyjne i radioizotopy5. Początkowe opisane CPP nie były specyficzne dla komórek, przy czym Tat był wychwytywany przez wiele typów komórek, a nawet przekraczał barierę krew-mózg4, co ograniczało jego potencjał terapeutyczny. W celu zidentyfikowania CPP specyficznych dla komórek, badacze przeprowadzili wyświetlanie fagów przy użyciu dużych, dostępnych na rynku bibliotek fagów6. Nasza własna praca z wykorzystaniem kombinatorycznej metodologii wyświetlania fagów in vitro i in vivo doprowadziła do zidentyfikowania CPP o nazwie peptyd ukierunkowany na serce (CTP)7, 12-aminokwasowy, niewystępujący naturalnie peptyd (NH 2-APWHLSSQYSRT-COOH), który celuje w serce ze szczytowym wychwytem po 15 minutach po obwodowym wstrzyknięciu dożylnym8. Stosując immunofluorescencyjną kolokalizację z aktyną, markerem wewnątrzkomórkowym, i wykluczenie lamininy, markera błony komórkowej, wykazaliśmy, że CTP jest internalizowane do kardiomiocytów myszy po wstrzyknięciu dożylnym7. Dodatkowo inkubowaliśmy indukowane przez człowieka pluripotencjalne bicie kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych z podwójnie znakowanym CTP, znakowanym 6-karboksyfluoresceiną na końcu C i rodaminą na końcu N poprzez wiązanie estrowe, które można było odciąć tylko przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Szybką akumulację rodaminy do bijących kardiomiocytów zaobserwowano w ciągu 15 minut na mikroskopii konfokalnej8.
W tym artykule przedstawiamy dwie uzupełniające się metodologie, które mogą być użyte do śledzenia biodystrybucji i potwierdzania specyficznej tkankowo internalizacji CPP na przykładzie CTP. W przypadku tych metodologii zsyntetyzowano CTP, znakowano fluorescencyjnie na końcu N cyjaniną5,5 (CY5,5) i czadowano amidem na końcu C w celu uzyskania większej stabilności peptydów. Dwie stosowane metodologie to fluorescencyjne systemy obrazowania optycznego in vivo i mikroskopia fluorescencyjna skrawków tkanek. Obie metody są bardzo przydatne w badaniu biodystrybucji, wychwytu i eliminacji znakowanych fluorescencyjnie CPP. Przewagą oceny biodystrybucji przy użyciu tych metod w porównaniu z innymi, takimi jak tomografia emisyjna pojedynczych fotonów (SPECT) lub pozytonowa tomografia emisyjna (PET), jest to, że nie ma potrzeby czasochłonnego znakowania radioaktywnego CPP w porównaniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, które jest stosunkowo łatwe i rutynowo stosowane we wszystkich zakładach syntezy peptydów. Zastosowanie obrazowania in vivo szybko generuje dane dotyczące biodystrybucji w kontekście żywego systemu, podczas gdy sekcjonowanie dostarcza bardziej szczegółowych informacji na temat wychwytu i lokalizacji peptydów w komórkach poprzez zachowanie szczegółów morfologicznych. Protokół ten można zastosować do wielu różnych narządów i tkanek, takich jak serce, płuca, wątroba, nerki, mózg, śledziona, żołądek, jelito grube, jelito cienkie, mięśnie szkieletowe, kości, jądra/jajniki i oczy.
<!--Nie usuwaj—>

