Name: Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj metodę przesiewową do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila. Protokół wykorzystuje fenotypy zmienności barwy oczu jako wskaźnik poziomu heterochromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Birchlerowi, E. Bachowi i Bloomington Drosophila Stock Center za różne szczepy Drosophila; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program dla biblioteki leków małocząsteczkowych Oncology Set; Studenci studiów licencjackich UCSD, w tym Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza i Alex Chavez. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez grant badawczy American Thoracic Society dla J.L. oraz finansowanie z NIH: R01GM131044 dla W.X.L.

1. Przygotowanie biblioteki leków
<ol>
	<li>Zidentyfikuj i przygotuj bibliotekę leków do badań przesiewowych przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika o pożądanym stężeniu (np. 10 mM w DMSO). 
	UWAGA: Konkretnym przykładem biblioteki leków jest Oncology Set III z National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Związki w tym zestawie są dostarczane w postaci 20 μl przy 10 mM w 100% DMSO w dwóch 96-dołkowych płytkach PP z dnem i przechowywane w temperaturze -20 °C. Mapy NCI Plate oraz podstawowe dane chemiczne każdego leku można znaleźć na następujących stronach internetowych: 
	<a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4740&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">numer tablicy NCI 4740</a> 
	<a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4741&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">numer tablicy NCI 4741</a></li>
</ol>
2. Badanie przesiewowe pod kątem leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila
<ol>
	<li>Strategia hodowlana Drosophila (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
	<ol>
		<li>Dzień 1: Krzyż trzeci w1118/Y; Samce much DX1/CyO i trzy lub więcej dziewiczych w 1118 samicach much w fiolce z pokarmem o wymiarach 25 mm x 95 mm z 9 ml standardowej pożywki Drosophila (przepis Bloomington). Skonfigurować trzy fiolki replikujące dla każdego leku i jedną kontrolną dla ekranu. 
		UWAGA: Muchy DX1 zostały dzięki uprzejmości Jamesa Birchlera (University of Missouri)9,13.</li>
		<li>Dzień 2 i Dzień 3: Pozwól muszkom złożyć jaja przez 2 dni w temperaturze pokojowej (22 °C).</li>
		<li>Dzień 4: Użyj krótkiego impulsu gazu CO2 do znieczulenia much rodzicielskich i wyrzuć muchy rodzicielskie do "kostnicy much" (butelka zawierająca 70% alkoholu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawaj leki Drosophila do badań przesiewowych.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć każdy związek leczniczy z oryginalnego materiału wyjściowego (20 μL przy 10 mM w 100% DMSO w 96-dołkowych płytkach PP U-bottom) do końcowego stężenia 10 μM z 33% DMSO w wodzie. Użyj 33% DMSO w wodzie bez żadnego leku jako kontrola. 
		UWAGA: Niektóre leki są słabo rozpuszczalne w wodzie i zostały rozpuszczone w DMSO. 100% DMSO jest toksyczne dla much. 33% jest tolerowane.</li>
		<li>Dzień 4: Odpipetować 60 μl 10 μM roztworu leku lub grupy kontrolnej na wierzch pokarmu dla much. W tym momencie upewnij się, że muchy rodzicielskie zostały usunięte, a na pokarmie znajdują się jaja much i pełzające larwy w pierwszym stadium</li> rozwojowym.
		<li>Dzień 6: Powtórzyć pipetowanie 60 μl tego samego 10 μM roztworu leku do fiolki z żywnością. 
		UWAGA: Ponieważ do pokarmu dla much dodano narkotyki, pokarm na górnej powierzchni zawiera stężenie prawie 10 μM, a pokarm na dole może nie być w pełni penetrowany. Wszystkie muchy składają jaja na wierzchu pokarmu i zjadają pokarm na górnej powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj i oceniaj zmiany koloru oczu.
	<ol>
		<li>Dwa dni po pojawieniu się much F1 (około 14 dnia) zbadaj muchy. Użyj krótkiej serii CO2 do znieczulenia much F1 i usuń muchy z ich fiolki na porowatą podkładkę preparacyjną z CO2 sączącym się spod bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Sprawdź muchy na tej podkładce pod mikroskopem preparacyjnym. Zbadaj całą muchę i zidentyfikuj wszystkie w1118/Y; Heterozygotyczne samce DX1/+ ze względu na brak fenotypu kręconych skrzydeł z dominacją CyO.</li>
		<li>Oceń kolor oczu każdego z w1118/Y; Heterozygotyczny samiec DX1/+ leci w skali od 1 do 5 (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Procentowy udział białego koloru oczu oceniono w następujący sposób: 
		1. <5% całkowitej powierzchni oczu rozproszonych 
		2. 6% - 25% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu 
		3. 26% - 50% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu 
		4. 51% - 75% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu 
		5. >75% czerwonych plam całkowita powierzchnia oczu 
		UWAGA: Alternatywnie, homogenizuj głowy muchy w 100% metanolu i użyj spektrometru do pomiaru pigmentacji oczu przy OD 450 nm. Wybierz tylko samce, ponieważ PEV jest bardziej wymawiany u samców DX1. Zdobądź więcej niż 10 samców w każdej fiolce.</li>
		<li>Obliczyć średni indeks barwy wszystkich samców z każdej naciętej fiolki. Wykonaj trzy próby dla każdego związku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Ponieważ kolor oczu zmienia się wraz z wiekiem, jest to krok, w którym zależy od czasu. Kolor oczu należy obliczyć w tym samym wieku – 2 dni. Zwykle w każdej fiolce należy naciąć >10 much.</li>
		<li>Aby potwierdzić, że związki rzeczywiście sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, użyj innej techniki, takiej jak western blotting, aby zweryfikować (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li>
<li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).</li>
<li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li>
<li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li>
<li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li>
<li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li>
<li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).</li>
<li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Heterochromatin+Protein+1+%28HP1%29+to+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li>
<li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin%3A+Guardian+of+the+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Heterochromatyna to skondensowana forma DNA, która odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. Staje się coraz bardziej rozpoznawalny w leczeniu nowotworów i może służyć jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej 15,16,17,18. Związki małocząsteczkowe są powszechnie stosowane w opracowywaniu leków ze względu na zalety w produkcji, konserwacji i metabolizmie w organizmach ludzkich. A...

