Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu
11 marca 2020
Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.
Używamy sekwencjonowania genetycznego wirusów, aby spróbować zrozumieć, skąd pochodzą wirusy i jak się rozprzestrzeniają. Aby korzystać z tych danych w czasie rzeczywistym, na przykład podczas epidemii, musimy dokładnie zrozumieć, jak dokładne są dane, które dostarczamy. Głównymi zaletami tych technik jest to, że są stosunkowo tanie, szybkie i umożliwiają kodowanie podstawowe w czasie rzeczywistym, które można wykorzystać do sekwencjonowania w terenie.
Metoda ta może być wykorzystana do terminowego generowania danych sekwencyjnych, które można na przykład wykorzystać do określenia pochodzenia wielu patogenów. Ta technika może być skomplikowana dla początkujących użytkowników i wymagana jest podstawowa wiedza na temat systemu Unix. Zwłaszcza w przypadku instalacji różnych pakietów oprogramowania.
Wizualizacja tej metody pomoże użytkownikom określić poziom błędów ich konkretnych protokołów sekwencjonowania. I odpowiedzieć na pytania badawcze. Przebieg sekwencji jest uruchamiany na MinION podłączonym do MinIT.
Po utworzeniu sekwencji na platformie Nanopore załaduj załadowane dane do Porechop. Aby zapobiec zanieczyszczeniu i zwiększyć dokładność, użyj flagi wymagaj podkreślenia dwóch, podkreśl kody kreskowe i wprowadź polecenie zgodnie ze wskazaniami. Po demultipleksowaniu użyj cutadapt, aby usunąć sekwencje starterów i sekwencje o długości krótszej niż 75 nukleotydów, używając polecenia, jak wskazano.
Użyj Minimap2 do mapowania odczytów sekwencji demultipleksu na panel odrębnych szczepów referencyjnych za pomocą Minimap2. I użyj Samtools, aby wygenerować sekwencję konsensusu. W przypadku wyrównań opartych na odniesieniach konieczne jest przygotowanie wybuchu i wyszukiwanie za pomocą wygenerowanej sekwencji konsensusu w celu zidentyfikowania najbliższego szczepu referencyjnego.
Następnie powtórzyć wyrównanie oparte na odniesieniu z najbliższym odkształceniem odniesienia jako odniesieniem. Aby określić wymagane pokrycie odczytem w celu skompensowania profilu błędu w sekwencjonowaniu Nanopore, wybierz mapowanie sekwencji na jeden Amplicon i użyj Minimap2 do mapowania odczytów Nanopore względem tego Amplicon. Użyj Samtools, aby wybrać tylko mapowanie odczytów do Amplicon26 i przekonwertować plik bam na fastq za pomocą poleceń, jak wskazano.
Losowo wybierz podzbiory, na przykład 200 sekwencji odczytanych tysiąc razy. Wszystkie losowo wybrane odczyty sekwencji są wyrównywane do Amplicon26. Użyj KMA do mapowania odczytów sekwencji i natychmiastowego wygenerowania sekwencji konsensusu przy użyciu zoptymalizowanych ustawień sekwencjonowania Nanopore, jak wskazuje flaga BC nano.
Aby sprawdzić wygenerowane sekwencje konsensusu, użyj poleceń, jak wskazano. Aby wyświetlić wskaźnik błędów w stats dot txt pod nagłówkiem, niezgodności współzależności błędów podstawy zmapowane, użyj polecenia, jak wskazano. Aby wyświetlić liczbę indeli wyświetlanych pod nagłówkiem indels na cykl, użyj polecenia, jak wskazano.
Korzystając z nowszej komórki przepływowej w połączeniu z przerzutnikiem koloru podstawowego, 40-krotne pokrycie odczytem daje identyczne wyniki w porównaniu z sekwencjonowaniem Illumina. Pokrycie odczytem 30 razy daje poziom błędu 0,02%, co odpowiada jednemu błędowi na każde 585 000 sekwencjonowanych nukleotydów. Podczas gdy pokrycie odczytem 20 razy powoduje jeden błąd na każde 63 529 sekwencjonowanych nukleotydów.
Pokrycie odczytem 10 razy powoduje jeden błąd na każde 3 312 sekwencjonowanych nukleotydów. Oznacza to, że ponad 3 nukleotydy na cztery genomy wirusa Usutu są nazywane niewłaściwymi. Przy odczycie powyżej 30-krotnego pokrycia nie obserwuje się żadnych indeli.
Pokrycie odczytem 20 razy powoduje wykrycie jednej pozycji indel, podczas gdy pokrycie odczytem 10 razy skutkuje indelami w 29 pozycjach. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że chociaż nie zawsze są one widoczne, aktualizacje oprogramowania występują często i mogą mieć wpływ na wyniki. Istnieje kilka opcji oprogramowania, z którego można korzystać.
Pokazaliśmy najczęściej używane programy. Jednak różne programy i różne wersje tych programów mogą prowadzić do różnych wyników. Pokazaliśmy przykład, w jaki sposób sprawdzamy jakość generowanych przez nas danych sekwencji.
A to ma kluczowe znaczenie dla niezawodnego wsparcia w przypadku wybuchu epidemii.
