Name: Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Poznaj metody pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych zwierząt za pomocą technik mikroekstrakcji i chromatografii gazowej. To podejście pozwala badaczom zidentyfikować lotne związki chemiczne kluczowe dla komunikacji międzygatunkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Keithowi Holdingowi za pomoc w analizach chemicznych w Rosalind Franklin Science Center w Wolverhampton oraz Benowi Mantle'owi za produkcję filmu. Jesteśmy również wdzięczni prof. Gloriano Moneti, dr. Giuseppe Pieracciniemu i członkom Centrum Spektrometrii Mas Uniwersytetu Florenckiego we Florencji, a także prof. Luca Calamai i dr Marco Michelozzi z laboratorium ARCA CNR we Florencji za ich pomoc w opracowaniu tej metodologii. Projekty badawcze, które obejmowały opisane w manuskrypcie metody pobierania próbek i analizy, były wspierane przez dwa wewnątrzeuropejskie stypendia działania "Maria Skłodowska-Curie" (identyfikatory umów o grant: 327083, 703611), niewielki grant ("Naczelny wzbogacony sensorycznie") od Primate Society of Great Britain oraz niewielki grant badawczy ("Czy łowcy-zbieracze mają specjalny zmysł węchu?") z British Academy/The Leverhulme Trust na rzecz S.V. Prace laboratoryjne potrzebne do opracowania tej metodologii otrzymały również dofinansowanie z Wydziału Nauk Ścisłych i Inżynierii's Annual Funding Competition (Wolverhampton) dla S.V.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przykładowe zapachy, które są jednym z poniższych:
	<ol>
		<li>Zbieraj spontanicznie uwalniane przez przyzwyczajonych uczestników badania (np. naczelne z zoo) poprzez znakowanie zapachowe na sterylnej bibule filtracyjnej (np. wydzieliny zapachowe gruczołów zapachowych) lub bezpośrednio do fiolek (np. moczu).</li>
		<li>Zbieraj, pocierając sterylne waciki bawełniane po szkoleniu badanych osób, stosując trening pozytywnego wzmocnienia.</li>
		<li>Zbieraj, pocierając sterylne waciki bawełniane po uspokojeniu badanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić próbki w sterylnych fiolkach z przezroczystego szkła o pojemności 10 ml z zakręcaną nakrętką i zamknąć nakrętkami zawierającymi FTFE/silikonowe przegrody. Natychmiast przechowywać je w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Konieczne jest stosowanie czystych środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe; często je zmieniaj; Unikać bezpośredniego kontaktu skóry z próbkami i fiolkami. Zaleca się używanie zupełnie nowych fiolek; Jednak w przypadku zużytych fiolek konieczne jest ich wstępne oczyszczenie, a następnie zastosowanie tego samego protokołu.</li>
	<li>Bierz puste miejsca środowiskowe za każdym razem, gdy zbierane są ślady zapachowe. Na przykład należy pobrać pożywkę do pobierania próbek (np. bibułę filtracyjną lub wacik) oraz fiolkę z przestrzenią nad roztworem, które są wystawione na działanie środowiska podczas pobierania próbek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotować próbki w terenie, wycinając ostrzem około 10 mm kwadratu z oznaczonej zapachem bibuły filtracyjnej lub główki wacika i umieszczając ją w 10 ml zakręcanej fiolce z przestrzenią na głowę.</li>
	<li>Po przygotowaniu każdej próbki należy wyrzucić lub oczyścić ostrze używane do cięcia pożywki do pobierania próbek za pomocą odpowiedniej chusteczki antybakteryjnej i/lub alkoholu i dokładnie wysuszyć.</li>
	<li>Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Preferowane w temperaturze -20 °C lub w inny sposób tak niskiej, jak to praktycznie możliwe w terenie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do analizy
<ol>
	<li>Wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić do naturalnego ogrzania do temperatury pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Skonfiguruj metodę analityczną na GC-MS w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W przypadku warunków analizy SPME należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta, aby kondycjonować włókna SPME przed pierwszym użyciem: wstępne kondycjonowanie włókien (260 °C przez 5 min), inkubacja próbki (40 °C przez 2 min), czas ekstrakcji (15 min), czas desorpcji (2 min) i kondycjonowanie końcowe włókna (260 °C przez 20 min).</li>
		<li>Stosować następujące warunki GC: kolumna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura wtryskiwacza (270 °C), natężenie przepływu (1 ml/min), tryb wtrysku (bez podziału), profil pieca GC (45 °C przez 2 min; 4 °C/min do 170 °C; 20 °C/min do 300 °C), przewód przesyłowy MSD (280 °C). 
		UWAGA: Aby poprawić spójność czasu retencji próbki, metoda analityczna jest zablokowana w czasie retencji).</li>
		<li>Stosować następujące warunki MSD: opóźnienie rozpuszczalnika (2,5 min) i zakres skanowania (od 29 do 400 amu). 
		UWAGA: Zakres od 10 do 400 był używany w poprzednich protokołach4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że dopływ gazu płuczącego do jednostki kondycjonowania światłowodów jest włączony. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zespół SPME był prawidłowo zainstalowany w automatycznym próbniku i aby był wyrównany z tacami automatycznego próbnika, jednostką kondycjonowania światłowodu i portem wlotowym GC. Nieprawidłowe wyrównanie może spowodować uszkodzenie lub zniszczenie światłowodu SPME.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Umieścić pustą fiolkę z przestrzenią nad roztworem (aby działała jako ślepa próba systemowa) w pierwszym miejscu tacki automatycznego próbnika GC-MS. Umieść ślepy półfabrykat środowiskowy w drugiej pozycji tacy automatycznego próbnika. Umieść próbki do analizy w kolejnych pozycjach tacy z automatycznymi próbkami.</li>