<table><tbody><tr><td>10% buforowany fosforan formaliny</td><td>ThermoFisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2471-1</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS Roztwór</td><td></td><td></td><td>10x TBS rozcieńcza się w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>20 ml fiolki scyntylacyjne</td><td>Wheaton</td><td>334173</td><td></td></tr><tr><td>26G Igły</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>28G 0,5ml Strzykawki insulinowe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>CD1 Myszy</td><td>Charles River</td><td>022</td><td>6 do 12 tygodniowe albinosy, samice myszy</td></tr><tr><td>Szkło</td> <td>nakrywkoweThermoFisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-CTP-amid</td><td></td><td></td><td>Przygotowany w drodze syntezy peptydów, sprzężony z fluoroforem Cy5.5 i oczyszczony za pomocą HPLC. Liofilizowany proszek jest odtwarzany w DMSO w stężeniu 10mM. Po rozpuszczeniu przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>99150-20</td><td></td></tr> Bardzo <tr><td>cienkie nożyczki do</td> etanolu <td></td><td></td> Bonn Narzędzia do nauki o etynostynie 14084-08 <td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl 100 mg / ml</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr> Roztwór <tr><td></td> ketaminy/ksylazyny <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ketamina HCl jest mieszana z ksylazyną 1:1 w celu uzyskania roztworu podstawowego zawierającego 50 mg / ml ketaminy i 10 mg / ml ksylazyny. To rozwiązanie jest świeże przed każdym użyciem.</td></tr><tr><td>Leica RM2235 Mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe</td><td>ThermoFisher</td><td>B9992000TN</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Sigma</td><td>P3808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Lumina S5 IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>Sparkle Środek do czyszczenia soczewek optycznych</td><td>ThermoFisher</td><td>NC0090079</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Processing/ Kasety do zatapiania</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9499605</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do przetwarzania Tissue-Tek VIP</td><td>Tissue-Tek</td><td>VIP 5A-F1</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 20 mg / ml</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>ThermoFisher</td><td>X5-4</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Od czasu początkowego opisu domen transdukcji białek, znanych również jako peptydy penetrujące komórki, ponad 25 lat temu, pojawiło się duże zainteresowanie rozwojem tych peptydów, zwłaszcza specyficznych dla komórek, jako nowych wektorów do dostarczania materiałów diagnostycznych i terapeutycznych. Nasze wcześniejsze prace związane z wyświetlaniem fagów zidentyfikowały nowy, niewystępujący naturalnie peptyd o długości 12 aminokwasów, który nazwaliśmy peptydem ukierunkowanym na serce (CTP) ze względu na jego zdolność do transdukcji normalnej tkanki serca in vivo ze szczytowym wychwytem obserwowanym w ciągu zaledwie 15 minut po wstrzyknięciu dożylnym. Podjęliśmy szczegółowe badania biodystrybucji, wstrzykując CTP znakowane fluoroforem cyjaniną 5,5, pozwalając mu krążyć przez różne okresy czasu, oraz eutanazję, utrwalanie i cięcie wielu narządów, a następnie obrazowanie mikroskopem fluorescencyjnym. W niniejszej publikacji szczegółowo opisujemy te procesy, a także obrazowanie ex vivo pobranych narządów za pomocą systemu obrazowania in vivo. Przedstawiamy szczegółowe metodologie i praktyki w zakresie przeprowadzania badań nad transdukcją, a także biodystrybucją na przykładzie CTP.

