Name: Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj technikę wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego do trójwymiarowego biodruku, zapobiegającą sedymentacji komórek. Metoda zapewnia jednorodne rozmieszczenie komórek i utrzymuje odpowiednie środowisko dla ich żywotności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za granty od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81771971, 81970442, 81703470 i 81570422), Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2018YFC1005002), Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (17JC1400200), Głównego Projektu Nauki i Technologii Miejskiej w Szanghaju (Grant nr 2017SHZDZX01) oraz Miejskiej Komisji Edukacji w Szanghaju (Program Innowacji 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Przygotowanie wypełnionego komórkami SF-GelMA
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie materiały za pomocą strzykawkowych jednostek filtrujących 0,22 μm. Wykonaj wszystkie czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Podgrzej 1x PBS do 50 °C i rozpuść żelatynę w podgrzanym 1x PBS, mieszając. Końcowe stężenie żelatyny w PBS powinno wynosić 10% (w/v).</li>
	<li>Dodać bezwodnik metakrylowy do roztworu żelatyny (stosunek wagowy bezwodnika metakrylowego do żelatyny wynosi 0,6 do 1) powoli, mieszając, i mieszać kompleks przez co najmniej 1 godzinę (50 °C). Zazwyczaj należy przygotować 200 ml 10% roztworu żelatyny z 12 g bezwodnika metakrylowego; Objętość zależy od potrzeb badania.</li>
	<li>Przenieść zmieszany roztwór zawierający żelatynę i bezwodnik metakrylowy do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zmieszany roztwór o sile 3 500 x g. Uzyskanie dwóch warstw zajmuje zwykle 3-5 minut. Zebrać górną warstwę (GelMA) i wyrzucić dolną warstwę (nieprzereagowany bezwodnik metakrylowy).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór górnej warstwy otrzymany w kroku 1.5 dwiema objętościami wody dejonizowanej (40−50 °C).</li>
	<li>Roztwór otrzymany w kroku 1.6 dializować za pomocą membrany dializacyjnej odcinającej masę cząsteczkową 12-14 kDa z wodą dejonizowaną przez 5-7 dni (40-50 °C). Zmieniaj wodę dwa razy dziennie.</li>
	<li>Zebrać i zamrozić roztwór GelMA w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Liofilizuj roztwór GelMA przez 3-5 dni w liofilizatorze w temperaturze ustawionej na -45 °C i ciśnieniu ustawionym na 0,2 mbar.</li>
	<li>Rozpuść liofilizowany GelMA (stopień podstawienia około 75%) w 1x PBS zawierającym 10% FBS (płodowa surowica bydlęca, v/v), 25 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-etano-sulfonowy) i fotoinicjatorze (0,5%, w/v) w celu otrzymania preparatu biotuszu GelMA. 
	UWAGA: Stopień podstawienia GelMA można obliczyć za pomocą testu ninhydryny3.</li>
	<li>Zmieszać roztwór GelMA (10%, w/v) z różnymi objętościami początkowego roztworu SF (5%, w/v) i różnymi objętościami 1x PBS, aby otrzymać biotusze SF-GelMA o różnych stężeniach SF. Proporcję na 1 ml roztworu GelMA i SF w różnych biotuszach przedstawiono w tabeli 1. 
	UWAGA: Wszystkie biotusze muszą zawierać końcowe stężenie 5% (w/v) GelMA, ale stężenie SF jest różne: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 i 1,5% (w/v) w różnych biotuszach SF-GelMA. Użyj SF-M-Layered-GelMA, aby określić biotusz GelMA zmodyfikowany SF w sposób warstwa po warstwie. Użyj SF-X-GelMA, aby określić te GelMA zmodyfikowane SF w jednorodny sposób (np. GelMA z modyfikacją 1% SF została określona jako SF-1-GelMA).</li>
	<li>Sonikuj wszystkie biotusze przez 10-20 minut.</li>
	<li>Hoduj komórki NIH3T3 przy użyciu DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco) zawierające 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze (37 °C z 5% CO2 ). Przejdź komórki w stosunku 1:3, gdy gęstość osiągnie 80%.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek NIH3T3 z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut. Usunąć supernatant przez odsysanie i ponownie zawiesić osad komórek ze świeżym roztworem biotuszu w sterylnej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Stężenie zamkniętych komórek w biotuszu powinno wynosić 1 x 106 komórek/ml, a stężenie należy obliczyć za pomocą cytometru.</li>
	<li>Użyj 2 ml różnych biotuszy SF-GelMA, aby zawiesić granulki komórek, aby uzyskać różne biotusze zawierające komórki.</li>
</ol>
2. Ładowanie, podgrzewanie i biodrukowanie SF-M-Layered-GelMA
<ol>
	<li>Załadować 0,4 ml wypełnionego komórkami SF-0,5-GelMA do dolnej warstwy strzykawki. 