	<li>Utwórz sekwencję analityczną, aby przeanalizować każdą próbkę w zasobniku na próbki.
	<ol>
		<li>Na ekranie głównym MassHunter wybierz Sekwencja | Sekwencja ładowania.</li>
		<li>Wypełnić tabelę sekwencji dla wszystkich ślepych prób i próbek, wprowadzając odpowiednie informacje. Zapisz ukończoną tabelę sekwencji. 
		UWAGA: Dokładne informacje dotyczące tabeli sekwencji będą zależeć od formatowania tabeli przez laboratoria. Minimalne informacje zwykle obejmują typ próbki, nazwę próbki, lokalizację i numer fiolki, metodę analityczną oraz lokalizację i nazwę pliku danych (przypisanie nazwy pliku danych, która jest zgodna z nazwą próbki, pomaga w przyszłym przetwarzaniu danych). Podczas analizy do sekwencji można dodać dodatkowe próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom sekwencję, wybierając pozycję Sekwencja | Uruchom sekwencję.</li>
	<li>Po analizie należy jak najszybciej umieścić próbki w zamrażarce. 
	UWAGA: może być możliwa ponowna analiza próbek, ale należy zauważyć, że niektóre składniki lotne mogły zostać całkowicie wyekstrahowane podczas wstępnej analizy, a niektóre związki mogły zostać poddane rozkładowi termicznemu i bakteryjnemu w temperaturze 40 °C, w związku z czym otrzymany chromatogram może nie być w pełni reprezentatywny dla oryginalnego znakowania zapachowego.</li>
</ol>
5. Analiza danych
UWAGA: Wstępna analiza danych obejmuje integrację chromatogramów w celu uzyskania danych o czasie retencji i obszarze pików wraz ze wstępną identyfikacją pików za pomocą oprogramowania ChemStation i baz danych spektralnych mas NIST (National Institute of Standards and Technology), wersja MSD F.01.01.2317. Analiza danych może być przeprowadzana ręcznie lub metodą półautomatyczną. Jeśli stosowana jest metoda półautomatyczna, czasami korzystne jest przeprowadzenie pewnej ręcznej analizy danych w celu zweryfikowania wstępnych identyfikacji.
<ol>
	<li>Otwórz plik z danymi, klikając odpowiedni plik na pasku nawigacyjnym po lewej stronie. Chromatogram jonów całkowitych (TIC) zostanie wyświetlony w górnym oknie ekranu analizy danych.</li>
	<li>Aby zintegrować TIC za pomocą integratora RTE, wybierz Chromatogram | Integracja.</li>
	<li>Dostosuj parametry całkowania tak, aby całkowane były szczyty, które są większe niż 3 x szum linii bazowej. Wybierz chromatogram | Parametry integracji sygnału MS. W polu wyjściowym dostosuj odpowiednio minimalny obszar piku (1.0 daje akceptowalne wyniki w naszych przykładach).</li>
	<li>Aby zidentyfikować szczyty i wygenerować raport podsumowujący, wybierz opcję Eksportuj raporty | Wyniki wyszukiwania w bibliotece są zgłaszane do XLS. 
	UWAGA: Biblioteki spektralne, które mają być przeszukiwane, wraz z liczbą dopasowań bibliotek do wyświetlenia, muszą być wstępnie ustawione w oprogramowaniu, zanim będzie można rozpocząć przeszukiwanie biblioteki.</li>
	<li>Wynikowy raport arkusza kalkulacyjnego zawiera dane integracji dla każdego piku oraz wstępne dopasowanie biblioteki spektralnej w celu przypisania tożsamości. Zazwyczaj dopasowanie jakości biblioteki/biblioteki powinno wynosić >80, aby zaakceptować wstępną identyfikację. Zapisz arkusz kalkulacyjny.</li>
	<li>Zidentyfikuj pik bezpośrednio na podstawie TIC.
	<ol>
		<li>Wybierz szczyt zainteresowania.</li>
		<li>Jeśli szczyt jest mały, powiększ go, rysując ramkę wokół szczytu, przytrzymując lewy przycisk myszy, rozciągnij ramkę nad szczytem i zwolnij.</li>
		<li>Umieść linię kursora tak, aby znajdowała się w najwyższym punkcie szczytu (lub tuż po).</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy, a widmo masowe dla piku pojawi się w dolnym oknie ekranu analizy danych.</li>
		<li>Aby przeszukać bibliotekę spektralną, przesuń kursor w dowolne miejsce w oknie widma i kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy. Wyniki wyszukiwania w bibliotece pojawią się w nowym oknie.</li>
		<li>Aby usunąć szum tła z interesującego spektrum, najpierw kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy na danym szczycie. Następnie kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy w obszarze, w którym nie ma szczytów bezpośrednio przed szczytem zainteresowania. Wybierz chromatogram | Odejmij widma. Odjęte widmo zostanie wyświetlone w dolnym oknie ekranu analizy danych i wyświetli "(-)" obok danych SCAN w nagłówku okna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie próbek kontrolnych, zarówno kontroli środowiskowych utworzonych w momencie pobierania próbek, jak i ślepych prób systemowych, ma kluczowe znaczenie dla interpretacji próbek znaków zapachowych. Wszelkie piki przypisane środowisku pobierania próbek lub systemowi instrumentalnemu muszą być wyłączone z próbek znakowania zapachowego, tak aby tylko piki będące przedmiotem zainteresowania były uwzględniane w jakiejkolwiek interpretacji. Kontrole te mogą również odgrywać rolę w ocenie i monitorowaniu "zdrowia" oprz...

