Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Opisujemy skuteczną metodę oczyszczania i hodowli komórek linii oligodendroglialnej. Pozwala to na zajęcie się mechanizmami molekularnymi kontrolującymi różnicowanie oligodendrocytów i ich interakcji z neuronami podczas procesu mielinizacji. Ta technika wytrząsania nie jest droga i jest optymalna do uzyskania dużej ilości oligodendrocytów.

Takie hodowle pozwalają na produkcję pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami i kokultur oligodendrocytów z neuronami. Stwardnienie rozsiane jest chorobą spowodowaną ogniskową demielinizacją w ośrodkowym układzie nerwowym, wtórną do utraty oligodendrocytów. Hodowla oligodendrocytów stanowi narzędzie do lepszego zrozumienia, w jaki sposób promować ponowną mielinizację.

Jedynie hodowla komórek oligodendroglialnych może dostarczyć informacji na temat wewnętrznych mechanizmów regulujących rozwój i biologię oligodendrocytów. Kohodowle z neuronami pozwalają uzyskać wgląd w ich wpływ na fizjologię neuronów. Na początek użyj zakrzywionych kleszczy, aby utrzymać głowę zwierzęcia na wysokości oczu.

Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie u podstawy czaszki i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej mózgu. Użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać dwie części czaszki od linii środkowej. Użyj małej łyżki chirurgicznej, aby usunąć mózg z jamy głowy.

Umieść mózg na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowatą glukozę PBS na lodzie. Oglądając pod mikroskopem stereoskopowym, użyj cienkich kleszczy, aby usunąć móżdżek, pień mózgu i opuszki węchowe z półkul mózgowych. Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić dwie półkule mózgowe.

Użyj cienkich kleszczy, aby odkleić opony mózgowe. Umieść korę mózgową na 60-milimetrowej szalce Petriego na lodzie. W okapie z przepływem laminarnym użyj ostrego skalpela, aby drobno posiekać korę mózgową.

Przenieś zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę do trawienia enzymatycznego. Inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Następnie za pomocą pipety delikatnie usuń pożywkę do trawienia enzymatycznego, upewniając się, że tkanka korowa pozostaje na dnie probówki.

Użyj mikropipety P1000, aby dodać jeden mililitr 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM i delikatnie rozcierać tkankę. Użyj filtra 70 mikronów i tłoka jednomililitrowej strzykawki, aby przefiltrować tkankę korową do 50-mililitrowej probówki. Kilkakrotnie spłucz resztki tkanki na wewnętrznej ściance rurki o pojemności 50 mililitrów za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM.

Napełnij 50-mililitrową rurkę 10% płodową surowicą cielęcą. Wirować 423 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą dwóch mililitrów DMEM 10% płodowej surowicy cielęcej.

Delikatnie rozetrzeć osad komórkowy za pomocą mikropipety P1000, a następnie mikropipety P200. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową odpowiednią objętością DMEM 10% płodowej surowicy cielęcej. Umieścić pięć mililitrów zawiesiny komórek na kolbie T-150 o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy.

Dodaj 20 mililitrów ciepłej 10% płodowej surowicy cielęcej DMEM do każdej kolby T-150. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Po wytrząśnięciu próbki przez noc z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza, należy zebrać supernatant w kolbie zawierającej głównie komórki linii oligodendrocytów, ale także niektóre komórki mikrogleju, i ułożyć go na niepowlekanych 100-milimetrowych szalkach Petriego.

Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pozwala to na usunięcie komórek mikrogleju poprzez różnicową szybką adhezję do powierzchni naczynia. W międzyczasie napełnij każdą kolbę T-150 25 mililitrami ciepłej, świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla do drugiego wstrząsnięcia.

Następnie przenieś supernatant z szalek Petriego do nowych, niepowlekanych 100-milimetrowych szalek Petriego, aby umożliwić adhezję pozostałych komórek mikrogleju. Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Usuń supernatant z każdych dwóch szalek Petriego, które zawierają nieprzylegające komórki linii oligodendrocytów, i przenieś go do 50-mililitrowej probówki.

Wyrzuć szalki Petriego pokryte mikroglejem. Wirować probówki przez pięć minut w temperaturze 423 razy g. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z jednym mililitrem pożywki Bottensteina-Sato.

Zbierz wszystkie granulki we wspólnej 50-mililitrowej tubie i dostosuj objętość do 20 lub 30 mililitrów w zależności od gęstości komórek za pomocą pożywki Bottenstein-Sato. Na dwie lub trzy wstępnie powlekane 100-milimetrowe szalki Petriego należy umieścić na płytce 10 mililitrów zawiesiny komórek. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla.

Dwie godziny później usuń zanieczyszczenia z szalek Petriego, odświeżając całe podłoże Bottensteina-Sato. Inkubować przez dwa dni w pożywce w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Po dwóch dniach zbadaj kulturę pod mikroskopem.

W okapie z przepływem laminarnym, w sterylnych warunkach, odnów pożywkę hodowlaną za pomocą 10 mililitrów ciepłej niskiej pożywki MPB-27. Inkubować przez dwa dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Aby zebrać OCM, należy zebrać supernatant zawierający czynniki wydzielane przez oligodendrocyty.

Filtr wysterylizuj OCM za pomocą filtra 0,22 mikrona. W tym protokole komórki linii oligodendrocytów oczyszczono z kultur glejowych poprzez strząśnięcie astrocytów i mikrogleju. Analiza ekspresji różnych markerów wykazała, że kultury oligodendrocytów były w większości pre-oligodendrocytami z 90 plus minus 4% komórek O4-dodatnich, 85 plus minus 7% komórek NG2-dodatnich i 4,7 plus minus 2,1% komórek PLP-dodatnich, podczas gdy 7,2 plus minus 2,5% komórek było astrocytami GFAP-dodatnimi.

OCM wytworzony z takich kultur dodawano po trzech dniach in vitro do oczyszczonych kultur neuronów hipokampa. Zabieg ten sprzyja grupowaniu białek notalnych. Mielinizację neuronów hipokampa badano poprzez dodanie oligodendroctyów po 14 dniach in vitro.

Od 20 do 24 dni in vitro, barwienie immunologiczne markerów mieliny, takich jak podstawowe białko mieliny, umożliwiło wizualizację segmentów mieliny i węzłów Ranviera. Rdzeń PBS jest ważny dla usuwania opon mózgowych. Szybkie oczyszczanie ma kluczowe znaczenie dla żywotności oligodendroctyów i uświadomienia sobie siły przepływu zastosowanego za pomocą pipety.

Pożywkę kondycjonowaną oligodendrocytami można dodać do kultur neuronalnych, aby uzyskać wgląd w wpływ czynników wydzielanych przez oligodendrocyty na fizjologię neuronów. Można również przeprowadzić kohodowle oligodendroctyi z neuronami w celu zbadania procesu mielinizacji.