Heterochromatyna to skondensowana forma DNA, która odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów, w regulacji segregacji chromosomów podczas podziału komórki oraz w ochronie przed niestabilnością genomu1. Heterochromatyna została uznana za regulator represji genów i ochronę integralności chromosomów podczas mitozy komórki2,3. Jest to związane z di- i trimetylacją histonu H3 lizyny 9 (H3K9me) podczas zobowiązania linii4,5. Co więcej, rekrutacja białek chromodomeny białka heterochromatyny 1 (HP1) jest również uważana za związaną z heterochromatyną i epigenetyczną represją ekspresji genów6. Białka te są niezbędnymi składnikami i markerami tworzenia heterochromatyny.
Ponieważ niestabilność genomu umożliwia komórkom nabywanie zmian genetycznych, które sprzyjają kancerogenezie, heterochromatyna staje się coraz bardziej rozpoznawalna w rozwoju raka i może być celem leczenia raka7,8. Obecnie nie ma leków, które mają ugruntowaną pozycję we wspomaganiu tworzenia heterochromatyny. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką, ale skuteczną metodę badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny. Badania przesiewowe przeprowadza się poprzez leczenie Drosophila za pomocą biblioteki leków małocząsteczkowych. Metoda ta wykorzystuje różnorodny fenotyp koloru oczu w szczepie DX1Drosophila, na który wpływa poziom heterochromatyny. Muchy DX1 zawierają tandemowy układ siedmiu transgenów P[lac-w], które mają różnorodną ekspresję / depresję w zależności od heterochromatynizacji, dlatego zakres różnorodności koloru oczu odzwierciedla poziom heterochromatyny. W szczególności wzrost heterochromatyny można wykryć na podstawie rosnącego odsetka barwnego koloru oczu (białe oko). Wręcz przeciwnie, zmniejszająca się heterochromatyna byłaby wykrywana przez rosnący odsetek ekspresji transgenu P[lac-w] (czerwone oko)9,10,11,12.
Dlatego korzystamy z tego systemu transgenów Drosophila, który wytwarza różnorodny fenotyp koloru oczu, ponieważ jego ekspresja jest bezpośrednio skorelowana z ilością obecnej heterochromatyny. Po odkryciu związków, co do których podejrzewa się, że sprzyjają tworzeniu się heterochromatyny, możemy potwierdzić to podejrzenie za pomocą innych metod, takich jak western blot. Te substancje promujące heterochromatynę mogą być w przyszłości rozwijane do badań klinicznych z udziałem pacjentów.