Bardzo mało wiadomo o zmianach chemicznych leżących u podstaw sygnałów węchowych u zwierząt1, również z powodu wyzwań metodologicznych związanych z rejestracją i ilościowym określaniem lotnych profili chemicznych zapachów2. Istnieje kilka potencjalnych pułapek podczas pracy z wysoce złożonymi, chemicznymi matrycami; Należą do nich pobieranie próbek i analizowanie próbek zapachów<klasa SUP="xref">3.
W Centrum Naukowym Rosalind Franklin, University of Wolverhampton, przeprowadzamy analizę zapachów i śladów zapachowych, aby zrozumieć, w jaki sposób mogą być one wykorzystywane przez zwierzęta. Łączymy semiochemię z ekologią behawioralną, endokrynologią i cytologią, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką odgrywają sygnały węchowe w komunikacji zwierząt.
Opracowaliśmy metodologię, a następnie przeanalizowaliśmy zapachy i znaki różnych gatunków, w tym kilku naczelnych niebędących ludźmi (np. lemury koronowane, lemury czerwone, makaki japońskie, pawiany oliwkowe, szympansy) i innych ssaków (np. kotów, krów). Zebraliśmy i przeanalizowaliśmy różne próbki, w tym mocz, kał, wydzieliny z włosów i gruczołów zapachowych. Te zapachy i ślady zapachowe składają się ze złożonych mieszanin związków, a zatem każda metodologia stosowana do ich analizy musi obejmować jakąś formę techniki separatora. Jak pokazano, występują one również w różnych matrycach, co wymaga zastosowania technik w celu wyodrębnienia interesujących ich składników.
Poprzednie badania przeprowadzone przez Vaglio et al.4 i inni autorzy5 używały dynamicznej ekstrakcji przestrzeni nad powierzchnią (DHS) z chromatografią gazową ze spektrometrią mas (GC-MS), podczas gdy bezpośrednia ekstrakcja rozpuszczalnikiem6 i złożone ekstrakcje rozpuszczalnikiem7 również zostały użyte. W szczególności dynamiczne pobieranie próbek w przestrzeni nad powierzchnią polega na przedmuchiwaniu przestrzeni nad powierzchnią znaną objętością gazu obojętnego, która ostatecznie usuwa wszystkie lotne związki, z wyjątkiem tych, które wykazują silne powinowactwo do matrycy próbki (na przykład związki polarne w próbkach wodnych).
Dla obecnej metodologii, przyjęliśmy technikę mikroekstrakcji w fazie stałej (HS-SPME) w połączeniu z GC-MS. W szczególności opracowaliśmy i udoskonaliliśmy metodologię już używaną przez Vaglio et al. w poprzednim laboratorium GC-MS8,9,10.
Techniki ekstrakcji bezrozpuszczalnikowej są bardzo skuteczne w analizie małych, wysoce lotnych związków (które w przeciwnym razie mogą być łatwo utracone z próbki), ponieważ te metody unieruchamiają związki na stabilnym, stałym nośniku fazy. HS-SPME wykorzystuje włókno pokryte polimerem adsorbującym do wychwytywania lotnych związków w przestrzeni nad próbką lub do ekstrakcji rozpuszczonych związków przez zanurzenie w wodnym płynie biologicznym11. Powłoka polimerowa nie wiąże silnie związków, dlatego poprzez podgrzanie w porcie wtryskowym GC można je usunąć. Ta metoda jest silniejsza niż techniki ekstrakcji rozpuszczalnikiem, a także bardziej skuteczna niż DHS.
W obecnym podejściu próbki znajdują się w szklanych fiolkach. Fiolki te są podgrzewane do temperatury 40 °C w celu symulacji temperatury ciała zwierzęcia w celu pobudzenia zajęcia przestrzeni nad głową fiolki przez lotne składniki znaku. Włókno SPME, pokryte 65 μm sorbentu z polidimetylosiloksanu/diwinylobenzenu (PDMS/DVB), jest wystawione na działanie środowiska nadpowierzchniowego, a lotne składniki próbki są adsorbowane na włóknie. Po podgrzaniu włókna w porcie wlotowym GC-MS, lotne składniki są desorbowane z włókna, a następnie oddzielane przez GC. Wzorce fragmentacji widma mas uzyskuje się dla każdego składnika za pomocą MS. Porównując te widma masowe z bazami danych widma masowego, możliwa jest wstępna identyfikacja składników znaku zapachowego. Dzięki zastosowaniu automatycznego próbnika jesteśmy w stanie w spójny sposób analizować wiele próbek w partiach.
Biorąc pod uwagę, że każdy rodzaj światłowodu SPME ma inne powinowactwo do polarnych związków chemicznych, zazwyczaj wybiera się włókno w zależności od polarności i/lub masy cząsteczkowej docelowych związków chemicznych. Ponadto warunki GC zmieniają się w zależności od rodzaju kolumny GC i charakterystyki docelowych związków chemicznych.
Ta technika pozwala na półilościową analizę lotnych składników znakowania zapachowego, umożliwiając separację i wstępną identyfikację składników w próbce, a następnie analizę proporcji powierzchni pików w poszukiwaniu trendów, które mogłyby oznaczać składniki znakowania zapachowego, które mogą być zaangażowane w sygnalizację.
Kluczowymi zaletami obecnego podejścia są:
<ul style="typ-stylu-listy: kwadrat;">
	<li>Zakres typów próbek, które mogą być analizowane.</li>
	<li>Nie jest wymagane skomplikowane przygotowanie próbki ani ekstrakcja.</li>
	<li>Możliwość analizy składników lotnych.</li>
	<li>Możliwość oddzielenia składników mieszaniny.</li>
	<li>Aby móc zidentyfikować wykryte komponenty.</li>
	<li>Zdolność do dostarczania półilościowych i potencjalnie ilościowych informacji na temat wykrytych składników.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Fiolki z autosamplerem 10 ml</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>Fiolki zakręcane 10 ml z</td></tr><tr><td>kapslem 18 mm</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magnetyczny z przegrodą PTFE/silikon</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna kapilarna</td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 &mikro; m</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Agilent-ChemStation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Chromatograf gazowy</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Przegroda wlotowa</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin mikrouszczelka</td></tr><tr><td>Masowy detektor selektywny</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do raportowania</td><td></td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td></tr> <tr><td>Biblioteka spektralna</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library</td></tr><tr><td>Program do przeszukiwania bibliotek spektralnych</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Splitless Wkładka wlotowa</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>Włókna SPME</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &micro; m Światłowód PDMS/DVB</td></tr></tbody></table>

pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, używając mikroekstrakcji fazy stałej w przestrzeni nad powierzchnią w połączeniu z chromatografią gazową i spektrometrią mas, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. Technika ta pozwala na półilościową analizę lotnych składników wydzielin zapachowych, umożliwiając separację i wstępną identyfikację składników w próbce, a następnie analizę stosunków powierzchni pików w celu znalezienia trendów, które mogą oznaczać związki, które mogą być zaangażowane w sygnalizację. Kluczowymi mocnymi stronami tego obecnego podejścia są zakres typów próbek, które można analizować; brak konieczności skomplikowanego przygotowywania próbek lub ekstrakcji; umiejętność oddzielania i analizowania składników mieszaniny; identyfikację wykrytych składników; oraz zdolność do dostarczania półilościowych i potencjalnie ilościowych informacji na temat wykrytych składników. Główne ograniczenie metodyki dotyczy samych próbek. Ze względu na to, że składniki o szczególnym znaczeniu są lotne i mogą one łatwo zostać utracone lub ich stężenie może ulec zmianie, ważne jest, aby próbki były odpowiednio przechowywane i transportowane po ich pobraniu. Oznacza to również, że warunki przechowywania i transportu próbek są stosunkowo kosztowne. Metodę tę można zastosować do różnych próbek (w tym moczu, kału, włosów i wydzielin gruczołów zapachowych). Zapachy te składają się ze złożonych mieszanin, występujących w różnych matrycach, a zatem wymagają stosowania technik oddzielania poszczególnych składników i ekstrakcji związków o znaczeniu biologicznym.

