Name: Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania oligodendrocytów i wytwarzania pożywki kondycjonowanej do badań nad mielinizacją. Technika ta umożliwia eksperymenty kokulturowe z neuronami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Rémi Ronzano za jego mądre rady w redagowaniu manuskryptów. Praca ta została sfinansowana przez ICM, INSERM, grant fundacji ARSEP dla NSF oraz Bouvet-Labruyère Price.

Opieka i wykorzystanie szczurów w tym eksperymencie jest zgodne z polityką i wytycznymi instytucji (UPMC, INSERM i Dyrektywa Rady Wspólnoty Europejskiej 86/609/EWG). Poniższy protokół ustala się dla standardowego miotu liczącego 12 szczeniąt.
1. Przygotowanie kolb (~5 min)
UWAGA: Wykonaj następujące kroki dzień przed sekcją w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Kolby o długości 150 cm2 (T150) pokryć nasadką filtrującą (1 kolba na 2 młode) przy użyciu 5 ml polietyleneniminy (PEI, 100 mg/l, patrz protokół w pliku uzupełniającym 1).</li>
	<li>Przechowywać kolby w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>W dniu rozbioru przepłukać pokryte kolby 3 razy sterylną wodą destylowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża (~10 min)
UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej, składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i penicyliny-streptomycyny (100 j.m./ml).</li>
	<li>Przygotować 20,6 ml pożywki do trawienia enzymatycznego w probówce o pojemności 50 ml, składającej się z 20 ml DMEM, 200 μl DNazy (50 μg/ml), 200 μl papainy (30 U/ml) i 200 μl L-cysteiny (0,24 mg/ml).</li>
	<li>Filtruj i sterylizuj media za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Utrzymuj media w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej (RT) do czasu rozwarstwienia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do sekcji (~10 min)
UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS; 1x). Sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml lodowatego roztworu 1x PBS uzupełnionego 750 μl 45% glukozy. Sterylizuj filtrem za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego o średnicy 100 mm 1x PBS do czyszczenia narzędzi i trzema szalkami Petriego o średnicy 60 mm lodowatą PBS-glukozą do pobierania tkanek. Połóż szalki Petriego na lodzie do momentu rozbioru.</li>
</ol>
4. Sekcja
UWAGA: Sekcja jest przeprowadzana od samców i samic szczurów rasy Wistar w dniu po urodzeniu (P) 2.
<ol>
	<li>Aby zapewnić sterylne środowisko, upewnij się, że ławka jest czyszczona 100% etanolem. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 100% etanolem.</li>
	<li>Delikatnie spryskaj szyję szczeniaka 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj dużych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć głowę zwierzęciu i umieść głowę na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowatą glukozę PBS.</li>
	<li>Użyj zakrzywionych kleszczy, aby utrzymać głowę zwierzęcia na wysokości oczu. Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie u podstawy czaszki i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej mózgu.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać dwie części czaszki od linii środkowej.</li>
	<li>Użyj małej łyżki chirurgicznej, aby usunąć mózg z jamy głowy. Umieść mózg na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS-glukozę na lodzie.</li>
	<li>Oglądając pod steromikroskopem, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć móżdżek, pień mózgu i opuszki węchowe z półkul mózgowych.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić dwie półkule mózgowe. Użyj cienkich kleszczy, aby odkleić opony mózgowe. Umieść korę mózgową na szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie. 
	UWAGA: Lodowaty PBS ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego usuwania opon mózgowych.</li>
</ol>
5. Dysocjacja tkanek
UWAGA: Wykonaj te czynności w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Użyj ostrego skalpela, aby drobno posiekać korę mózgową. Przenieść zmieloną tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę do trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Użyj mikropipety p1000, aby delikatnie usunąć pożywkę do trawienia enzymatycznego, upewniając się, że tkanka korowa pozostaje na dnie probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Użyj mikropipety p1000, aby dodać 1 ml DMEM-10% FCS i delikatnie rozcierać tkankę.</li>
	<li>Użyj filtra 70 μm i tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby przefiltrować tkankę korową do probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Resztki tkanki na ściance rurki wewnętrznej można kilkakrotnie przepłukać za pomocą DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 50 ml DMEM-10%FCS. Wirować przy 423 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Delikatnie rozcierać osad komórkowy za pomocą mikropipety p1000, a następnie mikropipety p200. Rozcieńczyć zawiesinę komórek odpowiednią objętością DMEM-10%FCS. 
	UWAGA: Dwa mózgi = jeden T150 = 5 ml DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Płytka 5 ml zawiesiny komórek na T150 o gęstości 1 x 105 komórek/cm2. Dodaj 20 ml ciepłego DMEM-10%FCS do każdego T150. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Odnowić połowę pożywki hodowlanej po 6 dniach in vitro (DIV) ciepłym DMEM-10%FCS.</li>
</ol>
6. Przygotowanie do potrząsania
<ol>