	UWAGA: W tym badaniu należy użyć strzykawki o pojemności 2 ml jako zbiornika na biotusz. Do strzykawki należy wkładać różne biotusze SF-GelMA warstwa po warstwie.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w lodowatej łaźni wodnej (0 °C) na 5 minut, aby dolna warstwa biotuszu przekształciła się w stan żelowy.</li>
	<li>Załaduj 0,4 ml biotuszu SF-0,75-GelMA z komórkami nad dolną warstwą.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę z dwiema warstwami biotuszy w lodowatej kąpieli wodnej (0 °C) na 5 minut, aby dwie warstwy biotuszy przekształciły się w stan żelowy.</li>
	<li>Wykonaj kolejne 3 cykle ładowania i chłodzenia z pozostałymi 3 rodzajami biotuszy (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA), aby uzyskać wielowarstwowy system biotuszu o różnych stężeniach SF w różnych warstwach. Objętość użyta do załadowania wszystkich biotuszów powinna wynosić 0,4 ml.</li>
	<li>Podgrzej wielowarstwowy biotusz, umieszczając strzykawkę w inkubatorze (37 °C) na 30 minut przed biodrukowaniem.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 2 ml jako zbiornika na biotusz z dyszą drukującą 27 G. Ustaw prędkość przepływu na 50 μl/min, prędkość ruchu dyszy na 2 mm/s, a wysokość dyszy na 1 mm. Procedurę biodruku należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej (około 20 °C).
	<ol>
		<li>Wydrukuj konstrukt tkankowy w sposób ekstruzji za pomocą specjalnie zaprojektowanej biodrukarki zgodnie z parametrami zaadaptowanymi z naszych poprzednich badań11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj światła ultrafioletowego (365 nm, 800 mW) przez 40 s, aby usieciować biodrukowany konstrukt tkankowy.</li>
	<li>Hodowla usieciowanego konstruktu tkankowego w DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco) zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze (37 °C z 5% CO2 ). Pożywkę zmieniano co 8 godzin przez pierwsze 2 dni, a następnie co 2-3 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li>
<li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting%3A+from+benches+to+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510(2019).</li>
<li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization%2C+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li>
<li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li>
<li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).</li>
<li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stabilność systemu wielowarstwowego jest kluczowym elementem pomyślnego przeprowadzenia tego protokołu. Teoretycznie obliczyliśmy dyfuzję cząsteczek SF w roztworze GelMA w oparciu o badanie Naumana13. Stwierdzono, że dyfuzja białek w roztworze była powiązana z ich masą cząsteczkową. Średnia masa cząsteczkowa (MW) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) wynosi 66,5 kDa, a jej współczynnik dyfuzji to 64-72 μm2/s. Średnia MW fibrynogenu wynosi 339,7 kDa, a jego współczynnik dyfuzji to 23-34 μm<su...

Trójwymiarowy (3D) biodruk okazał się obiecującą metodą wytwarzania skomplikowanych architektonicznych i funkcjonalnych replik rodzimych tkanek w biofabrykacji i medycynie regeneracyjnej1,2,3. Typowe strategie biodruku, w tym druk atramentowy, ekstruzja i stereolitografia, mają zalety i wady z różnych perspektyw4. Wśród tych technik najczęściej stosowana jest procedura wytłaczania ze względu na jej opłacalność. Biotusz odgrywa kluczową rolę w stabilności procesu biodruku przez wytłaczanie. Idealny biotusz obciążony komórkami powinien być nie tylko biokompatybilny, ale także odpowiedni pod względem właściwości mechanicznych5. Biotusze o niskiej lepkości są zwykle przedstawiane w stanie podobnym do cieczy. Te biotusze można łatwo i szybko osadzać i unikać uszkodzenia błony komórkowej wywołanego dużym naprężeniem ścinającym podczas wytłaczania. Jednak w złożonych przypadkach wymagających długotrwałych okresów drukowania, niska lepkość często prowadzi do nieuniknionej sedymentacji zamkniętych komórek w zbiorniku biotuszu, co jest zwykle napędzane grawitacyjnie i prowadzi do niejednorodnej dyspersji komórek w biotuszu6,7. W związku z tym biotusz o niejednorodnej dyspersji komórkowej utrudnia biodrukowanie in vitro funkcjonalnego konstruktu tkankowego.