Postępując zgodnie z tym protokołem, wstępnie zidentyfikowano łącznie 32 lotne związki chemiczne na podstawie analizy 14 znaczeń zapachowych z okolic odbytu i narządów płciowych, które zostały spontanicznie naniesione na papier filtracyjny przez lemury czerwone (Varecia variegata rubra), a następnie porównano profile zapachowe z cechami osobników wysyłających sygnały12. W profilach tych obecne były naturalnie występujące związki lotne, takie jak węglowodory, terpeny, alkohole terpenowe i ...

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

Rola, jaką odgrywa zapach w komunikacji zwierząt, jest obecnie niedoceniana, a więc niedostatecznie zbadana. W szczególności bardzo niewiele wiadomo na temat zmian chemicznych leżących u podstaw sygnałów węchowych u zwierząt, w tym u ludzi. Wynika to również z wyzwań metodologicznych, rejestrowania i ilościowego określania związków chemicznych zapachów wykorzystywanych przez zwierzęta do komunikacji.Istnieje kilka potencjalnych wyzwań podczas pracy z wysoce złożonymi mieszaninami chemicznymi, w tym również podczas pobierania próbek i analizowania próbek zapachów. Przeprowadzamy analizę zapachów używanych przez zwierzęta, aby zrozumieć, w jaki sposób mogą być one przez nie wykorzystywane, gdy komunikują się między sobą. Połączyliśmy cytochemię z bioekologią, endokrynologią i cytologią, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką odgrywa zapach w komunikacji zwierząt.W naszej obecnej metodologii w Wolverhampton przyjęliśmy technikę mikrostruktury fazy stałej Headspace w połączeniu ze spektrometrią mas chromatografii gazowej, zbudowaną i nieznaną z metodologii stosowaną w przeszłości. Próbki zapachów są zbierane w jeden z następujących sposobów. Jeden, spontanicznie uwolnione zapachy próbek od przyzwyczajonych badanych.Na przykład naczelne w ogrodach zoologicznych zbierają wydzieliny zapachowe gruczołów zapachowych poprzez znakowanie zapachem na sterylnej bibule filtracyjnej lub próbkach moczu bezpośrednio do fiolek. Po drugie, po przeszkoleniu badanych za pomocą pozytywnego wzmocnienia zbieraj wydzieliny zapachowe, pocierając spojrzenie zapachowe sterylnymi wacikami. Po trzecie, po sedacji badanych osób pobiera wydzieliny zapachowe, pocierając gruczoły zapachowe sterylnymi wacikami bawełnianymi, pobierając próbki do sterylnych 10-mililitrowych fiolek z przezroczystego szkła z zakrętką i zaklejając nakrętkami zawierającymi sektor silikonowy P T F E.Fiolki należy natychmiast przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że podczas pobierania próbek należy używać czystych środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe. Często zmieniaj rękawice, unikaj bezpośredniego kontaktu skóry z próbkami i fiolkami.Zaleca się używanie fabrycznie nowych fiolek. Jednak w przypadku zużytych fiolek konieczne jest ich wstępne oczyszczenie, a następnie zastosowanie tego samego protokołu. Bierz puste miejsca środowiskowe za każdym razem, gdy zbierane są ślady zapachowe.W tym celu należy wystawić nieużywaną bibułę filtracyjną lub bawełniany wacik i fiolki na działanie środowiska podczas pobierania próbek. Próbki są przygotowywane w terenie. Aby uzyskać bibułę filtracyjną oznaczoną zapachem, wytnij około 10 milimetrów kwadratowych z papieru i umieść w 10-mililitrowej fiolce z miejscem na głowę ze śrubą.W przypadku wacika odetnij główkę wacika na samym końcu trzonu wacika i umieść w fiolce z przestrzenią na głowę. Po przygotowaniu każdej próbki należy wyrzucić lub wyczyścić ostrze do cięcia pożywki do pobierania próbek odpowiednią chusteczką antybakteryjną i/lub alkoholem i dokładnie wysuszyć. Przechowuj wszystkie próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Należy pamiętać, że próbki należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jednak w magazynie polowym w najniższej możliwej temperaturze i jak najszybciej przenieść do minus 20 stopni Celsjusza. Przed analizą należy wyjąć próbki z zamrażarki i pozostawić do naturalnej temperatury pokojowej przez co najmniej godzinę. Skonfiguruj metody analityczne w GCMS w następujący sposób dla warunków analizy SPMS, postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, aby