	<li>Preparat do wytrząsania należy wykonać w dniu poprzedzającym wstrząsanie w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Odnowić połowę pożywki, dodając świeżą, ciepłą pożywkę do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
</ol>
7. Potrząsanie
<ol>
	<li>Pokryj trzy 100-milimetrowe szalki Petriego PEI. Przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przykryj nakrętkę kolby folią parafinową i włóż kolby do plastikowej torby. Kolby zawierające komórki glejowe wstrząsać przez noc z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Pierwsze wstrząsy wykonywane są przy 8 DIV i można wykonać do trzech różnych wstrząsów (zobacz Rysunek 1 dla pomiaru czasu).</li>
</ol>
8. Pobieranie i hodowla komórek linii OL
UWAGA: Te kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Następnego dnia po wstrząśnięciu przygotować pożywkę Bottensteina-Sato (BS) zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Opłucz pokryte szalki Petriego 3 razy sterylną wodą destylowaną.</li>
	<li>Zebrać supernatant kolb zawierający głównie komórki linii OL, ale także niektóre komórki mikrogleju i umieścić go na niepowlekanych 100-milimetrowych szalkach Petriego. 
	UWAGA: Ten krok umożliwia usunięcie komórek mikrogleju poprzez szybkie przyleganie różnicowe do powierzchni naczynia.</li>
	<li>Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Napełnić każdą kolbę T150 25 ml ciepłej, świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 do drugiego wstrząsu.</li>
	<li>Przenieść supernatant z płytek Petriego do nowych, niepowlekanych płytek Petriego o średnicy 100 mm, aby umożliwić przyleganie pozostałych komórek mikrogleju.</li>
	<li>Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć supernatant, który zawiera nieprzylegające komórki linii OL i przenieść go do probówek o pojemności 50 ml (supernatant z 2 szalek Petriego na probówkę o pojemności 50 ml). Wyrzuć szalki Petriego pokryte mikroglejem.</li>
	<li>Odwirowywać supernatant przez 5 minut przy 423 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml pożywki BS. Zbierz wszystkie granulki we wspólnej probówce o pojemności 50 ml i dostosuj objętość do 10 ml za pomocą pożywki BS.</li>
	<li>Określ gęstość komórek, zliczając komórki pod mikroskopem. 
	UWAGA: Należy uzyskać gęstość komórek między 3 x 105/ml a 5 x 105/ml.</li>
	<li>Dodać 20 ml BS, jeśli gęstość komórek jest większa lub równa 4 x 105/ml, aby uzyskać końcową objętość 30 ml, lub dodać tylko 10 ml BS, jeśli gęstość komórek jest mniejsza niż 4 x 105/ml, aby uzyskać końcową objętość 20 ml.</li>
	<li>Dwie lub trzy wstępnie pokryte 100 mm szalki Petriego należy umieścić na płytce 10 ml zawiesiny komórek. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia z szalek Petriego, odświeżając całe podłoże BS 2 godziny później. 
	UWAGA: Zbadaj kulturę pod mikroskopem przed i po oczyszczeniu, aby zweryfikować gęstość komórek i skuteczność usuwania zanieczyszczeń.</li>
	<li>Inkubować przez 2 dni w podłożu BS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2, 
	UWAGA: Zbadaj kulturę pod mikroskopem. Zbieg powinien wynosić od 70% do 80%.</li>
</ol>
9. Produkcja OCM
UWAGA: Wykonaj te kroki w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotować NB-B27low medium zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Odnowić pożywkę hodowlaną za pomocą 10 ml ciepłej pożywki NB-B27low . Inkubować przez 2 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .</li>
	<li>Zebrać OCM, tj. supernatant zawierający czynniki wydzielane przez OL. Sterylizuj OCM za pomocą filtra 0,22 μm. 
	UWAGA: Przechowywać OCM w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 miesiące.</li>
</ol>
10. Dodawanie OCM
UWAGA: Czynności powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. OCM można dodać do oczyszczonych kultur neuronów hipokampa przygotowanych zgodnie z następującym protokołem14 i otrzymać przez dodanie, 24 godziny po izolacji, środków antymitotycznych urydyny i 5-fluorodeoksyurydyny (5 μM) przez 36 godzin.
<ol>
	<li>W 3 DIV usunąć całą pożywkę do hodowli neuronów zawierającą środki antymitotyczne i dodać 500 μl świeżego, ciepłego OCM.</li>
	<li>Odnawiaj połowę podłoża co 3 dni świeżo przygotowanym ciepłym NB-B27. 
	UWAGA: Takie kultury mogą być utrzymywane do 21 DIV.</li>
</ol>
11. Dodanie OL do oczyszczonej hodowli neuronów hipokampa
UWAGA: Wykonaj następujące kroki w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. OL można dodawać do oczyszczonych kultur hipokampa otrzymanych w taki sam sposób, jak opisano powyżej.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do współhodowli zgodnie z tabelą 3.</li>
	<li>Pobierz kulturę OL przy zbieganiu od 70% do 80%. Spłucz 2 ml ciepłego 1x PBS.</li>
	<li>Aby odłączyć komórki, dodaj 2 ml 0,25% trypsyny do szalki Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj 2 ml DMEM-10% FCS, aby zablokować reakcję enzymatyczną. Zebrać supernatant zawierający komórki linii OL.</li>
	<li>Wirować przy 423 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w ciepłym pożywce do kohodowli, aby uzyskać stężenie 1,25 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Dodaj OL do oczyszczonej hodowli neuronów hipokampa, usuwając 200 μl pożywki do hodowli neuronów i dodając 200 μl zawiesiny komórkowej na dołek (2,5 x 104 komórki / dołek) 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Odświeżaj połowę pożywki kokulturowej co 2-3 dni. 
	UWAGA: Kokultury mogą być utrzymywane do 24 DIV.</li>
</ol>

