Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Rola, jaką odgrywa zapach w komunikacji zwierząt, jest obecnie niedoceniana, a więc niedostatecznie zbadana. W szczególności bardzo niewiele wiadomo na temat zmian chemicznych leżących u podstaw sygnałów węchowych u zwierząt, w tym u ludzi. Wynika to również z wyzwań metodologicznych, rejestrowania i ilościowego określania związków chemicznych zapachów wykorzystywanych przez zwierzęta do komunikacji.

Istnieje kilka potencjalnych wyzwań podczas pracy z wysoce złożonymi mieszaninami chemicznymi, w tym również podczas pobierania próbek i analizowania próbek zapachów. Przeprowadzamy analizę zapachów używanych przez zwierzęta, aby zrozumieć, w jaki sposób mogą być one przez nie wykorzystywane, gdy komunikują się między sobą. Połączyliśmy cytochemię z bioekologią, endokrynologią i cytologią, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką odgrywa zapach w komunikacji zwierząt.

W naszej obecnej metodologii w Wolverhampton przyjęliśmy technikę mikrostruktury fazy stałej Headspace w połączeniu ze spektrometrią mas chromatografii gazowej, zbudowaną i nieznaną z metodologii stosowaną w przeszłości. Próbki zapachów są zbierane w jeden z następujących sposobów. Jeden, spontanicznie uwolnione zapachy próbek od przyzwyczajonych badanych.

Na przykład naczelne w ogrodach zoologicznych zbierają wydzieliny zapachowe gruczołów zapachowych poprzez znakowanie zapachem na sterylnej bibule filtracyjnej lub próbkach moczu bezpośrednio do fiolek. Po drugie, po przeszkoleniu badanych za pomocą pozytywnego wzmocnienia zbieraj wydzieliny zapachowe, pocierając spojrzenie zapachowe sterylnymi wacikami. Po trzecie, po sedacji badanych osób pobiera wydzieliny zapachowe, pocierając gruczoły zapachowe sterylnymi wacikami bawełnianymi, pobierając próbki do sterylnych 10-mililitrowych fiolek z przezroczystego szkła z zakrętką i zaklejając nakrętkami zawierającymi sektor silikonowy P T F E.

Fiolki należy natychmiast przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że podczas pobierania próbek należy używać czystych środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe. Często zmieniaj rękawice, unikaj bezpośredniego kontaktu skóry z próbkami i fiolkami.

Zaleca się używanie fabrycznie nowych fiolek. Jednak w przypadku zużytych fiolek konieczne jest ich wstępne oczyszczenie, a następnie zastosowanie tego samego protokołu. Bierz puste miejsca środowiskowe za każdym razem, gdy zbierane są ślady zapachowe.

W tym celu należy wystawić nieużywaną bibułę filtracyjną lub bawełniany wacik i fiolki na działanie środowiska podczas pobierania próbek. Próbki są przygotowywane w terenie. Aby uzyskać bibułę filtracyjną oznaczoną zapachem, wytnij około 10 milimetrów kwadratowych z papieru i umieść w 10-mililitrowej fiolce z miejscem na głowę ze śrubą.

W przypadku wacika odetnij główkę wacika na samym końcu trzonu wacika i umieść w fiolce z przestrzenią na głowę. Po przygotowaniu każdej próbki należy wyrzucić lub wyczyścić ostrze do cięcia pożywki do pobierania próbek odpowiednią chusteczką antybakteryjną i/lub alkoholem i dokładnie wysuszyć. Przechowuj wszystkie próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Należy pamiętać, że próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jednak w magazynie polowym w najniższej możliwej temperaturze i jak najszybciej przenieść do minus 20 stopni Celsjusza. Przed analizą należy wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić do naturalnej temperatury pokojowej przez co najmniej godzinę. Skonfiguruj metody analityczne w GCMS w następujący sposób dla warunków analizy SPMS, postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, aby kondycjonować włókna SBME przed pierwszym użyciem.

Bardzo ważne jest, aby zespół SBME był prawidłowo zainstalowany w próbniku automatycznym i aby był wyrównany z tacami automatycznego próbnika, jednostką kondycjonowania światłowodu i portem wlotowym GC. Nieprawidłowe wyrównanie może spowodować uszkodzenie lub zniszczenie włókna Sbme. Upewnij się, że dopływ gazu z okonia do jednostki kondycjonowania światłowodu jest włączony.