kondycjonować włókna SBME przed pierwszym użyciem.Bardzo ważne jest, aby zespół SBME był prawidłowo zainstalowany w próbniku automatycznym i aby był wyrównany z tacami automatycznego próbnika, jednostką kondycjonowania światłowodu i portem wlotowym GC. Nieprawidłowe wyrównanie może spowodować uszkodzenie lub zniszczenie włókna Sbme. Upewnij się, że dopływ gazu z okonia do jednostki kondycjonowania światłowodu jest włączony.Aby poprawić spójność czasu przechowywania próbki, metoda analityczna polega na zablokowaniu czasu retencji, dodaniu fiolek z próbką do tacki automatycznego próbnika, umieszczeniu pustej fiolki z miejscem na głowę, aby działała jako ślepa próba systemowa w pierwszej pozycji tacy automatycznego próbnika. Umieść ślepą próbę środowiskową w drugiej pozycji, a następnie umieść wszystkie pozostałe próbki do analizy w kolejnych pozycjach tacy automatycznego próbnika. Utwórz sekwencję analityczną, aby przeanalizować każdą próbkę w zasobniku na próbki.Na ekranie głównym masowego łowcy wybierz sekwencję dla paska menu, a następnie załaduj sekwencję z menu rozwijanego. Zostanie wyświetlona pusta tabela sekwencji, uzupełnij tabelę sekwencji dla wszystkich ślepych prób i próbek, wstawiając odpowiednie informacje zapisane jako ukończone tabele sekwencji. Należy pamiętać, że dokładne informacje dotyczące tabeli sekwencji będą zależeć od formatowania tabeli przez laboratoria.Minimalne informacje zwykle obejmują typ próbki, nazwę próbki, lokalizację i numer pliku, metodę analityczną i lokalizację pliku danych oraz alokację nazwy pliku danych, która jest zgodna z nazwą próbki przedawnionej w przyszłości przetwarzania danych. Podczas analizy do sekwencji można dodać dodatkowe próbki. Uruchom sekwencję, wybierając sekwencję z paska menu, a następnie uruchom sekwencję.Po analizie próbki zostały jak najszybciej zwrócone do zamrażarki. Należy pamiętać, że możliwa jest ponowna analiza próbek. Należy jednak zauważyć, że niektóre lotne składniki mogły zostać całkowicie wyekstrahowane podczas wstępnej analizy, a niektóre związki mogły ulec rozkładowi termicznemu i bakteryjnemu w temperaturze 40 stopni Celsjusza.W związku z tym wynik na chromatogramie może nie być w pełni reprezentatywny dla oryginalnego oznakowania zapachowego. Wstępna analiza danych obejmuje integrację chromatogramów w celu uzyskania danych o czasie retencji i obszarze pików wraz ze wstępną identyfikacją pików za pomocą oprogramowania cam station i zagnieżdżonych baz danych widm masowych. Analiza danych może być przeprowadzana ręcznie lub metodą półautomatyczną.Jeśli stosowana jest metoda półautomatyczna, czasami korzystne jest przeprowadzenie pewnej ręcznej analizy danych w celu zweryfikowania wstępnych identyfikacji. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz plik danych, klikając odpowiedni plik na pasku nawigacyjnym po lewej stronie. Chromatogram jonów całkowitych TIC zostanie wyświetlony w górnym oknie ekranu analizy danych.Aby zintegrować TIC za pomocą integratora RTE, najpierw wybierz chromatogram z paska menu, a następnie wybierz integrator z menu rozwijanego, otworzy się wyskakujące okienko i wybierz integrator RTE. Wróć do menu chromatogramu i teraz wybierz integrację. Aby dostosować parametry całkowania tak, aby całkowane były piki lub szum linii bazowej większy niż trzykrotnie, ponownie wybierz chromatogram z paska menu, a następnie Parametry integracji MS Signal z menu rozwijanego.W wyskakującym okienku dostosuj minimalny obszar piku zgodnie z potrzebami, 1.0 daje akceptowalne wyniki w naszych przykładach. Aby zidentyfikować szczyty i wygenerować raport podsumowujący, wybierz eksport raportów z paska menu, a następnie raport wyników wyszukiwania w bibliotece do XLS. Należy pamiętać, że biblioteki spektralne, które mają być przeszukiwane, wraz z liczbą dopasowań bibliotek do wyświetlenia, muszą być wstępnie ustawione w oprogramowaniu, zanim będzie można rozpocząć przeszukiwanie biblioteki.Wynikowy raport arkusza kalkulacyjnego zawiera dane integracji dla każdego piku oraz wstępne dopasowanie biblioteki spektralnej w celu przypisania tożsamości. Zazwyczaj jakość biblioteki lub dopasowanie biblioteki