Name: Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich keratynocytów pierwotnych in vitro poprzez inhibicję kontaktową z analizą RNA-seq. Protokół umożliwia badanie biologii skóry i analizy epigenomiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Stypendium Uniwersytetu Radboud (H.Z.); oraz Chińska Rada Stypendialna 201406330059 (J.Q.).

<ol><li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin%3A+from+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li>
<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
<li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li>
<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li>
<li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1%2FK10+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li>
<li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li>
<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
<li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li>
<li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).</li>
<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019).</li>
<li>Doyle, K. aM. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+KaM+%22Protocols+and+applications+guide%22">Protocols and applications guide</a>. , Promega Corporation. Madison. (1996).</li>
<li>Roche. Hyperprep Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019).</li>
<li>Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOrilla%3A+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li>
<li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+whole+transcript+and+3%27+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019).</li>
<li>Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano metodę indukowania różnicowania ludzkich keratynocytów i późniejszej charakterystyki za pomocą analiz sekwencyjnych RNA. W obecnym piśmiennictwie wiele badań nad różnicowaniem ludzkich keratynocytów wykorzystuje dwie inne metody, z wysokim stężeniem wapnia lub z surowicą jako metody indukowania różnicowania 2,3,23. W poprzednim raporcie dokładnie porównano te trzy różne metody3 i wykazano,...