Stosując niniejszy protokół, trzem myszom podano dawkę 10 mg/kg Cy5.5-CTP poprzez wstrzyknięcie zaocznojamowe (Rycina 1A). Po 15 min cyrkulacji peptydu myszy zostały uśmiercone w komorze z CO2, otwarto klatkę piersiową poprzez nacięcie w linii pośrodkowej mostka, nacięto prawy przedsionek serca, a następnie przeprowadzono utrwalanie perfuzyjne myszy przy użyciu 3 mL 10% fosforanowej formaliny buforowanej (Rycina 1B,C). Po utrwaleniu wypreparowano serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę oraz mózg i ułożono je na płytce 12-dołkowej do obrazowania fluorescencyjnego ex vivo (Rycina 1D oraz Rycina 2A). Trzy myszy kontrolne, którym nie podano wstrzyknięć, również poddano perfuzji, sekcji i obrazowaniu (Rycina 1B−D oraz Rycina 2B). Dane fluorescencji uzyskane dla każdego zestawu organów można porównać, ponieważ wartości zliczania zostały przekształcone na wydajność promieniowania (radiant efficiency), czyli względną jednostkę fluorescencji oprogramowania do obrazowania. Dane te można poddać kwantyfikacji, aby uzyskać zarówno obrazy jakościowe, jak i dane ilościowe dla każdego analizowanego organu (Rycina 2C) w różnych punktach czasowych na potrzeby badań biodystrybucji. Autofluorescencję różnych organów w odpowiedzi na różne długości fal wzbudzenia przedstawiono na Rycynie 3A−E. Krótsze długości fal wzbudzenia, takie jak w przypadku ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP), wiążą się z wyższą autofluorescencją, szczególnie w wątrobie i mózgu, niż długości fal wzbudzenia w zakresie dalekiej czerwieni (Cy5.5) lub bliskiej podczerwieni (Cy7) (Rycina 3). Obrazowane organy utrwalano w 10% fosforanowej formalinie buforowanej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 48 h, a następnie przeniesiono do kaset do procesowania i zatapiania tkanek (Rycina 1E). Organy przetworzono i zapiarafinowano w procesorze tkanek, umieszczono w formach wypełnionych parafina, zamrożono na platformie o temperaturze -20 °C i przechowywano przez noc w -20 °C (Rycina 1F). Próbki poddano sekcjonowaniu (Rycina 1G) i traktowano wymianą roztworów w celu rehydratacji tkanki (Rycina 1H). Przygotowane preparaty zamontowano następnie przy użyciu fluorescencyjnego medium montującego z DAPI (Rycina 1I). Po wyschnięciu, zazwyczaj przez noc, preparaty obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Reprezentatywne obrazy każdego organu z myszy przedstawiono na Rycynie 4A. Obrazy z różnych organów pozyskano przy użyciu identycznych ustawień, aby umożliwić porównanie między myszami oraz przeprowadzenie kwantyfikacji (Rycina 4B).
<img alt="Przebieg badania histologicznego: pobieranie tkanek, utrwalanie, zatapianie, krojenie i przygotowanie preparatów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Pobieranie organów myszy do optycznego obrazowania fluorescencyjnego ex vivo i krojenia. (A) Mysz typu dzikiego po podaniu CTP-Cy5.5 drogą retroskrabinową. (B) Mysz poddana sekcji z otwartą klatką piersiową i przeciętym prawym przedsionkiem w celu utrwalania perfuzyjnego. (C) Wstrzyknięcie do serca 3 mL 10% buforowanego formalinu fosforanowego w celu utrwalenia perfuzyjnego zwierzęcia. (D) Pobranie wybranych organów i rozmieszczenie ich na płytce 12-dołkowej do optycznego obrazowania fluorescencyjnego. (E) Serce umieszczone w kasecie i poddane obróbce w procesorze do tkanek. (F) Serce zatopione w parafinie. (G) Serce krojone na mikrotomie. (H) Deparafinizacja preparatów poprzez serię wymian roztworów. (I) Przykrycie skrawków szkiełkami przy użyciu DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne próbek organów; mapa ciepła wydajności promieniowania; dane z porównawczego wykresu słupkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy organów leczonych i kontrolnych. (A) Organy myszy leczonej dawką 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organy z nieleczonej myszy kontrolnej. (C) Ilościowe oznaczenie fluorescencji dla każdego zestawu organów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza biodystrybucji w narządach; wydajność promieniowania; obrazowanie fluorescencyjne; zaznaczone wątroba i mózg." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Narządy nieleczonej myszy obrazowane przy różnych długościach fal wzbudzenia i emisji w celu wykazania, że dłuższe długości fal generują mniejszą autofluorescencję. (A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620−670. (D) Cy3: 520−570. (E) EGFP: 480−520. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wykres słupkowy intensywności Cy5 w organach w czasie; CTP vs RAN." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Transdukcja serca, płuc, wątroby i nerek po wtryskiwaniu dożylnym u myszy. Myszy typu dzikiego otrzymały wtrysk 10 mg/kg Cy5.5-CTP lub peptydu randomowego (RAN-Cy5.5), a następnie zostały poddane eutanazji w określonych punktach czasowych. (A) Szczytowa transdukcja tkanki serca wystąpiła w 15 min, z następującym stałym spadkiem fluorescencji w czasie. Odnotowano pewien pobór kapilarny w płucach oraz silną transdukcję w wątrobie, a także w kapilarach kłębuszkowych nerek, co sugeruje nerkowy mechanizm wydalania. (B) Ilościowe oznaczenie intensywności fluorescencji wykazuje znacznie większy pobór CTP-Cy5.5 przez serce w porównaniu z RAN-Cy5.5. Pasek skali = 500 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Zahid i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Nasz protokół pozwala nam śledzić biodystrybucję i potwierdzić specyficzną tkankowo internalizację peptydu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu dwóch oddzielnych, ale uzupełniających się metodologii. Możemy użyć tego protokołu, aby zmaksymalizować dane uzyskane od pojedynczego zwierzęcia i uzyskać ilościowe dane z obrazowania fluorescencji osiowej. Dodatkowo możemy uzyskać jakościowe obrazy mikroskopowe.Po uzyskaniu zsyntetyzowanych w fazie stałej C-końcach amidowych kapu CTP z N-końcem znakowanym Cy5.5 z zakładu syntezy peptydów, należy wykonać jedno- lub 10-milimolową porcję roztworu podstawowego CTP w dimetylosulfotlenku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu ochrony przed światłem. W dniu eksperymentu należy załadować 10 miligramów na kilogram dawki Cy5,5 CTP w 200 mikrolitrach PBS do strzykawki insulinowej. Zważ mysz i dostarcz peptyd dożylnie znieczulonej sześciotygodniowej samicy myszy CD1.Pozwól peptydowi krążyć przez wcześniej określony okres eksperymentalny przed eutanazją myszy za pomocą komory CO2 o wysokim przepływie i użyciem nożyczek do otwarcia jamy klatki piersiowej i wykonaniem małego nacięcia w bocznej wolnej ścianie