powinno być większe niż 80, aby zaakceptować wstępną identyfikację. Zapisz arkusz kalkulacyjny.Aby zidentyfikować pik bezpośrednio na podstawie TIC, wybierz pik, który Cię interesuje. Jeśli szczyt jest mały, powiększ obraz, rysując ramkę wokół szczytu, przytrzymując lewy przycisk myszy, rozciągnij ramkę nad szczytem i zwolnij przycisk myszy. Umieść linię kursora tak, aby znajdowała się w najwyższym punkcie szczytu lub tuż za nim.Kliknij dwukrotnie, prawy przycisk myszy, a widmo masowe dla piku pojawi się w dolnym oknie ekranu analizy danych. Aby przeszukać bibliotekę spektralną, przesuń kursor w dowolne miejsce w oknie widma i kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy, a wyniki wyszukiwania w bibliotece pojawią się w nowym oknie. Aby usunąć szum tła z interesującego spektrum, najpierw kliknij dwukrotnie prawym przyciskiem myszy na danym piku, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w obszarze bez pików bezpośrednio przed szczytem zainteresowania, kliknij przycisk odejmij na wstążce menu lub wybierz chromatogram dla paska menu, a następnie odejmij widma z menu rozwijanego.Odjęte widmo zostanie wyświetlone w dolnym oknie ekranu analizy danych i wyświetli myślnik obok zeskanowanych danych w nagłówku okna. Postępując zgodnie z tym protokołem, wstępnie zidentyfikowaliśmy w sumie 32 lotne związki chemiczne na podstawie analizy 14 śladów zapachowych narządów płciowych spontanicznie uwalnianych na bibule filtracyjnej przez lemury czerwone, i porównaliśmy profile zapachowe z cechami sygnalizatora naturalnie występujące związki lotne, takie jak węglowodory, terpeny, alkohole Turpina i ketony, które były obecne w tych profilach i obejmują związki, które wcześniej stwierdzono, że działają jako hormony płciowe i sygnały do sprawności u innych gatunków zwierząt. Związki, które zostały wstępnie zidentyfikowane, wymieniono w tabeli pierwszej.Reprezentatywne chromatogramy, jeden ze znaku kontrolnego i jeden ze znaku zapachowego z Limy, są pokazane na rysunku pierwszym. Liczba i względna obfitość składników różniła się w zależności od próby u różnych badanych. Jednak sześć związków oznaczonych od A do F na chromatogramie było obecnych we wszystkich próbkach.Związki te były odpowiednio wygięte na wysokość do wyspy E: jeden, sześciokątny, parakryształ, sześć paramentów, dwa, osiem barwników, jeden, dwa, pinen, cztery i pentodekanu. Wyniki tego badania sugerują, że lemury czerwono-kryzowe używają znakowania wysyłanego do przekazywania informacji o płci i wieku kobiet, przy czym brak znakowania narządów płciowych odgrywa rolę w komunikacji społeczno-seksualnej. Innym reprezentatywnym wynikiem po zastosowaniu tego protokołu było nasze badanie reklamy płodności przez samice pawianów oliwkowych.Zidentyfikowaliśmy łącznie 74 lotne związki na podstawie analizy 395 próbek zapachu pochwy samic pawiana. Obejmowały one szereg naturalnie występujących lotnych związków zapachowych, takich jak ketony, alkohole, aldehydy, terpeny, lotne kwasy tłuszczowe i węglowodory. Typowe chromatogramy używane do porównywania pustych próbek zapachu pochwy trolla i samicy pawiana z okresów płodnych i niepłodnych przedstawiono na rysunku drugim.Badamy zależności między profilami zapachowymi pochwy a otwartością seksualną samic pawianów. Nasze wyniki wykazały, że całkowita ilość zapachu pochwy różni się w zależności od płodności, co sugeruje, że zapach może odgrywać rolę w sygnalizowaniu płodności samicy pawiana. Stwierdziliśmy również różnice w zapachu pochwy między typami grup, ale nie byliśmy w stanie rozróżnić wpływu składu grupy, nierównomierności wieku kobiet.Jest to połączenie zalet pobierania próbek i stosowania GCMS. Tak więc mikroekstrakcja do fazy stałej w przestrzeni nad głową umożliwia analizę szerokiego zakresu różnych próbek za pomocą GCMS. Jesteśmy w stanie oddzielić elementy tych złożonych oznaczeń, a następnie zidentyfikować każdy z tych pojedynczych elementów za pomocą spektrometru mas.Cała połączona technika jest bardzo potężna i daje nam wiele informacji na temat tych oznaczeń zapachowych, które w przeszłości wymagałyby dużej ekstrakcji przygotowania próbki, aby móc uzyskać wyniki.

