Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej
26 lipca 2021
Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.
Protokół ten pozwala na proste generowanie wielkoskalowych sieci nanorurek lipidowych, w których poszczególne nanorurki wykazują zachowanie separacji faz podobne do pęcherzyka rodzicielskiego. Kluczową zaletą tego podejścia jest to, że dokooptujemy pracę wykonaną przez silniki molekularne do samoorganizacji nanorurek lipidowych w wysoce równoległy sposób i bez interwencji człowieka. Aby przeprowadzić test ruchliwości ślizgowej, najpierw przymocuj trzy zestawy dwustronnych pasków taśmy na szklanym szkiełku w odległości pięciu milimetrów od siebie.
Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do taśmy i dodaj 30 mikrolitrów jednomikromolowego roztworu kinezyny do przygotowanej celi przepływowej. Po pięciu minutach dodaj 30 mikrolitrów roztworu mikrotubul o stężeniu 10 mikrogramów/mililitrów do komórki, delikatnie dociskając laboratoryjną chusteczkę do przeciwległego końca kanału przepływowego, aby ułatwić wymianę roztworu. Po kolejnej pięciominutowej inkubacji przemyj komórkę od jednego do trzech razy 50 mikrolitrami roztworu o temperaturze pokojowej na mycie, a następnie dodaj 30 mikrolitrów 10-mikrogramowego/mililitrowego roztworu streptawidyny do komory przepływowej.
Po 10 minutach dodaj 30 mikrolitrów roztworu 10X GUV na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dwa mikrolitry 100-milimolowego roztworu AMP-PNP i zamknij komorę szczeliwem. Przenieś komorę przepływową do odwróconego mikroskopu w celu obrazowania i wybierz odpowiedni zestaw filtrów.
Użyj obiektywu olejowego 100X, aby najpierw ustawić ostrość na powierzchni szkiełka nakrywkowego, zanim uzyskasz obraz interesującej sieci. Następnie otwórz obraz w ImageJ i kliknij Obraz, Kolor i Kompozyt, aby nałożyć na siebie kanały czerwony i zielony w celu utworzenia obrazu kompozytowego. Po zobrazowaniu otwórz interesujący Cię obraz i kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę, aby skalibrować skalę dla mikroskopu.
Wypełnij piksele do mikrometrowego współczynnika konwersji i kliknij przycisk OK. Użyj narzędzia do linii wielopunktowej, aby obrysować nanorurki, zaczynając od macierzystego GUV, a następnie naciśnij i przytrzymaj Control i M, aby zmierzyć długość. Narzędzie do przetwarzania obrazu zapisze każdy nowy pomiar w oknie wyników. Po zmierzeniu wszystkich probówek wybierz opcje Obraz, Dostosuj i Próg, a następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby zastosować próg.
Następnie narysuj prostokąt o znanej długości nad żądaną rurką. Aby zmierzyć zintegrowaną gęstość obszaru, kliknij przycisk Analizuj i zmierz Aby określić podział lipidów w węzłach ciekłych nanorurek, użyj narzędzia linii, aby narysować linię nad węzłem zainteresowania i zmierzyć intensywność węzła zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. W tej reprezentatywnej analizie wyprodukowano sieci ciekłych nanorurek, jak wykazano, w celu wygenerowania faz nieuporządkowanych i uporządkowanych cieczy, a także pęcherzyków oddzielonych fazowo.
Na przykład pęcherzyki zsyntetyzowane z 45% nasyconymi lipidami i 55% nienasyconymi lipidami powodują powstanie pęcherzyków, które rozdzielają się na współistniejące fazy nieuporządkowane cieczą i stałe. Jeśli jednak uwzględni się cholesterol, można zaobserwować współistnienie cieczy-cieczy, tworząc GUV, które rozdzielają się na współistniejące fazy uporządkowane cieczą i nieuporządkowane cieczą. Ponadto w mieszaninach rozdzielonych fazowo można zaobserwować węzły.
Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać, jest dobranie odpowiedniego czasu naświetlania i zestawu filtrów ND, aby móc uwidocznić nanorurki lipidowe bez fotowybielania fluoroforów. Dostosowanie składu zachowania fazowego nanorurek lipidowych pozwala nam na wykorzystanie minimalistycznego systemu modelowego do rozpoczęcia badań biofizycznych nanorurek tunelowych łączących komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia prostą generację wielkoskalowych sieci nanorurek lipidowych z wykorzystaniem motylności ślizgowej kinezyny. Poszczególne nanorurki wykazują zachowanie separacji faz podobne do tego obserwowanego w pęcherzykach macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biofizyka
- biologia komórki
Wstęp
- Nanorurki lipidowe są istotne dla badania dynamiki błon.