<ol><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li>
<li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li>
<li>Frühbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).</li>
<li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).</li>
<li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222(2015).</li>
<li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+in+the+Central+Nervous+System%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li>
<li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte%2C+Astrocyte%2C+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development%2C+Damage%2C+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).</li>
<li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li>
<li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573(2019).</li>
<li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li>
<li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression%3A+in+vitro+models+of+proliferation%2C+differentiation+and+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li>
<li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li>
<li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół uzyskiwania wysoce wzbogaconych kultur komórek linii oligodendroglialnej z mieszanych kultur glejowych, zaadaptowanych z wcześniej opublikowanej metody16, a następnie produkcji pożywki kondycjonowanej OL. Ta technika wytrząsania nie jest kosztowna, można ją powtórzyć trzykrotnie i jest optymalna do uzyskania dużej ilości oczyszczonych OL, ponieważ komórki hodowane w pożywce Bottensteina-Sato (BS) zawierają PDGFα namnażają się. Komórki glejowe są prz...

Oligodendrocyty (OL) to komórki glejowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które wytwarzają mielinę owijającą się wokół aksonów. OL pochodzą z komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), które namnażają się w strefach komorowych embrionalnego OUN, a następnie migrują i różnicują się w pełni dojrzałe OL (tj. komórki tworzące mielinę)1. OPC występują obficie we wczesnym okresie rozwoju, ale utrzymują się również w dorosłym mózgu, gdzie reprezentują główną populację komórek proliferacyjnych2. Pojedynczy OL otacza wiele aksonów w niepobudliwych sekcjach (tj. międzywęźlach), a krawędź każdej pętli mielinowej przyłącza się do aksonu, tworząc domenę przywęzłową, która ma kluczowe znaczenie dla właściwości izolacyjnych mieliny1,3. Pomiędzy parawęzłami znajdują się małe niezmielinizowane szczeliny zwane węzłami Ranviera. Węzły te są bogate w kanały sodowe bramkowane napięciem (Nav), co pozwala na regenerację i szybką propagację potencjałów czynnościowych poprzez przewodnictwo solne4. Ta ścisła interakcja umożliwia również wsparcie energii aksonalnej poprzez neuronalny wychwyt mleczanu z OLs5,6.
Dojrzewanie komórek linii oligodendroglialnej i proces mielinizacji są ściśle regulowane przez ich interakcje z neuronami7. Rzeczywiście, OL i OPC, zwane również komórkami NG2, wyrażają szereg receptorów dla neuroprzekaźników i mogą odbierać dane wejściowe z neuronów pobudzających i hamujących, umożliwiając im wyczuwanie aktywności neuronalnej, która może wywołać ich proliferację i / lub różnicowanie w komórki mielinizacyjne2. Z kolei OPC/OL wydzielają do przestrzeni zewnątrzkomórkowej mikropęcherzyki i białka, które samodzielnie lub synergistycznie pośredniczą w funkcjach neuromodulacyjnych i neuroprotekcyjnych8,9,10,11,12. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące wielorakie tryby interakcji między komórkami linii oligodendroglialnej a neuronami nie zostały jeszcze w pełni rozszyfrowane.