sampling-and-analysis-of-animal-scent-signals

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W niniejszym artykule wideo opisujemy nową metodę umożliwiającą tworzenie gradientów substancji zapachowych o stabilnych i kontrolowalnych geometriach. Krótko ilustrujemy, w jaki sposób gradienty te mogą być wykorzystane do wykrywania wad węchu (całkowitej i częściowej anosmii) oraz do badania bardziej subtelnych cech zachowań chemotaktycznych.

Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Fundamentalne, a zarazem unikalne właściwości układu węchowego gryzoni sprawiły, że staje się on coraz częściej przedmiotem badań biologów. Istnieje zatem potrzeba opracowania stosunkowo prostego sposobu oceny jego funkcji. W niniejszej pracy opisujemy czułe testy służące do charakterystyki wrażliwości i preferencji węchowych myszy.

Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Podejście oparte na porównaniu gatunków pozwala neurobiologom behawioralnym badać różne czynniki neurobiologiczne związane z określonymi zachowaniami, uznawanymi za charakterystyczne dla danego modelu zwierzęcego. Wykorzystując naturalnie występujące różnice w zachowaniu między blisko spokrewnionymi gatunkami, technika ta nie wymaga stosowania inwazyjnych metod w celu manipulacji ekspresją danego zachowania.

Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Opisujemy protokół używania anten owadów w postaci elektroantennogramów (EAG) na autonomicznych robotach. Nasza eksperymentalna konstrukcja pozwala na stabilne nagrania w ciągu jednego dnia i rozwiązuje indywidualne plamy zapachowe do 10 Hz. Skuteczność czujników EAG w poszukiwaniu węchu jest wykazywana poprzez kierowanie robota w kierunku źródła zapachu.

Wykorzystanie czujników elektroantennogramu owadów w autonomicznych robotach do wyszukiwania węchowego

Myszy wytwarzają złożony, wielosylabowy repertuar wokalizacji ultradźwiękowych (USV). Te USV są szeroko stosowane jako odczyty zaburzeń neuropsychiatrycznych. Protokół ten opisuje niektóre z praktyk, których nauczyliśmy się i opracowaliśmy, aby konsekwentnie indukować, zbierać i analizować cechy akustyczne i składnię piosenek myszy.

Wywoływanie i analizowanie piosenek z wokalizacji ultradźwiękowej (USV) samców myszy

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

System Kontrolowanego Przenikania Zapachu to prosta, przenośna, tania metoda dostarczania zapachu do testów węchowych i treningu. Jest zbudowany z nawaniacza zatrzymanego na materiale adsorpcyjnym i umieszczonego w przepuszczalnym worku polimerowym, umożliwiającym kontrolowane uwalnianie oparów nawaniacza w czasie.

Systemy kontrolowanego przenikania naśladującego zapach do treningu węchowego i testów terenowych

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj metody pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych zwierząt za pomocą technik mikroekstrakcji i chromatografii gazowej. To podejście pozwala badaczom zidentyfikować lotne związki chemiczne kluczowe dla komunikacji międzygatunkowej.

Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów