Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Obecnie nie ma leków, które mają ugruntowaną pozycję w promowaniu tworzenia heterochromatyny. Poniżej przedstawiamy prostą i skuteczną metodę identyfikacji związków małocząsteczkowych, które sprzyjają temu procesowi. Nasz protokół badań przesiewowych zapewnia prosty, niedrogi i łatwy do zastosowania system identyfikacji leków in vivo promujących heterochromatynę.

Identyfikacja związków, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, może prowadzić do odkrycia mechanizmów gojenia się raka i terapii przeciwnowotworowej. Ta opłacalność została zmierzona w celu identyfikacji związków promujących heterochromatynę u Drosophila, może być również wykorzystana do liczenia trafień formy, ponieważ jest to środek zapobiegawczy do najwyższej puli komórek badań przesiewowych. Nasz protokół badań przesiewowych może być również przydatny w przypadku szybkich badań przesiewowych pilotów, ponieważ ten system Drosophila TranSheet wytwarza różnorodny fenotyp koloru oczu, który jest odwrotnie skorelowany z ilością heterochromatyny obecnej u muchy.

W demonstracji procedury pomoże Kenny Dao, student z naszego laboratorium. Po zidentyfikowaniu i przygotowaniu biblioteki leków do badania przesiewowego przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika i pożądanego stężenia, należy skrzyżować trzy samce much z trzema lub więcej dziewiczymi samicami much w fiolce z pokarmem o wymiarach 25 na 95 milimetrów. Z dziewięcioma milimetrami standardowego podłoża spożywczego Drosophila.

Ustaw trzy repliki fiolek dla każdego leku. Dodaj jedną fiolkę kontrolną do ekranu. I pozwól muchom składać jaja przez dwa dni w temperaturze pokojowej.

W drugim dniu krzyża znieczul muchy krótkim wybuchem dwutlenku węgla. I wyrzuć muchy rodzicielskie do butelki zawierającej 70% etanolu. Następnie rozcieńczyć każdy związek leku z początkowego zapasu, aby osiągnąć końcowe stężenie mikromolowe w 33% DMSO w wodzie.

I dodaj 60 mikrolitrów leku, czyli kontrolnego 33% DMSO w monoterapii, na wierzch pokarmu dla much. Następnie upewnij się, że w fiolkach nie ma much rodzicielskich. I dodaj roztwór leku do odpowiednich fiolek.

Dwa dni po pojawieniu się much F1 przenieś znieczulone muchy z jednej fiolki na raz na porowatą podkładkę preparacyjną z dwutlenkiem węgla filtrującym spod bibuły filtracyjnej. Pod mikroskopem preparacyjnym zbadaj każdą muchę, identyfikując wszystkie heterozygotyczne samce na podstawie braku fenotypu kędzierzawych skrzydeł z dominacją O. Oceń kolor oczu każdego heterozygotycznego samca w skali od jednego do pięciu.

Przy czym jeden wynik jest przypisywany do mniej niż 5% całkowitej powierzchni rozrzuconego czerwonego oka. Dodaj dwa punkty do much o całkowitej powierzchni oczu z 6 do 25% czerwoną plamką. Trójka do much z całkowitą powierzchnią oczu z 26 do 50% czerwoną plamą.

Czwórka do much z całkowitą powierzchnią oczu z czerwoną plamką od 51 do 75%. I pięć much z ponad 75% całkowitą powierzchnią oczu z czerwoną plamą. Następnie obliczyć średni indeks barwy wszystkich samców z każdej fiolki narysowanej w trzech egzemplarzach.

Aby potwierdzić, że związki te rzeczywiście sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, można przeprowadzić inną technikę walidacji, taką jak western blotting. W tym reprezentatywnym eksperymencie biblioteka leków małocząsteczkowych, zestaw onkologiczny 3, który składa się z 97 leków onkologicznych zatwierdzonych przez FDA, została przebadana przy użyciu szczepu DX1 Drosophila Melanogaster. Zgodnie z testem przesiewowym, metotreksat, kodowany jako E7 w bibliotece, powodował największą zmienność w obrębie szczepu Dx1.

Sugeruje to, że metotreksat może być najbardziej obiecującym lekiem promującym heterochromatynę w przyszłej terapii celowanej przeciwnowotworowej. Aby dodatkowo potwierdzić, że związek ten sprzyja transformacji heterochromatyny, przeprowadzono dane dotyczące western blot. Wykazanie regulacji w górę białka związanego z formatyną heterochromatyny, trimetylacją H3K9 i walidacja wyników badań przesiewowych.

Krytycznym krokiem jest ocena koloru oczu każdego z białych 11-18 heterozygotycznych samców DX1 w skali od jednego do pięciu, zgodnie z wcześniej ustaloną trasą badania. Możemy użyć western blot lub barwienia immunologicznego, aby potwierdzić trafienia. Odkrycie związków, co do których podejrzewa się, że sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, może również doprowadzić do odkrycia dożylnego genetycznego mechanizmu rozwoju nowotworów i badań klinicznych na ludziach.