<table><tbody><tr><td>Muchy Drosophila</td><td></td><td> DX1 szczep</td><td>DX1 zostały uprzejmie dostarczone przez Jamesa Birchlera (University of Missouri)</td></tr><tr><td>Drosophila media spożywcze</td><td>UCSD kuchnia muchowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metotreksat</td><td>NCI biblioteka</td><td></td><td></td>leków</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etylowy alkohol</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila to doskonały organizm modelowy, który może być używany do badania związków przydatnych w terapii raka. Opisana tutaj metoda jest opłacalną metodą in vivo do identyfikacji związków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila. Szczep DX1 firmy Drosophila, o różnorodnym fenotypie koloru oczu, który odzwierciedla zakres tworzenia heterochromatyny, zapewniając w ten sposób narzędzie do badania przesiewowego leków promujących heterochromatynę. W tej metodzie przesiewowej zmienność oka jest określana ilościowo na podstawie powierzchni czerwonej pigmentacji zajmującej części oka i jest oceniana w skali od 1 do 5. Metoda przesiewowa jest prosta i czuła oraz pozwala na badanie związków in vivo. Badania przesiewowe leków przy użyciu tej metody zapewniają szybki i niedrogi sposób identyfikacji leków promujących heterochromatynę, które mogą mieć korzystny wpływ na terapię przeciwnowotworową. Identyfikacja związków, które sprzyjają powstawaniu heterochromatyny, może również doprowadzić do odkrycia epigenetycznych mechanizmów rozwoju nowotworów.

Niniejszy protokół został z powodzeniem zastosowany do przesiewania związków promujących tworzenie się heterochromatyny w Muszka owocówka, który stanowi wydajny i niskokosztowy system in vivo do opracowywania leków (Rycina 1). Przeskanowaliśmy bibliotekę leków małocząsteczkowych, Oncology Set III, składającą się z 97 zatwierdzonych przez FDA leków onkologicznych, wykorzystując DX1 szczep Drosophila melanogaster (Rycina 1B</stro...

Drosophila to szeroko stosowany model eksperymentalny, odpowiedni do badania przesiewowego leków o potencjalnym zastosowaniu w terapii raka. W tym miejscu opisujemy zastosowanie barwnych fenotypów oczu Drosophila jako metody badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny.