Ponadto, w wielu stanach patologicznych OUN, OL są przede wszystkim dotknięte, co zakłóca ich interakcję z neuronami. Na przykład w stwardnieniu rozsianym (SM) dysfunkcja neurologiczna jest spowodowana ogniskową demielinizacją w OUN, wtórną do utraty OL, która może prowadzić do uszkodzenia aksonów i związanej z tym akumulacji niepełnosprawności. Remielinizacja może mieć miejsce, choć w większości przypadków niewystarczająco13. Postęp poczyniony w ciągu ostatniej dekady, spowodowany rozwojem immunoterapii, zmniejszył odsetek nawrotów, ale promowanie remielinizacji pozostaje do tej pory niezaspokojoną potrzebą. W związku z tym lepsze zrozumienie roli, funkcji i wpływu OL ma szczególne znaczenie dla opracowania nowych terapii dla szerokiego spektrum schorzeń OUN.
Tutaj opisujemy metody oczyszczania i hodowli OLs. Umożliwia to precyzyjne zbadanie wewnętrznych mechanizmów regulujących ich rozwój i biologię. Ponadto takie wysoce wzbogacone kultury OL umożliwiają produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM), którą można dodać do oczyszczonych kultur neuronów w celu uzyskania wglądu w wpływ czynników wydzielanych przez OL na fizjologię i łączność neuronalną. Ponadto opisujemy, jak wdrożyć system kohodowli in vitro, w którym oczyszczone oligodendrocyty i neurony są ze sobą łączone, co pozwala zająć się mechanizmami regulującymi (re)mielinizację.

<table><tbody><tr><td>5-fluorodeoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>roztwór D-(+)-glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNaza (dezoksyrybonukleaza I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninin(PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran dekahydrat</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferyna ludzka</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek putrescyny</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (sól sodowa 3,3',5-trijodo-L-tyroniny)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-tyroksyna)</td> <td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wspólnej hodowli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferyna ludzka</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmin</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki CNTF</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (sól sodowa 3,3',5-trijodo-L-tyroniny)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m filtr</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 50 ml</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & Mikro; Filtr m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lornetkowy</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do drobnych</td> przedmiotów <td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Mała łyżka chirurgiczna</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 kolba z nasadką filtrującą</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar szczur</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

W ośrodkowym układzie nerwowym, oligodendrocyty są dobrze znane ze swojej roli w mielinizacji aksonów, która przyspiesza propagację potencjałów czynnościowych poprzez przewodnictwo solne. Co więcej, coraz więcej doniesień sugeruje, że oligodendrocyty oddziałują z neuronami poza mielinizacją, w szczególności poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pozwalający na oczyszczanie komórek linii oligodendroglialnej z hodowli komórek glejowych zawierających również astrocyty i komórki mikrogleju. Metoda opiera się na wytrząsaniu przez noc w temperaturze 37 °C, co umożliwia selektywne oderwanie leżących nad nimi komórek oligodendroglialnych i komórek mikrogleju oraz eliminację mikrogleju poprzez adhezję różnicową. Następnie opisujemy hodowlę oligodendrocytów i produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM). Zapewniamy również kinetykę leczenia OCM lub dodatek oligodendrocytów do oczyszczonych neuronów hipokampa w eksperymentach z udziałem współkultur, badając interakcje oligodendrocytów-neuronów.