prawego przedsionka. Użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby przelać trzy mililitry 10% buforowanego fosforanu formaliny przez wierzchołek lewej komory, aby utrwalić tkanki i wypłukać wszelkie czerwone krwinki. Następnie zbierz serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, jelito grube i cienkie, pęcherz moczowy, jajniki lub jądra oraz mózg do indywidualnych dołków 12-dołkowej płytki do obrazowania optycznego ex vivo.W przypadku obrazowania in vivo obrazów transdukowanych CTP uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij przycisk Zainicjuj, aby przygotować system do obrazowania. Otwórz kreatora obrazowania i wybierz opcję Fluorescencja i para filtrów. Kliknij Nazwy, Barwniki, Cyjanek i Cy5, aby ustawić parametry wzbudzenia i emisji.Kliknij Ustawienia ręczne, aby ustawić ekspozycję na jedną sekundę, kategorię na małą, przysłonę i przysłonę na osiem, a pole widzenia na 15 centymetrów. Kliknij przycisk Pobierz i ustaw folder, w którym mają być zapisywane próbki. Dodaj odpowiednie informacje eksperymentalne w oknie edytowania etykiet obrazów i kliknij przycisk OK. Pojawi się uzyskany obraz.Ustaw urządzenia na wydajność promieniowania. Kliknij dwukrotnie obraz, a następnie kliknij opcję Korekcje i Adaptacyjne odejmowanie tła fluorescencyjnego. Dostosuj próg, aby na fioletowo pokryć tylko narządy będące przedmiotem zainteresowania.Możesz też kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać opcję Obszar kadrowania, aby narysować pole zawierające wszystkie interesujące Cię próbki. Po uzyskaniu wszystkich obrazów przenieść próbki do fiolek scyntylacyjnych zawierających 10% buforowanego fosforanu formaliny w objętości co najmniej 20 razy większej niż objętość tkanki i przechowywać tkanki w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem przez co najmniej 48 godzin. Aby określić ilościowo obrazy, ustaw jednostki na wydajność promieniowania, a obszar zainteresowania na cztery na trzy.Dostosuj pole obszaru zainteresowania, aby równomiernie pokryć wszystkie dołki, a następnie kliknij przycisk Zmierz obszary zainteresowania. Następnie kliknij opcję Pomiary obszaru zainteresowania siatki, aby dopasować komórki obszaru zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby zapisać dane w pliku tekstowym lub CSV. Gdy narządy są wystarczająco utrwalone po upływie co najmniej 48 godzin, należy przenieść próbki do kaset do przetwarzania tkanek i osadzania, a następnie załadować kasety do maszyny do przetwarzania tkanek.Ustaw procesor na odwodnienie tkanki etanolem zgodnie ze wskazaniami, a następnie oczyszczenie za pomocą dwóch 30-minutowych zabiegów ksylenem i wlewu parafinowego za pomocą czterech 30-minutowych zabiegów parafinowych. Po ostatnim zabiegu parafinowym należy usunąć tkanki z maszyny do obróbki. Umieść chusteczki w osobnych metalowych foremkach i wyłóż każdą formę stopioną parafiną.Umieść foremki na zimnym talerzu. Gdy parafina na dnie formy zacznie krzepnąć, umieść organy w parafinie. Po umieszczeniu wszystkich organów umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy jako podkład i przepełnij formy stopioną parafiną.Pozwól parafinie ostygnąć do zestalenia, zanim będziesz przechowywać bloki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka ustaw mikrotom o kącie nachylenia ostrza sześciu stopni i grubości przekroju 10 mikrometrów i zamontuj bloki tkanek w mikrotomie. Rozpocznij cięcie, aż uzyskasz skrawki zawierające tkankę i umieść bloki zadrukowaną stroną do dołu w kąpieli destylowanej w wodzie destylowanej o temperaturze 38 stopni Celsjusza na pięć minut lub do momentu, gdy tkanka wchłonie trochę wilgoci.Gdy w bloku pojawi się cienki biały kontur tkanki, umieść tkankę na płaskim bloku lodu na 10 minut, a następnie włóż ją z powrotem do mikrotomu w tej samej orientacji, w jakiej została właśnie załadowana. Zacznij uzyskiwać plasterki, dzięki którym obcięte sekcje mogą tworzyć długie wstęgi po sześć do 10 sekcji każda. Aby zapewnić pomyślne pobranie wycinka tkanki, utrzymuj blok nawodniony.Umieść blok z powrotem na lodzie, jeśli jakość sekcji jest słaba lub zaczyna się pogarszać. Wyrzuć nieoptymalne taśmy parafinowe, aż zostanie wyprodukowana wysokiej jakości taśma o długości wystarczającej do przykrycia szkiełka. Użyj krawędzi, aby przenieść wysokiej jakości wstążki do łaźni wodnej o temperaturze 38 stopni Celsjusza i pozwól sekcjom usiąść na powierzchni destylowanej wody, aż się wygładzą.Spłaszczone sekcje wynieś na powierzchnię czystego szkiełka i rozpuść wosk w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby odparafinować szkiełka, należy potraktować próbki trzykrotnie ksylenem przez 10 minut na każdy zabieg. Po ostatnim zabiegu z użyciem ksylenu należy ponownie nawodnić tkanki za pomocą pięciominutowego zanurzenia w etanolu zstępującego, jak wskazano, a następnie pięciominutowego zanurzenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem.Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez noc, zamontuj sekcje za pomocą szkiełek nakrywkowych i 125 mikrolitrów podłoża montażowego uzupełnionego DAPI i wysusz szkiełka przez noc, chroniąc je przed światłem przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po utrwaleniu serce, płuca, wątroba, nerki, śledziona i mózg zwierząt doświadczalnych i kontrolnych są umieszczane na 12-dołkowej płytce do optycznego obrazowania fluorescencyjnego ex vivo. Po przeliczeniu zliczeń na wydajność promieniowania, dane dotyczące fluorescencji można określić ilościowo dla każdego zestawu narządów.Ważne jest, aby pamiętać, że różne narządy wykazują autofluorescencję w odpowiedzi na różne długości fal wzbudzenia. Krótsze długości fal wzbudzenia, takie jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji, są związane z wyższymi poziomami autofluorescencji, zwłaszcza w wątrobie i mózgu, niż fale wzbudzenia dalekiej czerwieni lub bliskiej podczerwieni. Utrwalanie formaliny i zatapianie parafiny w skrawkach tkanek z każdego narządu umożliwia analizę immunofluorochemiczną markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, a także ilościowe określenie interesujących komórek odpornościowych lub zrębowych w każdej tkance.Dostosuj ustawienia obrazowania, aby uniknąć nasycenia i śledź ustawienia, a następnie zastosuj te same ustawienia akwizycji do innych próbek w tym samym eksperymencie, aby uzyskać spójność i dokładność. Immunohistochemię można również przeprowadzić na skrawkach tkanki, jeśli peptyd penetrujący komórkę kandydującą kolokalizuje się ze strukturą lub białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