Przegląd
Niniejsze badanie szczegółowo opisuje zwalidowany protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonach z wykorzystaniem platformy sekwencjonowania nanoporowego. Metody zostały opisane szczegółowo, ze szczególnym uwzględnieniem określenia współczynnika błędów powiązanych z komórką przepływową nanoporową R10.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Genomika
- Technologia sekwencjonowania
Wprowadzenie
- Zrozumienie pochodzenia i rozprzestrzeniania się wirusów za pomocą sekwencjonowania genetycznego.
- Znaczenie dokładności danych podczas epidemii.
- Zalety sekwencjonowania nanoporowego: opłacalność i szybkość.
- Trudności dla nowych użytkowników wymagające podstawowej znajomości systemu Unix.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowej metodologii sekwencjonowania USUV.
- Ocena wskaźników błędów w sekwencjonowaniu nanoporowym.
- Zwiększenie dokładności protokołów sekwencjonowania.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie MinION i MinIT do sekwencjonowania.
- Przetwarzanie danych za pomocą Porechop i cutadapt w celu usunięcia starterów.
- Mapowanie sekwencji za pomocą Minimap2 i generowanie sekwencji konsensusowych przy użyciu Samtools.
- Ocena wskaźników błędów i pozycji indeli w zależności od różnego poziomu pokrycia odczytów.
Główne wyniki
- Pokrycie odczytów na poziomie 30x daje stopień błędu wynoszący 0,02%.
- Przy wyższym pokryciu (powyżej 30x) nie stwierdzono obecności indeli.
- Niższe pokrycie skutkuje zwiększoną liczbą błędów i indeli.
- Aktualizacje oprogramowania mogą mieć znaczący wpływ na wyniki sekwencjonowania.
Wnioski
- Sekwencjonowanie nanoporowe jest skuteczną metodą wspierania działań w czasie rzeczywistym podczas wybuchów epidemii.
- Zrozumienie wskaźników błędów jest kluczowe dla generowania wiarygodnych danych.
- Różne wersje oprogramowania mogą dawać odmienne wyniki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne sekwencjonowanie genomu wirusa jest niezbędne do reagowania na ogniska epidemiczne w czasie rzeczywistym oraz do prowadzenia epidemiologii genomowej. Zrozumienie wskaźników błędów specyficznych dla danej platformy umożliwia generowanie wiarygodnych danych niezbędnych do podejmowania decyzji w obszarze zdrowia publicznego. Walidacja sekwencjonowania nanoporowego w odniesieniu do uznanych platform zapewnia pewność w śledzeniu patogenów oraz analizie transmisji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie pochodzenia wirusów i dróg ich transmisji dzięki wysokiej wierności sekwencjonowania genomu.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybką weryfikację hipotez podczas wybuchów epidemii dzięki przenośnym możliwościom sekwencjonowania w czasie rzeczywistym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane schematy postępowania w zakresie sekwencjonowania genomów wirusowych w oparciu o amplikony wraz z mierzalną oceną poziomu błędów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia powtarzalność analizy dzięki zdefiniowanym progom pokrycia odczytów oraz optymalizacji parametrów oprogramowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie sekwencji konsensusowych odpowiednich do dalszych badań funkcjonalnych i charakterystyki antygenowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia tworzenie skalowalnych potoków sekwencjonowania, które można dostosować do pojawiających się zagrożeń wirusowych przy minimalnej infrastrukturze.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w schematy odkrywania wirusów – od wstępnej detekcji po charakterystykę genomiczną – wspierając identyfikację wiodących związków w opracowywaniu leków przeciwwirusowych dzięki precyzyjnemu śledzeniu szczepów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia precyzyjną identyfikację szczepów wirusowych oraz śledzenie mutacji w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka przy wyborze celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych genomicznych, odpowiednich do oceny wpływu związków przeciwwirusowych na ewolucję wirusa.
- Analityka: Generuje wskaźniki częstości błędów oraz częstotliwość insercji i delecji (indel), co pozwala określić progi jakości danych niezbędne do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od wykrycia ogniska choroby do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie możliwych do prześledzenia danych o linii rodowodowej wirusa.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia przenośną zdolność sekwencjonowania, którą można zastosować w odniesieniu do wielu rodzin wirusów oraz sieci nadzoru geograficznego.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad ewolucją wirusów dzięki sekwencjonowaniu konsensusowemu z korekcją błędów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację między laboratoriami poprzez zdefiniowane pokrycie odczytów (30x) i protokoły programowe zapewniające spójną dokładność.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go w rozwoju leków przeciwwirusowych, dostarczając wiarygodnych danych genomicznych na temat szczepów w obiegu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o genetycznie zwalidowaną epidemiologię wirusów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa biegłość w systemie Unix w celu instalacji oprogramowania i wykonywania poleceń z linii komend.
- Metoda zależy od sprzętu MinION/MinIT oraz dostępu do paneli szczepów referencyjnych służących do dopasowania sekwencji.
- Konieczne jest wsparcie bioinformatyczne międzyzespołowe w celu standaryzacji przepływu pracy i kontroli wersji oprogramowania.
- Należy uwzględnić częste aktualizacje oprogramowania, które mogą zmieniać profile błędów i wyniki konsensusu.
- Skuteczność zależy od utrzymania minimalnego pokrycia odczytami (30x), aby zredukować liczbę indeli i osiągnąć dokładność porównywalną z technologią Illumina.