Ludzkie pierwotne keratynocyty pochodzące z ludzkiej skóry są często używane jako model komórkowy do badania biologii naskórka1,2,3,4. Stratyfikacja naskórka może być modelowana przez różnicowanie keratynocytów, zarówno w zanurzonym monowarstwowym modelu 2D, jak i w modelu organotypowym 3D z podnośnikiem powietrznym2,3,5,6,7. Chociaż modele 3D stają się coraz ważniejsze do oceny struktury i funkcji naskórka, modele różnicowania 2D są nadal szeroko stosowane, ze względu na ich wygodę i możliwość generowania dużej liczby komórek do analiz.
Zastosowano różne warunki do indukowania różnicowania keratynocytów w 2D, w tym dodanie surowicy, wysokie stężenie wapnia, niższą temperaturę i hamowanie receptorów naskórkowego czynnika wzrostu2,3. Każda z tych metod została zwalidowana przez szereg genów markera różnicowania keratynocytów i okazała się skuteczna w ocenie różnicowania keratynocytów, w tym w warunkach patologicznych. Jednak te warunki indukcji wykazują również różnice w ich efektywności różnicowania i kinetyce, gdy badane są określone panele genów markerowych2,3.
Jedna z tych metod polega na hamowaniu kontaktu keratynocytów i wyniszczaniu czynników wzrostu w pożywce hodowlanej8. Wykazano, że keratynocyty mogą różnicować się spontanicznie, gdy komórki osiągną pełną gęstość. Wykluczenie czynników wzrostu z pożywki hodowlanej może jeszcze bardziej zwiększyć różnicowanie. Wykazano, że metoda łącząca hamowanie kontaktowe i zubożające czynniki wzrostu generuje zróżnicowane keratynocyty z wzorcami ekspresji genów podobnymi do normalnego warstwowego naskórka przy użyciu kilku markerów naskórka3, co sugeruje, że model ten jest odpowiedni do badania prawidłowego różnicowania keratynocytów. Ostatnio opisano dwie kompleksowe analizy ekspresji genów różnicowania keratynocytów przy użyciu tego modelu9,10. Naukowcy zweryfikowali ten model na poziomie molekularnym i wykazali, że można go wykorzystać do badania prawidłowego i chorego różnicowania keratynocytów.
Ten protokół opisuje procedurę metody różnicowania in vitro i analizy molekularnej zróżnicowanych komórek za pomocą sekwencji RNA. Ilustruje również charakterystykę transkryptomu komórek w dniu różnicowania 0 (etap proliferacji), dniu 2, dniu 4 i dniu 7 (odpowiednio wczesne, środkowe i późne różnicowanie). Wykazano, że zróżnicowane keratynocyty wykazują wzorce ekspresji genów, które w dużej mierze przypominają komórki podczas stratyfikacji naskórka. Aby sprawdzić, czy ta metoda może być wykorzystana do badania patologii skóry, zastosowaliśmy ten sam potok eksperymentalny i analityczny do zbadania keratynocytów przenoszących mutacje czynnika transkrypcyjnego p63, które pochodzą od pacjentów z ektrodaktylią, dysplazją ektodermalną i zespołem rozszczepu wargi/podniebienia (EEC) 11,12. Protokół ten koncentruje się na różnicowaniu keratynocytów in vitro, a także na późniejszej analizie bioinformatycznej sekwencjonowania RNA. Inne etapy całej procedury, takie jak ekstrakcja RNA, przygotowanie próbki sekwencyjnej RNA i budowa biblioteki, są dobrze udokumentowane i można je łatwo wykonać, zwłaszcza w przypadku korzystania z wielu powszechnie używanych zestawów komercyjnych. W związku z tym kroki te są tylko pokrótce opisane w protokole. Dane pokazują, że ta linia produkcyjna nadaje się do badania zdarzeń molekularnych podczas różnicowania naskórka u zdrowych i chorych keratynocytów.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Część zestawu bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 System czasu rzeczywistego</td><td>Maszyna Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Część bulletKit</td></tr><tr><td>Etanoloamina >= 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Chipy DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Lonza</td><td></td><td>Część zestawu bulletKit</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td></td><td>Część zestawu bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Synteza cDNA iScript</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ilościowy biblioteki KAPA</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Zestaw do pomiaru niskiego stężenia</td></tr><tr><td>Zestaw KAPA RNA HyperPrep z RiboErase</td> Zestaw <td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratynocyte Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (model)</td><td>Nanodrop i Qbit do pomiarów DNA i RNA</td></tr><tr><td>Kody kreskowe DNA NEXTflex -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp długie startery</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy rna-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Ludzkie pierwotne keratynocyty są często używane jako modele in vitro do badań nad różnicowaniem naskórka i chorobami pokrewnymi. Opisano metody różnicowania in vitro keratynocytów hodowanych w dwuwymiarowym (2D) zanurzeniu w różnych warunkach indukcji. Opisano tutaj procedurę metody różnicowania keratynocytów 2D in vitro poprzez inhibicję kontaktową, a następnie charakterystykę molekularną za pomocą sekwencji RNA. Krótko mówiąc, keratynocyty są hodowane w określonym pożywce keratynocytowej uzupełnionej czynnikami wzrostu, aż do pełnego zlewania się. Różnicowanie jest indukowane przez bliskie kontakty między keratynocytami i dodatkowo stymulowane przez wykluczenie czynników wzrostu w pożywce. Za pomocą analiz sekwencyjnych RNA wykazano, że zarówno 1) zróżnicowane keratynocyty wykazują wyraźne sygnatury molekularne podczas różnicowania, jak i 2) dynamiczny wzorzec ekspresji genów w dużej mierze przypomina komórki podczas stratyfikacji naskórka. Jeśli chodzi o porównanie z normalnym różnicowaniem keratynocytów, keratynocyty przenoszące mutacje czynnika transkrypcyjnego p63 wykazują zmienioną morfologię i sygnatury molekularne, zgodne z ich defektami różnicowania. Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje etapy różnicowania keratynocytów 2D in vitro i jego charakterystykę molekularną, z naciskiem na bioinformatyczną analizę danych sekwencyjnych RNA. Ponieważ procedury ekstrakcji RNA i sekwencjonowania RNA zostały dobrze udokumentowane, nie jest to przedmiotem tego protokołu. Eksperymentalna procedura różnicowania keratynocytów in vitro i analiza bioinformatyczna mogą być wykorzystane do badania zdarzeń molekularnych podczas różnicowania naskórka u zdrowych i chorych keratynocytów.