- Motory kinezynowe ułatwiają samoorganizację struktur lipidowych.
- Separacja faz w układach lipidowych może dostarczyć informacji na temat procesów komórkowych.
- Metoda ta zwiększa skalowalność produkcji nanorurek.
Cel badania
- W celu wydajnego wytwarzania sieci lipidowych nanorurek.
- W celu wykorzystania silników molekularnych do samoorganizacji bez ingerencji człowieka.
- W celu zbadania zachowania fazowego lipidowych nanorurek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie testu motywności ślizgowej z wykorzystaniem kinezyny i mikrotubul.
- Zastosowanie dwustronnej taśmy klejącej w celu stworzenia komory przepływowej na szkiełku przedmiotowym.
- Sekwencyjne dodawanie roztworów kinezyny i mikrotubul.
- Przemywanie i dodanie streptawidyny w celu ułatwienia formowania się nanorurek.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie sieci lipidowych nanorurek.
- Wykazanie zjawiska separacji faz w nanorurkach.
- Wysoka skalowalność metody dzięki zastosowaniu motorów molekularnych.
- Potencjalne zastosowania w badaniu dynamiki błon oraz procesów komórkowych.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę wytwarzania nanorurek lipidowych.
- Wykorzystanie motorów kinezynowych umożliwia efektywne samoorganizowanie się struktur.
- Podejście to może przyczynić się do rozwoju badań w dziedzinie biologii lipidów i dynamiki błon.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka fabrykacja wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych z wykorzystaniem testu ruchliwości kinezyny (gliding kinesin motility assay) umożliwia tworzenie skalowalnych i powtarzalnych modeli in vitro do badania transportu związanego z błoną oraz biofizyki lipidów. Podejście to wspiera wczesne etapy odkryć naukowych, dostarczając regulowalnych i biologicznie istotnych układów, które naśladują złożoność komórkowych cewek lipidowych. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w badaniach mechanistycznych oraz w procesie selekcji projektów w badaniach nad terapiami celowanymi w błony komórkowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów transportu błonowego w kontrolowanym, regulowanym systemie.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów molekularnych zaangażowanych w dynamikę i transport lipidów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie rozdzielania faz oraz zachowań partycjonowania lipidów.
- Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących oddziaływań lipid-białko istotnych dla szlaków chorobowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne i skalowalne przygotowanie sieci nanorurek lipidowych do dalszych analiz.
- Umożliwia ilościowy pomiar długości i szerokości nanorurek oraz rozdziału lipidów w celu standaryzacji testów.
- Pozwala na szybkie generowanie złożonych układów lipidowych przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.
- Wspiera przesiewanie związków wpływających na strukturę błony lub procesy transportu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotny pod kątem chorobowym model do badania nanorurek tunelowych zaangażowanych w komunikację międzykomórkową.
- Wspiera translacyjne odkrywanie biomarkerów, umożliwiając analizę zachowania faz lipidowych i ich rozdziału.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację interwencji ukierunkowanych na błony komórkowe.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w wyborze modelu przedklinicznego dla związków aktywnych wobec błon.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnych badań mechanistycznych po rozwój modeli przedklinicznych dla celów związanych z błonami.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków transportu oraz sygnalizacji zapśredniczonej przez lipidy.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne sieci nanorurek lipidowych o regulowanych właściwościach.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar wymiarów nanorurek i rozdziału lipidów do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczną wiedzę in vitro z zjawiskami błonowymi istotnymi dla chorób.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje standaryzowaną, skalowalną platformę możliwą do adaptacji w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad biologią błon.
- Wartość operacyjna: Usprawnia wytwarzanie, standaryzację i odtwarzalność złożonych systemów lipidowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w przypadku portfolio ukierunkowanego na błony.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki aktywne w obrębie błon z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biofizyki lipidów oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
- Wymaga standardowej aparatury laboratoryjnej do montażu celi przepływowej i obrazowania.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i pomiarowych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych składów lipidowych i systemów modelowych w zależności od potrzeb badawczych.
- Zależne od starannej kontroli parametrów obrazowania w celu uniknięcia fotowyblaknięcia fluoroforu.
