Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Nasz protokół pozwala nam śledzić biodystrybucję i potwierdzić specyficzną tkankowo internalizację peptydu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu dwóch oddzielnych, ale uzupełniających się metodologii. Możemy użyć tego protokołu, aby zmaksymalizować dane uzyskane od pojedynczego zwierzęcia i uzyskać ilościowe dane z obrazowania fluorescencji osiowej. Dodatkowo możemy uzyskać jakościowe obrazy mikroskopowe.

Po uzyskaniu zsyntetyzowanych w fazie stałej C-końcach amidowych kapu CTP z N-końcem znakowanym Cy5.5 z zakładu syntezy peptydów, należy wykonać jedno- lub 10-milimolową porcję roztworu podstawowego CTP w dimetylosulfotlenku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu ochrony przed światłem. W dniu eksperymentu należy załadować 10 miligramów na kilogram dawki Cy5,5 CTP w 200 mikrolitrach PBS do strzykawki insulinowej. Zważ mysz i dostarcz peptyd dożylnie znieczulonej sześciotygodniowej samicy myszy CD1.

Pozwól peptydowi krążyć przez wcześniej określony okres eksperymentalny przed eutanazją myszy za pomocą komory CO2 o wysokim przepływie i użyciem nożyczek do otwarcia jamy klatki piersiowej i wykonaniem małego nacięcia w bocznej wolnej ścianie prawego przedsionka. Użyj pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby przelać trzy mililitry 10% buforowanego fosforanu formaliny przez wierzchołek lewej komory, aby utrwalić tkanki i wypłukać wszelkie czerwone krwinki. Następnie zbierz serce, płuca, wątrobę, nerki, śledzionę, jelito grube i cienkie, pęcherz moczowy, jajniki lub jądra oraz mózg do indywidualnych dołków 12-dołkowej płytki do obrazowania optycznego ex vivo.

W przypadku obrazowania in vivo obrazów transdukowanych CTP uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij przycisk Zainicjuj, aby przygotować system do obrazowania. Otwórz kreatora obrazowania i wybierz opcję Fluorescencja i para filtrów. Kliknij Nazwy, Barwniki, Cyjanek i Cy5, aby ustawić parametry wzbudzenia i emisji.

Kliknij Ustawienia ręczne, aby ustawić ekspozycję na jedną sekundę, kategorię na małą, przysłonę i przysłonę na osiem, a pole widzenia na 15 centymetrów. Kliknij przycisk Pobierz i ustaw folder, w którym mają być zapisywane próbki. Dodaj odpowiednie informacje eksperymentalne w oknie edytowania etykiet obrazów i kliknij przycisk OK. Pojawi się uzyskany obraz.

Ustaw urządzenia na wydajność promieniowania. Kliknij dwukrotnie obraz, a następnie kliknij opcję Korekcje i Adaptacyjne odejmowanie tła fluorescencyjnego. Dostosuj próg, aby na fioletowo pokryć tylko narządy będące przedmiotem zainteresowania.

Możesz też kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać opcję Obszar kadrowania, aby narysować pole zawierające wszystkie interesujące Cię próbki. Po uzyskaniu wszystkich obrazów przenieść próbki do fiolek scyntylacyjnych zawierających 10% buforowanego fosforanu formaliny w objętości co najmniej 20 razy większej niż objętość tkanki i przechowywać tkanki w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem przez co najmniej 48 godzin. Aby określić ilościowo obrazy, ustaw jednostki na wydajność promieniowania, a obszar zainteresowania na cztery na trzy.

Dostosuj pole obszaru zainteresowania, aby równomiernie pokryć wszystkie dołki, a następnie kliknij przycisk Zmierz obszary zainteresowania. Następnie kliknij opcję Pomiary obszaru zainteresowania siatki, aby dopasować komórki obszaru zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby zapisać dane w pliku tekstowym lub CSV. Gdy narządy są wystarczająco utrwalone po upływie co najmniej 48 godzin, należy przenieść próbki do kaset do przetwarzania tkanek i osadzania, a następnie załadować kasety do maszyny do przetwarzania tkanek.

