Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq
16 maja 2020
Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.
W niniejszym protokole opisujemy procedurę składającą się z dwóch części. Po pierwsze, jednowarstwowa metoda różnicowania keratynocytów 2D in vitro poprzez inhibicję kontaktową. Po drugie, jego charakterystyka molekularna za pomocą sekwencji RNA.
Metoda różnicowania 2D in vitro jest prosta i łatwa do wykonania. Może być stosowany do badania różnicowania naskórka, zwłaszcza gdy niezbędna jest duża liczba komórek. Na przykład w analizie epigenomicznej.
Szczegółowy potok analizy sekwencyjnej RNA jest jasny i przejrzysty dla badaczy posiadających podstawowe umiejętności bioinformatyczne i może być używany do dowolnej masowej analizy sekwencyjnej RNA. Wykonując protokół różnicowania po raz pierwszy, należy pamiętać, że gęstość wysiewu może być trudna. Wypróbuj wiele gęstości wysiewu, aby dowiedzieć się, która z nich najlepiej pasuje do Twojej linii komórkowej.
Zacznij od przygotowania pożywki wzrostowej keratynocytów lub KGM i po 500 mililitrów pożywki proliferacyjnej i pożywki różnicującej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Wysiewaj pierwotne keratynocyty o gęstości od 5 do 20 000 komórek na centymetr kwadratowy i dodaj wystarczającą ilość pożywki proliferacyjnej, aby pokryć komórki. Dwa dni po wysianiu odświeżyć komórki pożywką proliferacyjną.
Regularnie sprawdzaj komórki pod mikroskopem i odświeżaj pożywkę co drugi dzień. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, wywołaj różnicowanie, zmieniając pożywkę na pożywkę różnicującą. Aby zebrać komórki do dalszych analiz RNA, należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS, a następnie dodać bufor do lizy.
Zbierz komórki w dniach różnicowania zero, dwa, cztery i siedem. Po izolacji RNA dwuniciowe cDNA zostanie przekształcone, a biblioteki sekwencyjne RNA zostaną przygotowane do sekwencjonowania nowej generacji. Po sekwencjonowaniu odczyty sekwencji zostaną pobrane i zmapowane do ludzkiego genomu.
Po pobraniu i zainstalowaniu pakietów języka R wygeneruj tabelę kont z plików karty readspergene.out. i zapisz przykładowy plik danych zawierający wszystkie nazwy plików, dzień rozróżnienia i inne istotne przykładowe dane. Zapoznaj się z dodatkowymi plikami kodowania, aby zapoznać się z przykładem.
Następnie użyj tabeli zliczania i przykładowych danych, aby wygenerować obiekt deseq2 zawierający zarówno dane zliczalne, jak i przykładowe. W celu normalizacji ekspresji genów znormalizuj tabelę zliczania w obiekcie deseq2 przy użyciu normalizacji deseq2RLD lub VST. Chociaż normalizacja RLD jest preferowana, normalizacja VST jest znacznie szybsza.
Użyj funkcji dist w języku R, aby wykreślić odległość próbki na podstawie znormalizowanej intensywności zliczania odczytów, a następnie wykonaj grupowanie hclust na podstawie odległości próbki. Następnie narysuj mapę cieplną za pomocą funkcji pheatmap. Na koniec wygeneruj analizę składowych głównych lub wykres PCA znormalizowanej intensywności liczby odczytów przy użyciu funkcji plotPCA deseq2.
PCA służy jako narzędzie do eksploracyjnej analizy danych i może być używane do wizualizacji odległości i powiązań między różnymi próbkami. Wykonaj wysoce zmienną analizę ekspresji genów za pomocą funkcji rowVars, która wyodrębnia 500 najbardziej zmiennych genów, porządkując wariancję między próbkami z różnych punktów czasowych. Geny te mają najwyższe odchylenie standardowe ich znormalizowanej intensywności w ciągu dni różnicowania.
Wykonaj grupowanie k-średnich na wysoce zmiennych genach, aby zgrupować je według różnych wzorców ekspresji. Wizualizuj geny na mapie cieplnej za pomocą pakietu pheatmap. Intensywność wykreślona na mapie cieplnej to znormalizowana intensywność deseq2 z odjętą wartością mediany.
Wygeneruj listę ekspresji genów tła, która obejmuje wszystkie geny z więcej niż 10 liczbami w jednej próbce i sporządź listę z genami z każdej grupy. Na koniec przeprowadź analizę ontologii genów za pomocą GOrilla. Użyj listy genów tła jako zestawu tła i listy wysoce zmiennych genów w klastrach jako zestawu docelowego, a następnie kliknij na wyszukiwanie wzbogaconych terminów GO.
Alternatywnie bardziej zaawansowani użytkownicy języka R mogą użyć pakietu clusterProfiler do zautomatyzowania analizy wzbogacania terminów języka Go. Linie keratynocytów pochodzące od pięciu osób wykorzystano do różnicowania w analizach sekwencyjnych RNA. Analiza głównych składowych wykazała, że keratynocyty ulegające różnicowaniu miały połączone, ale odrębne ogólne profile ekspresji genów.