in-vivo-imaging-transduction-efficiencies-cardiac-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Ten protokół przedstawia prosty i spójny sposób na przejściowe zwiększenie wartości interesującego genu za pomocą modRNA po zawale mięśnia sercowego u myszy.

Dostarczanie zmodyfikowanego mRNA w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Terapia genowa mięśnia sercowego w chorobie niedokrwiennej serca jest bardzo obiecująca dla przyszłych terapii. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu.

Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Obecny protokół opisuje trzy metody podawania kardioaktywnych środków terapeutycznych w modelu świniowym. Samice świń rasy lądowej otrzymywały leczenie poprzez: (1) torakotomię i wstrzyknięcie przeznasierdziowe, (2) wstrzyknięcie przezwsierdziowe za pomocą cewnika lub (3) wlew dożylny za pomocą minipompy osmotycznej żyły szyjnej.

Dostarczanie terapii kardioaktywnej w modelu zawału mięśnia sercowego u świń

Mieszek włosowy to niezwykle złożony wyrostek skóry, zawierający wiele typów komórek. Mieszek przechodzi stałe cykle w trakcie życia organizmu, obejmujące wzrost i resorpcję, przy czym wzrost zależy od specyficznych komórek macierzystych. Omówiono celowanie w mieszek za pomocą genów i komórek macierzystych w celu zmiany jego właściwości, w szczególności charakteru łodygi włosa. Opisano systemy dostarczania do mieszków włosowych, takie jak liposomy i wektory wirusowe stosowane w terapii genowej.

ukierunkowana ekspresja GFP w mieszku włosowym przy użyciu transdukcji wirusowej ex vivo

Poznaj metodę oceny transdukcji peptydów penetrujących komórki w myszach CD1 przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo i eks vivo. Protokół ten pozwala maksymalizować dane z jednego zwierzęcia, redukując liczbę potrzebnych osobników.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Przeglądaj więcej filmów