Aby poprawić spójność czasu przechowywania próbki, metoda analityczna polega na zablokowaniu czasu retencji, dodaniu fiolek z próbką do tacki automatycznego próbnika, umieszczeniu pustej fiolki z miejscem na głowę, aby działała jako ślepa próba systemowa w pierwszej pozycji tacy automatycznego próbnika. Umieść ślepą próbę środowiskową w drugiej pozycji, a następnie umieść wszystkie pozostałe próbki do analizy w kolejnych pozycjach tacy automatycznego próbnika. Utwórz sekwencję analityczną, aby przeanalizować każdą próbkę w zasobniku na próbki.

Na ekranie głównym masowego łowcy wybierz sekwencję dla paska menu, a następnie załaduj sekwencję z menu rozwijanego. Zostanie wyświetlona pusta tabela sekwencji, uzupełnij tabelę sekwencji dla wszystkich ślepych prób i próbek, wstawiając odpowiednie informacje zapisane jako ukończone tabele sekwencji. Należy pamiętać, że dokładne informacje dotyczące tabeli sekwencji będą zależeć od formatowania tabeli przez laboratoria.

Minimalne informacje zwykle obejmują typ próbki, nazwę próbki, lokalizację i numer pliku, metodę analityczną i lokalizację pliku danych oraz alokację nazwy pliku danych, która jest zgodna z nazwą próbki przedawnionej w przyszłości przetwarzania danych. Podczas analizy do sekwencji można dodać dodatkowe próbki. Uruchom sekwencję, wybierając sekwencję z paska menu, a następnie uruchom sekwencję.

Po analizie próbki zostały jak najszybciej zwrócone do zamrażarki. Należy pamiętać, że możliwa jest ponowna analiza próbek. Należy jednak zauważyć, że niektóre lotne składniki mogły zostać całkowicie wyekstrahowane podczas wstępnej analizy, a niektóre związki mogły ulec rozkładowi termicznemu i bakteryjnemu w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

W związku z tym wynik na chromatogramie może nie być w pełni reprezentatywny dla oryginalnego oznakowania zapachowego. Wstępna analiza danych obejmuje integrację chromatogramów w celu uzyskania danych o czasie retencji i obszarze pików wraz ze wstępną identyfikacją pików za pomocą oprogramowania cam station i zagnieżdżonych baz danych widm masowych. Analiza danych może być przeprowadzana ręcznie lub metodą półautomatyczną.

Jeśli stosowana jest metoda półautomatyczna, czasami korzystne jest przeprowadzenie pewnej ręcznej analizy danych w celu zweryfikowania wstępnych identyfikacji. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz plik danych, klikając odpowiedni plik na pasku nawigacyjnym po lewej stronie. Chromatogram jonów całkowitych TIC zostanie wyświetlony w górnym oknie ekranu analizy danych.

Aby zintegrować TIC za pomocą integratora RTE, najpierw wybierz chromatogram z paska menu, a następnie wybierz integrator z menu rozwijanego, otworzy się wyskakujące okienko i wybierz integrator RTE. Wróć do menu chromatogramu i teraz wybierz integrację. Aby dostosować parametry całkowania tak, aby całkowane były piki lub szum linii bazowej większy niż trzykrotnie, ponownie wybierz chromatogram z paska menu, a następnie Parametry integracji MS Signal z menu rozwijanego.

W wyskakującym okienku dostosuj minimalny obszar piku zgodnie z potrzebami, 1.0 daje akceptowalne wyniki w naszych przykładach. Aby zidentyfikować szczyty i wygenerować raport podsumowujący, wybierz eksport raportów z paska menu, a następnie raport wyników wyszukiwania w bibliotece do XLS. Należy pamiętać, że biblioteki spektralne, które mają być przeszukiwane, wraz z liczbą dopasowań bibliotek do wyświetlenia, muszą być wstępnie ustawione w oprogramowaniu, zanim będzie można rozpocząć przeszukiwanie biblioteki.

Wynikowy raport arkusza kalkulacyjnego zawiera dane integracji dla każdego piku oraz wstępne dopasowanie biblioteki spektralnej w celu przypisania tożsamości. Zazwyczaj jakość biblioteki lub dopasowanie biblioteki powinno być większe niż 80, aby zaakceptować wstępną identyfikację. Zapisz arkusz kalkulacyjny.