Wysoce zmienne geny pogrupowano w celu zobrazowania dynamiki i wzorców ekspresji genów podczas różnicowania. Każdy klaster genów był reprezentowany przez geny charakterystyczne dla różnicowania keratynocytów, a adnotacja Gene Ontology wykazała wyraźną różnicę w funkcjach genów. W drugim eksperymencie porównano morfologię komórek i różnice w ekspresji genów między keratynocytami ze zdrowych grup kontrolnych a liniami komórkowymi pochodzącymi od pacjentów z mutacjami P63.
Analiza głównych składowych wykazała, że linie komórek kontrolnych wyraźnie podążały za wzorcem różnicowania, ale wzorzec ekspresji genów w zmutowanych komórkach podczas różnicowania pozostaje w dużej mierze podobny do wzorca komórek proliferujących lub niezróżnicowanych. W analizie grupowania geny w klastrze pierwszym były regulowane w dół w komórkach kontrolnych i częściowo w dół w komórkach pacjentów z mutacjami R204W i R279H, ale pozostały wysokie w komórkach przenoszących R304W. Geny te prawdopodobnie odgrywają rolę w proliferacji komórek, jak wykazano w analizie Gene Ontology.
Geny klastra drugiego zostały najpierw wprowadzone, a następnie obniżone w komórkach kontrolnych. Geny te są prawdopodobnie zaangażowane w różnicowanie keratynocytów, ponieważ funkcje różnicowania i keratynizacji naskórka były znacznie wzbogacone w tym klastrze. Geny w klastrze trzecim zostały indukowane dopiero pod koniec różnicowania w komórkach kontrolnych, co wskazuje, że mogą odgrywać rolę w najbardziej zewnętrznej warstwie naskórka.
Analizując dane sekwencyjne RNA, ważne jest, aby wiedzieć wcześniej, czego się spodziewać. Pomoże Ci to zarówno w interpretacji wykresu kontroli jakości i PCA, jak i w ocenie, czy Twoje wyniki mają sens. Nasze metody mogą być wykorzystywane do badania transkrypcji genów zarówno w biologii naskórka, jak i w innych układach biologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia stopniową procedurę in vitro różnicowania ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktowe, w połączeniu z charakteryzacją molekularną przy użyciu analizy RNA-seq.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Genomika
Tło
- Keratynocyty są niezbędne dla różnicowania naskórka.
- Rozumienie ich różnicowania jest kluczowe dla biologii skóry.
- RNA-seq zapewnia wgląd w profile ekspresji genów.
- Hamowanie kontaktowe jest kluczowym mechanizmem w różnicowaniu komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody różnicowania keratynocytów in vitro.
- Charakteryzacja zmian molekularnych podczas różnicowania.
- Fazowanie badań w biologii naskórka i powiązanych dziedzinach.
Zastosowane metody
- In vitro hodowla ludzkich pierwotnych keratynocytów.
- Indukcja różnicowania poprzez hamowanie kontaktowe.
- Analiza RNA-seq dla charakteryzacji molekularnej.
- Ocena zmian ekspresji genów podczas różnicowania.
Główne wyniki
- Udało się osiągnąć udane różnicowanie keratynocytów.
- Wyróżniono wyraźne profile ekspresji genów za pomocą RNA-seq.
- Hamowanie kontaktowe skutecznie indukowało różnicowanie.
- Metoda nadaje się do badań na dużą skalę.
Wnioski
- Protokół zapewnia prosty podejście do różnicowania keratynocytów.
- Analiza RNA-seq ujawnia ważne molekularne wnioski.
- Ta metoda może poszerzyć badania w dziedzinie biologii skóry i epigenetyki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust in vitro differentiation and RNA-seq profiling of human primary keratinocytes provide a scalable platform for dissecting epidermal biology and disease mechanisms. This workflow enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, supporting translational continuity for dermatological and epithelial research portfolios. The approach facilitates quantitative, reproducible molecular characterization essential for early-stage decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of differentiation pathways and gene regulatory networks in human keratinocytes.
- Supports functional target validation by linking gene expression dynamics to phenotypic outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets implicated in epidermal disorders.
- Provides a quantitative framework for portfolio triage based on molecular signatures.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible 2D keratinocyte differentiation systems for downstream assays.
- Delivers standardized RNA-seq outputs for benchmarking compound or genetic perturbation effects.
- Enables high-throughput readiness for screening gene expression modulators in disease-relevant contexts.
- Supports platform reuse across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro gene expression patterns with in vivo epidermal stratification for translational relevance.
- Enables comparative analysis of healthy versus disease-mutant keratinocytes for biomarker discovery.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with validated differentiation phenotypes.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene expression analysis and functional validation in human keratinocytes.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification through quantitative transcriptomic profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs such as PCA, clustering, and GO enrichment to compare differentiation states and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant biology by modeling patient-derived mutations and phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable workflow adaptable to diverse keratinocyte lines and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes differentiation and RNA-seq analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early molecular de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatology and epithelial biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA-seq library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to next-generation sequencing platforms and computational infrastructure for data processing.
- Demands cross-team standardization of seeding density, differentiation timing, and data normalization.
- Adaptable to various keratinocyte lines and patient-derived models with protocol optimization.
- Dependent on robust quality control and statistical analysis to ensure data interpretability.