Normalna różnicowanie keratynocytów i analiza RNA-seq 
W tym eksperymencie do różnicowania i analiz RNA-seq wykorzystano linie keratynocytów pochodzące od pięciu osób. Rysunek 1 podsumowuje procedurę eksperymentalną różnicowania oraz wyniki analizy RNA-seq. Przegląd procedur różnicowania in vitro normalnych keratynocytów oraz zmiany morfologii komórek podczas różnicowania przedstawiono na Rysunku 1A. Analiza głównych składowych (PCA) wykazała...

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

W niniejszym protokole opisujemy procedurę składającą się z dwóch części. Po pierwsze, jednowarstwowa metoda różnicowania keratynocytów 2D in vitro poprzez inhibicję kontaktową. Po drugie, jego charakterystyka molekularna za pomocą sekwencji RNA.Metoda różnicowania 2D in vitro jest prosta i łatwa do wykonania. Może być stosowany do badania różnicowania naskórka, zwłaszcza gdy niezbędna jest duża liczba komórek. Na przykład w analizie epigenomicznej.Szczegółowy potok analizy sekwencyjnej RNA jest jasny i przejrzysty dla badaczy posiadających podstawowe umiejętności bioinformatyczne i może być używany do dowolnej masowej analizy sekwencyjnej RNA. Wykonując protokół różnicowania po raz pierwszy, należy pamiętać, że gęstość wysiewu może być trudna. Wypróbuj wiele gęstości wysiewu, aby dowiedzieć się, która z nich najlepiej pasuje do Twojej linii komórkowej.Zacznij od przygotowania pożywki wzrostowej keratynocytów lub KGM i po 500 mililitrów pożywki proliferacyjnej i pożywki różnicującej zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Wysiewaj pierwotne keratynocyty o gęstości od 5 do 20 000 komórek na centymetr kwadratowy i dodaj wystarczającą ilość pożywki proliferacyjnej, aby pokryć komórki. Dwa dni po wysianiu odświeżyć komórki pożywką proliferacyjną.Regularnie sprawdzaj komórki pod mikroskopem i odświeżaj pożywkę co drugi dzień. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, wywołaj różnicowanie, zmieniając pożywkę na pożywkę różnicującą. Aby zebrać komórki do dalszych analiz RNA, należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS, a następnie dodać bufor do lizy.Zbierz komórki w dniach różnicowania zero, dwa, cztery i siedem. Po izolacji RNA dwuniciowe cDNA zostanie przekształcone, a biblioteki sekwencyjne RNA zostaną przygotowane do sekwencjonowania nowej generacji. Po sekwencjonowaniu odczyty sekwencji zostaną pobrane i zmapowane do ludzkiego genomu.Po pobraniu i zainstalowaniu pakietów języka R wygeneruj tabelę kont z plików karty readspergene.out. i zapisz przykładowy plik danych zawierający wszystkie nazwy plików, dzień rozróżnienia i inne istotne przykładowe dane. Zapoznaj się z dodatkowymi plikami kodowania, aby zapoznać się z przykładem.Następnie użyj tabeli zliczania i przykładowych danych, aby wygenerować obiekt deseq2 zawierający zarówno dane zliczalne, jak i przykładowe. W celu normalizacji ekspresji genów znormalizuj tabelę zliczania w obiekcie deseq2 przy użyciu normalizacji deseq2RLD lub VST. Chociaż normalizacja RLD jest preferowana, normalizacja VST jest znacznie szybsza.Użyj funkcji dist w języku R, aby wykreślić odległość próbki na podstawie znormalizowanej intensywności zliczania odczytów, a następnie wykonaj grupowanie hclust na podstawie odległości próbki. Następnie narysuj mapę cieplną za pomocą funkcji pheatmap. Na koniec wygeneruj analizę składowych głównych lub wykres PCA znormalizowanej intensywności liczby odczytów przy użyciu funkcji plotPCA deseq2.PCA służy jako narzędzie do eksploracyjnej analizy danych i może być używane do wizualizacji odległości i powiązań między różnymi próbkami. Wykonaj wysoce zmienną analizę ekspresji genów za pomocą funkcji rowVars, która wyodrębnia 500 najbardziej zmiennych genów, porządkując wariancję między próbkami z różnych punktów czasowych. Geny te mają najwyższe odchylenie standardowe ich znormalizowanej intensywności w ciągu dni różnicowania.Wykonaj grupowanie k-średnich na wysoce zmiennych genach, aby zgrupować je według różnych wzorców ekspresji. Wizualizuj geny na mapie cieplnej za pomocą pakietu pheatmap. Intensywność wykreślona na mapie cieplnej to znormalizowana intensywność deseq2 z odjętą wartością mediany.Wygeneruj listę ekspresji genów tła, która obejmuje wszystkie geny z więcej niż 10 liczbami w jednej próbce i sporządź listę z genami z każdej grupy. Na koniec przeprowadź analizę ontologii genów za pomocą GOrilla. Użyj listy genów tła jako zestawu tła i listy wysoce zmiennych genów w klastrach jako zestawu docelowego, a następnie kliknij na wyszukiwanie wzbogaconych terminów GO.Alternatywnie bardziej zaawansowani użytkownicy języka R mogą użyć pakietu clusterProfiler do zautomatyzowania analizy wzbogacania terminów języka Go. Linie keratynocytów pochodzące od pięciu osób wykorzystano do różnicowania w analizach sekwencyjnych RNA. Analiza głównych składowych wykazała, że keratynocyty ulegające różnicowaniu miały połączone, ale odrębne ogólne profile ekspresji genów.Wysoce zmienne geny pogrupowano w celu zobrazowania dynamiki i wzorców ekspresji genów podczas różnicowania. Każdy klaster genów był reprezentowany przez geny charakterystyczne dla różnicowania keratynocytów, a adnotacja Gene Ontology wykazała wyraźną różnicę w funkcjach genów. W drugim eksperymencie porównano morfologię komórek i różnice w ekspresji genów między keratynocytami ze zdrowych grup kontrolnych a liniami komórkowymi pochodzącymi od pacjentów z mutacjami P63.Analiza głównych składowych wykazała, że linie komórek kontrolnych wyraźnie podążały za wzorcem różnicowania, ale wzorzec ekspresji genów w zmutowanych komórkach podczas różnicowania pozostaje w dużej mierze podobny do wzorca komórek proliferujących lub niezróżnicowanych. W analizie grupowania geny w klastrze pierwszym były regulowane w dół w komórkach kontrolnych i częściowo w dół w komórkach pacjentów z mutacjami R204W i R279H, ale pozostały wysokie w komórkach przenoszących R304W. Geny te prawdopodobnie odgrywają rolę w proliferacji komórek, jak wykazano w analizie Gene Ontology.Geny klastra drugiego zostały najpierw wprowadzone, a następnie obniżone w komórkach kontrolnych. Geny te są prawdopodobnie zaangażowane w różnicowanie keratynocytów, ponieważ funkcje różnicowania i keratynizacji naskórka były znacznie wzbogacone w tym klastrze. Geny w klastrze trzecim zostały indukowane dopiero pod koniec różnicowania w komórkach kontrolnych, co wskazuje, że mogą odgrywać rolę w najbardziej zewnętrznej warstwie naskórka.Analizując dane sekwencyjne RNA, ważne jest, aby wiedzieć wcześniej, czego się spodziewać. Pomoże Ci to zarówno w interpretacji wykresu kontroli jakości i PCA, jak i w ocenie, czy Twoje wyniki mają sens. Nasze metody mogą być wykorzystywane do badania transkrypcji genów zarówno w biologii naskórka, jak i w innych układach biologicznych.

characterization-vitro-differentiation-human-primary-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Porównano profile mikroRNA (miRNA) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzącego z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS-RPE) oraz płodowego RPE.

Profile ekspresji mikroRNA ludzkich komórek iPS, nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPS oraz nabłonka barwnikowego siatkówki płodu

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Poznaj metodę różnicowania ludzkich keratynocytów pierwotnych in vitro poprzez inhibicję kontaktową z analizą RNA-seq. Protokół umożliwia badanie biologii skóry i analizy epigenomiczne.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Przeglądaj więcej filmów