Aby zidentyfikować pik bezpośrednio na podstawie TIC, wybierz pik, który Cię interesuje. Jeśli szczyt jest mały, powiększ obraz, rysując ramkę wokół szczytu, przytrzymując lewy przycisk myszy, rozciągnij ramkę nad szczytem i zwolnij przycisk myszy. Umieść linię kursora tak, aby znajdowała się w najwyższym punkcie szczytu lub tuż za nim.

Kliknij dwukrotnie, prawy przycisk myszy, a widmo masowe dla piku pojawi się w dolnym oknie ekranu analizy danych. Aby przeszukać bibliotekę spektralną, przesuń kursor w dowolne miejsce w oknie widma i kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy, a wyniki wyszukiwania w bibliotece pojawią się w nowym oknie. Aby usunąć szum tła z interesującego spektrum, najpierw kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy na danym piku, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w obszarze bez pików bezpośrednio przed szczytem zainteresowania, kliknij przycisk odejmij na wstążce menu lub wybierz chromatogram dla paska menu, a następnie odejmij widma z menu rozwijanego.

Odjęte widmo zostanie wyświetlone w dolnym oknie ekranu analizy danych i wyświetli myślnik obok zeskanowanych danych w nagłówku okna. Postępując zgodnie z tym protokołem, wstępnie zidentyfikowaliśmy w sumie 32 lotne związki chemiczne na podstawie analizy 14 śladów zapachowych narządów płciowych spontanicznie uwalnianych na bibule filtracyjnej przez lemury czerwone, i porównaliśmy profile zapachowe z cechami sygnalizatora naturalnie występujące związki lotne, takie jak węglowodory, terpeny, alkohole Turpina i ketony, które były obecne w tych profilach i obejmują związki, które wcześniej stwierdzono, że działają jako hormony płciowe i sygnały do sprawności u innych gatunków zwierząt. Związki, które zostały wstępnie zidentyfikowane, wymieniono w tabeli pierwszej.

Reprezentatywne chromatogramy, jeden ze znaku kontrolnego i jeden ze znaku zapachowego z Limy, są pokazane na rysunku pierwszym. Liczba i względna obfitość składników różniła się w zależności od próby u różnych badanych. Jednak sześć związków oznaczonych od A do F na chromatogramie było obecnych we wszystkich próbkach.

Związki te były odpowiednio wygięte na wysokość do wyspy E: jeden, sześciokątny, parakryształ, sześć paramentów, dwa, osiem barwników, jeden, dwa, pinen, cztery i pentodekanu. Wyniki tego badania sugerują, że lemury czerwono-kryzowe używają znakowania wysyłanego do przekazywania informacji o płci i wieku kobiet, przy czym brak znakowania narządów płciowych odgrywa rolę w komunikacji społeczno-seksualnej. Innym reprezentatywnym wynikiem po zastosowaniu tego protokołu było nasze badanie reklamy płodności przez samice pawianów oliwkowych.

Zidentyfikowaliśmy łącznie 74 lotne związki na podstawie analizy 395 próbek zapachu pochwy samic pawiana. Obejmowały one szereg naturalnie występujących lotnych związków zapachowych, takich jak ketony, alkohole, aldehydy, terpeny, lotne kwasy tłuszczowe i węglowodory. Typowe chromatogramy używane do porównywania pustych próbek zapachu pochwy trolla i samicy pawiana z okresów płodnych i niepłodnych przedstawiono na rysunku drugim.

Badamy zależności między profilami zapachowymi pochwy a otwartością seksualną samic pawianów. Nasze wyniki wykazały, że całkowita ilość zapachu pochwy różni się w zależności od płodności, co sugeruje, że zapach może odgrywać rolę w sygnalizowaniu płodności samicy pawiana. Stwierdziliśmy również różnice w zapachu pochwy między typami grup, ale nie byliśmy w stanie rozróżnić wpływu składu grupy, nierównomierności wieku kobiet.

Jest to połączenie zalet pobierania próbek i stosowania GCMS. Tak więc mikroekstrakcja do fazy stałej w przestrzeni nad głową umożliwia analizę szerokiego zakresu różnych próbek za pomocą GCMS. Jesteśmy w stanie oddzielić elementy tych złożonych oznaczeń, a następnie zidentyfikować każdy z tych pojedynczych elementów za pomocą spektrometru mas.

Cała połączona technika jest bardzo potężna i daje nam wiele informacji na temat tych oznaczeń zapachowych, które w przeszłości wymagałyby dużej ekstrakcji przygotowania próbki, aby móc uzyskać wyniki.