W niniejszym protokole komórki linii OL są oczyszczane z kultur glejowych poprzez odwirowanie (strzepywanie) astrocytów i mikrogleju. Czystość oraz badanie fenotypowe kultur OL można ocenić za pomocą immunobarwienia z markerami glejowymi15. Analiza ekspresji różnych markerów wykazała, że kultury OL składały się głównie z pre-OL, z czego 90% ± 4% stanowiły komórki O4+, 85% ± 7% komórki NG2+ oraz 4,7% ± 2,1% komórki PLP+, podczas gdy ...

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Opisujemy skuteczną metodę oczyszczania i hodowli komórek linii oligodendroglialnej. Pozwala to na zajęcie się mechanizmami molekularnymi kontrolującymi różnicowanie oligodendrocytów i ich interakcji z neuronami podczas procesu mielinizacji. Ta technika wytrząsania nie jest droga i jest optymalna do uzyskania dużej ilości oligodendrocytów.Takie hodowle pozwalają na produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami i kokultur oligodendrocytów z neuronami. Stwardnienie rozsiane jest chorobą spowodowaną ogniskową demielinizacją w ośrodkowym układzie nerwowym, wtórną do utraty oligodendrocytów. Hodowla oligodendrocytów stanowi narzędzie do lepszego zrozumienia, w jaki sposób promować ponowną mielinizację.Jedynie hodowla komórek oligodendroglialnych może dostarczyć informacji na temat wewnętrznych mechanizmów regulujących rozwój i biologię oligodendrocytów. Kohodowle z neuronami pozwalają uzyskać wgląd w ich wpływ na fizjologię neuronów. Na początek użyj zakrzywionych kleszczy, aby utrzymać głowę zwierzęcia na wysokości oczu.Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie u podstawy czaszki i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej mózgu. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać dwie części czaszki od linii środkowej. Użyj małej łyżki chirurgicznej, aby usunąć mózg z jamy głowy.Umieść mózg na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowatą glukozę PBS na lodzie. Oglądając pod mikroskopem stereoskopowym, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć móżdżek, pień mózgu i opuszki węchowe z półkul mózgowych. Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić dwie półkule mózgowe.Użyj cienkich kleszczy, aby odkleić opony mózgowe. Umieść korę mózgową na 60-milimetrowej szalce Petriego na lodzie. W okapie z przepływem laminarnym użyj ostrego skalpela, aby drobno posiekać korę mózgową.Przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę do trawienia enzymatycznego. Inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Następnie za pomocą pipety delikatnie usuń pożywkę do trawienia enzymatycznego, upewniając się, że tkanka korowa pozostaje na dnie probówki.Użyj mikropipety P1000, aby dodać jeden mililitr 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM i delikatnie rozcierać tkankę. Użyj filtra 70 mikronów i tłoka jednomililitrowej strzykawki, aby przefiltrować tkankę korową do 50-mililitrowej probówki. Kilkakrotnie spłucz resztki tkanki na wewnętrznej ściance rurki o pojemności 50 mililitrów za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM.Napełnij 50-mililitrową rurkę 10% płodową surowicą cielęcą. Wirować 423 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą dwóch mililitrów DMEM 10% płodowej surowicy cielęcej.Delikatnie rozetrzeć osad komórkowy za pomocą mikropipety P1000, a następnie mikropipety P200. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową odpowiednią objętością DMEM 10% płodowej surowicy cielęcej. Umieścić pięć mililitrów zawiesiny komórek na kolbie T-150 o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy.Dodaj 20 mililitrów ciepłej 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM do każdej kolby T-150. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Po wytrząśnięciu próbki przez noc z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza, należy zebrać supernatant w kolbie zawierającej głównie komórki linii oligodendrocytów, ale także niektóre komórki mikrogleju, i ułożyć go na niepowlekanych 100-milimetrowych szalkach Petriego.Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pozwala to na usunięcie komórek mikrogleju poprzez różnicową szybką adhezję do powierzchni naczynia. W międzyczasie napełnij każdą kolbę T-150 25 mililitrami ciepłej, świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla do drugiego wstrząsnięcia.Następnie przenieś supernatant z szalek Petriego do nowych, niepowlekanych 100-milimetrowych szalek Petriego, aby umożliwić adhezję pozostałych komórek mikrogleju. Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Usuń supernatant z każdych dwóch szalek Petriego, które zawierają nieprzylegające komórki linii oligodendrocytów, i przenieś go do 50-mililitrowej probówki.Wyrzuć szalki Petriego pokryte mikroglejem. Wirować probówki przez pięć minut w temperaturze 423 razy g. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z jednym mililitrem pożywki Bottensteina-Sato.Zbierz wszystkie granulki we wspólnej 50-mililitrowej tubie i dostosuj objętość do 20 lub 30 mililitrów w zależności od gęstości komórek za pomocą pożywki Bottenstein-Sato. Na dwie lub trzy wstępnie powlekane 100-milimetrowe szalki Petriego należy umieścić na płytce 10 mililitrów zawiesiny komórek. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla.Dwie godziny później usuń zanieczyszczenia z szalek Petriego, odświeżając całe podłoże Bottensteina-Sato. Inkubować przez dwa dni w pożywce w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po dwóch dniach zbadaj kulturę pod mikroskopem.W okapie z przepływem laminarnym, w sterylnych warunkach, odnów pożywkę hodowlaną za pomocą 10 mililitrów ciepłej niskiej pożywki MPB-27. Inkubować przez dwa dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Aby zebrać OCM, należy zebrać supernatant zawierający czynniki wydzielane przez oligodendrocyty.Filtr wysterylizuj OCM za pomocą filtra 0,22 mikrona. W tym protokole komórki linii oligodendrocytów oczyszczono z kultur glejowych poprzez strząśnięcie astrocytów i mikrogleju. Analiza ekspresji różnych markerów wykazała, że kultury oligodendrocytów były w większości pre-oligodendrocytami z 90 plus minus 4% komórek O4-dodatnich, 85 plus minus 7% komórek NG2-dodatnich i 4,7 plus minus 2,1% komórek PLP-dodatnich, podczas gdy 7,2 plus minus 2,5% komórek było astrocytami GFAP-dodatnimi.OCM wytworzony z takich kultur dodawano po trzech dniach in vitro do oczyszczonych kultur neuronów hipokampa. Zabieg ten sprzyja grupowaniu białek notalnych. Mielinizację neuronów hipokampa badano poprzez dodanie oligodendroctyów po 14 dniach in vitro.Od 20 do 24 dni in vitro, barwienie immunologiczne markerów mieliny, takich jak podstawowe białko mieliny, umożliwiło wizualizację segmentów mieliny i węzłów Ranviera. Rdzeń PBS jest ważny dla usuwania opon mózgowych. Szybkie oczyszczanie ma kluczowe znaczenie dla żywotności oligodendroctyów i uświadomienia sobie siły przepływu zastosowanego za pomocą pipety.Pożywkę kondycjonowaną oligodendrocytami można dodać do kultur neuronalnych, aby uzyskać wgląd w wpływ czynników wydzielanych przez oligodendrocyty na fizjologię neuronów. Można również przeprowadzić kohodowle oligodendroctyi z neuronami w celu zbadania procesu mielinizacji.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Film demonstruje protokół różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) na oligodendrocyty i indukowania mielinizacji w kokulturze z neuronami zwoju korzenia grzbietowego (DRG). OPC są transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych kodujących białko sygnałowe, które reguluje mielinizację. Transdukowane OPC są hodowane wspólnie z neuronami DRG w celu oceny różnicowania w oligodendrocyty i mielinizacji indukowanej białkiem sygnałowym.

Test mielinizacji indukowanej transdukcją in vitro dla komórek prekursorowych oligodendrocytów

Ten film demonstruje produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami (OCM) z komórek linii oligodendrocytów poprzez ich naprężenie w celu zwiększenia ich molekularnego uwalniania do pożywki. To podłoże, które jest bogate w czynniki wzrostu, cytokiny i inne bioaktywne cząsteczki, można dodać do kultur neuronów, aby uzyskać wgląd w wpływ czynników wydzielanych przez oligodendrocyty na fizjologię i łączność neuronów.

Metoda wytwarzania pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami

Ten film demonstruje technikę izolacji i hodowli komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z kory mózgowej szczeniąt myszy.

Izolowanie i hodowla komórek prekursorowych oligodendrocytów z kory mózgowej szczeniąt myszy

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Poznaj metodę oczyszczania oligodendrocytów i wytwarzania pożywki kondycjonowanej do badań nad mielinizacją. Technika ta umożliwia eksperymenty kokulturowe z neuronami.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Przeglądaj więcej filmów