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Obecnie nie ma leków, które mają ugruntowaną pozycję w promowaniu tworzenia heterochromatyny. Poniżej przedstawiamy prostą i skuteczną metodę identyfikacji związków małocząsteczkowych, które sprzyjają temu procesowi. Nasz protokół badań przesiewowych zapewnia prosty, niedrogi i łatwy do zastosowania system identyfikacji leków in vivo promujących heterochromatynę.Identyfikacja związków, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, może prowadzić do odkrycia mechanizmów gojenia się raka i terapii przeciwnowotworowej. Ta opłacalność została zmierzona w celu identyfikacji związków promujących heterochromatynę u Drosophila, może być również wykorzystana do liczenia trafień formy, ponieważ jest to środek zapobiegawczy do najwyższej puli komórek badań przesiewowych. Nasz protokół badań przesiewowych może być również przydatny w przypadku szybkich badań przesiewowych pilotów, ponieważ ten system Drosophila TranSheet wytwarza różnorodny fenotyp koloru oczu, który jest odwrotnie skorelowany z ilością heterochromatyny obecnej u muchy.W demonstracji procedury pomoże Kenny Dao, student z naszego laboratorium. Po zidentyfikowaniu i przygotowaniu biblioteki leków do badania przesiewowego przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika i pożądanego stężenia, należy skrzyżować trzy samce much z trzema lub więcej dziewiczymi samicami much w fiolce z pokarmem o wymiarach 25 na 95 milimetrów. Z dziewięcioma milimetrami standardowego podłoża spożywczego Drosophila.Ustaw trzy repliki fiolek dla każdego leku. Dodaj jedną fiolkę kontrolną do ekranu. I pozwól muchom składać jaja przez dwa dni w temperaturze pokojowej.W drugim dniu krzyża znieczul muchy krótkim wybuchem dwutlenku węgla. I wyrzuć muchy rodzicielskie do butelki zawierającej 70% etanolu. Następnie rozcieńczyć każdy związek leku z początkowego zapasu, aby osiągnąć końcowe stężenie mikromolowe w 33% DMSO w wodzie.I dodaj 60 mikrolitrów leku, czyli kontrolnego 33% DMSO w monoterapii, na wierzch pokarmu dla much. Następnie upewnij się, że w fiolkach nie ma much rodzicielskich. I dodaj roztwór leku do odpowiednich fiolek.Dwa dni po pojawieniu się much F1 przenieś znieczulone muchy z jednej fiolki na raz na porowatą podkładkę preparacyjną z dwutlenkiem węgla filtrującym spod bibuły filtracyjnej. Pod mikroskopem preparacyjnym zbadaj każdą muchę, identyfikując wszystkie heterozygotyczne samce na podstawie braku fenotypu kędzierzawych skrzydeł z dominacją O. Oceń kolor oczu każdego heterozygotycznego samca w skali od jednego do pięciu.Przy czym jeden wynik jest przypisywany do mniej niż 5% całkowitej powierzchni rozrzuconego czerwonego oka. Dodaj dwa punkty do much o całkowitej powierzchni oczu z 6 do 25% czerwoną plamką. Trójka do much z całkowitą powierzchnią oczu z 26 do 50% czerwoną plamą.Czwórka do much z całkowitą powierzchnią oczu z czerwoną plamką od 51 do 75%. I pięć much z ponad 75% całkowitą powierzchnią oczu z czerwoną plamą. Następnie obliczyć średni indeks barwy wszystkich samców z każdej fiolki narysowanej w trzech egzemplarzach.Aby potwierdzić, że związki te rzeczywiście sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, można przeprowadzić inną technikę walidacji, taką jak western blotting. W tym reprezentatywnym eksperymencie biblioteka leków małocząsteczkowych, zestaw onkologiczny 3, który składa się z 97 leków onkologicznych zatwierdzonych przez FDA, została przebadana przy użyciu szczepu DX1 Drosophila Melanogaster. Zgodnie z testem przesiewowym, metotreksat, kodowany jako E7 w bibliotece, powodował największą zmienność w obrębie szczepu Dx1.Sugeruje to, że metotreksat może być najbardziej obiecującym lekiem promującym heterochromatynę w przyszłej terapii celowanej przeciwnowotworowej. Aby dodatkowo potwierdzić, że związek ten sprzyja transformacji heterochromatyny, przeprowadzono dane dotyczące western blot. Wykazanie regulacji w górę białka związanego z formatyną heterochromatyny, trimetylacją H3K9 i walidacja wyników badań przesiewowych.Krytycznym krokiem jest ocena koloru oczu każdego z białych 11-18 heterozygotycznych samców DX1 w skali od jednego do pięciu, zgodnie z wcześniej ustaloną trasą badania. Możemy użyć western blot lub barwienia immunologicznego, aby potwierdzić trafienia. Odkrycie związków, co do których podejrzewa się, że sprzyjają tworzeniu heterochromatyny, może również doprowadzić do odkrycia dożylnego genetycznego mechanizmu rozwoju nowotworów i badań klinicznych na ludziach.

a-screening-method-for-identification-heterochromatin-promoting-drugs

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W ostatnim czasie technologia sekwencjonowania wysokoprzepustowego znacznie zwiększyła czułość eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), co przyczyniło się do ich zastosowania z użyciem oczyszczonych komórek lub wyselekcjonowanych tkanek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę wykorzystania techniki ChIP w tkankach Drosophila, która pozwala na badanie endogennego stanu chromatyny w dobrze scharakteryzowanym systemie biologicznym.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Ten protokół ma na celu wizualizację agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila polytene.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę przesiewową do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila. Protokół wykorzystuje fenotypy zmienności barwy oczu jako wskaźnik poziomu heterochromatyny.

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Przeglądaj więcej filmów