Ustaw procesor na odwodnienie tkanki etanolem zgodnie ze wskazaniami, a następnie oczyszczenie za pomocą dwóch 30-minutowych zabiegów ksylenem i wlewu parafinowego za pomocą czterech 30-minutowych zabiegów parafinowych. Po ostatnim zabiegu parafinowym należy usunąć tkanki z maszyny do obróbki. Umieść chusteczki w osobnych metalowych foremkach i wyłóż każdą formę stopioną parafiną.

Umieść foremki na zimnym talerzu. Gdy parafina na dnie formy zacznie krzepnąć, umieść organy w parafinie. Po umieszczeniu wszystkich organów umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy jako podkład i przepełnij formy stopioną parafiną.

Pozwól parafinie ostygnąć do zestalenia, zanim będziesz przechowywać bloki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka ustaw mikrotom o kącie nachylenia ostrza sześciu stopni i grubości przekroju 10 mikrometrów i zamontuj bloki tkanek w mikrotomie. Rozpocznij cięcie, aż uzyskasz skrawki zawierające tkankę i umieść bloki zadrukowaną stroną do dołu w kąpieli destylowanej w wodzie destylowanej o temperaturze 38 stopni Celsjusza na pięć minut lub do momentu, gdy tkanka wchłonie trochę wilgoci.

Gdy w bloku pojawi się cienki biały kontur tkanki, umieść tkankę na płaskim bloku lodu na 10 minut, a następnie włóż ją z powrotem do mikrotomu w tej samej orientacji, w jakiej została właśnie załadowana. Zacznij uzyskiwać plasterki, dzięki którym obcięte sekcje mogą tworzyć długie wstęgi po sześć do 10 sekcji każda. Aby zapewnić pomyślne pobranie wycinka tkanki, utrzymuj blok nawodniony.

Umieść blok z powrotem na lodzie, jeśli jakość sekcji jest słaba lub zaczyna się pogarszać. Wyrzuć nieoptymalne taśmy parafinowe, aż zostanie wyprodukowana wysokiej jakości taśma o długości wystarczającej do przykrycia szkiełka. Użyj krawędzi, aby przenieść wysokiej jakości wstążki do łaźni wodnej o temperaturze 38 stopni Celsjusza i pozwól sekcjom usiąść na powierzchni destylowanej wody, aż się wygładzą.

Spłaszczone sekcje wynieś na powierzchnię czystego szkiełka i rozpuść wosk w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby odparafinować szkiełka, należy potraktować próbki trzykrotnie ksylenem przez 10 minut na każdy zabieg. Po ostatnim zabiegu z użyciem ksylenu należy ponownie nawodnić tkanki za pomocą pięciominutowego zanurzenia w etanolu zstępującego, jak wskazano, a następnie pięciominutowego zanurzenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem.

Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez noc, zamontuj sekcje za pomocą szkiełek nakrywkowych i 125 mikrolitrów podłoża montażowego uzupełnionego DAPI i wysusz szkiełka przez noc, chroniąc je przed światłem przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po utrwaleniu serce, płuca, wątroba, nerki, śledziona i mózg zwierząt doświadczalnych i kontrolnych są umieszczane na 12-dołkowej płytce do optycznego obrazowania fluorescencyjnego ex vivo. Po przeliczeniu zliczeń na wydajność promieniowania, dane dotyczące fluorescencji można określić ilościowo dla każdego zestawu narządów.

Ważne jest, aby pamiętać, że różne narządy wykazują autofluorescencję w odpowiedzi na różne długości fal wzbudzenia. Krótsze długości fal wzbudzenia, takie jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji, są związane z wyższymi poziomami autofluorescencji, zwłaszcza w wątrobie i mózgu, niż fale wzbudzenia dalekiej czerwieni lub bliskiej podczerwieni. Utrwalanie formaliny i zatapianie parafiny w skrawkach tkanek z każdego narządu umożliwia analizę immunofluorochemiczną markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania, a także ilościowe określenie interesujących komórek odpornościowych lub zrębowych w każdej tkance.

Dostosuj ustawienia obrazowania, aby uniknąć nasycenia i śledź ustawienia, a następnie zastosuj te same ustawienia akwizycji do innych próbek w tym samym eksperymencie, aby uzyskać spójność i dokładność. Immunohistochemię można również przeprowadzić na skrawkach tkanki, jeśli peptyd penetrujący komórkę kandydującą kolokalizuje się ze strukturą lub białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.