Kilka ostatnich badań skupiających się na biotuszach wykazało promowanie jednorodnej dyspersyjności zamkniętych komórek. Zmodyfikowany biotusz alginianowy oparty na dwustopniowym sieciowaniu został użyty do biodruku ekstruzyjnego8. W tym badaniu polimer alginianowy został zmodyfikowany peptydami i białkami. Komórki wykazywały bardziej jednorodny rozkład w tym zmodyfikowanym alginianie niż w powszechnie stosowanym alginianie ze względu na miejsca przyłączenia zapewniane przez peptydy i białka. Alternatywnie, mieszane biotusze zostały wykorzystane do rozwiązania sedymentacji komórek w biotuszu. W innym badaniu zastosowano mieszany biotusz zawierający glikol polietylenowy (PEG) i żelatynę lub żelatynę metakryloyl (GelMA) o zwiększonej wytrzymałości mechanicznej9. Kapsułkowane komórki charakteryzowały się jednorodnym rozkładem, głównie dlatego, że poprawiła się lepkość zmieszanego biotuszu. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kilka czynników wpływających na dyspersję zamkniętych komórek w biotuszu, takich jak lepkość biotuszu, grawitacja komórek, gęstość komórek i czas trwania okresu pracy. Wśród tych czynników grawitacja komórek odgrywa kluczową rolę w promowaniu sedymentacji. Wyporność i tarcie zapewniane przez lepki biotusz były do tej pory badane jako główne siły działające przeciwko grawitacji10.
Tutaj opracowaliśmy nowatorską strategię promowania jednorodnej dyspersji komórek zamkniętych w biotuszu poprzez manipulowanie wieloma płynnymi interfejsami w zbiorniku biotuszu. Te ciekłe interfejsy utworzone przez wielowarstwową modyfikację biotuszu mogą nie tylko zapewnić retencję międzyfazową, co opóźnia sedymentację komórek, ale także utrzymać odpowiednią biokompatybilność i zachowanie reologiczne biotuszu. W praktyce zmodyfikowaliśmy wodny roztwór GelMA (5%, w/v) z fibroiną jedwabiu (SF) w sposób wielowarstwowy, aby wzdłużnie wytworzyć cztery interfejsy, zapewniając napięcia międzyfazowe w mieszanym biotuszu. W rezultacie, obciążenie grawitacyjne komórek zostało zniwelowane przez napięcie międzyfazowe spowodowane przez człowieka, a dzięki mniejszej sedymentacji w sąsiednich warstwach komórek uzyskano prawie jednorodne rozproszenie zamkniętych komórek w biotuszu. Do tej pory nie zgłoszono podobnego protokołu spowalniającego sedymentację zamkniętych komórek poprzez manipulowanie retencją międzyfazową w płynnych biotuszach. Przedstawiamy tutaj nasz protokół, aby zademonstrować nowy sposób rozwiązywania sedymentacji komórek w biodruku.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-hydroksy-4&prime;-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon (PI2959)</td><td>TCI</td><td>M64BK-QD Kwas</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900863MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik metakrylowy (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; antybiotyki streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Fibroina jedwabiu</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5154</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Podczas procesu trójwymiarowego biodruku opartego na ekstruzji, płynne biotusze o niskiej lepkości mogą chronić komórki przed uszkodzeniem błony wywołanym naprężeniem ścinającym i poprawić przeżywalność zamkniętych komórek. Jednak szybka sedymentacja komórek w zbiorniku napędzana grawitacją może prowadzić do niejednorodnego rozmieszczenia komórek w strukturach biodrukowanych, a tym samym utrudniać stosowanie biotuszy podobnych do płynnych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorską, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla biotuszów przypominających ciecz (np. żelatyny metakryloylu o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych w kapsułkach komórek. W wielowarstwowym biotuszu manipulowano wieloma płynnymi interfejsami, aby zapewnić retencję międzyfazową. W związku z tym działanie sedymentacji komórek przebiegające przez sąsiednie warstwy w systemie wielowarstwowym zostało opóźnione w zbiorniku biotuszu. Stwierdzono, że retencja międzyfazowa była znacznie wyższa niż przyciąganie osadowe komórek, co wskazuje na kluczową rolę retencji międzyfazowej w zapobieganiu sedymentacji komórek i promowaniu bardziej jednorodnej dyspersji komórek w wielowarstwowym biotuszu.

Schemat przygotowania biotuszy obciążonych komórkami przedstawiono na Ryc. 1. Po przygotowaniu różnych biotuszów przeprowadzono ich załadunek, ponowne podgrzanie oraz biodruk (Ryc. 2). Aby ocenić rozkład zamkniętych wewnątrz komórek w zbiorniku z biotuszem, przeprowadzono procedurę biodruku z użyciem trzech różnych biotuszów obciążonych komórkami w trzech płytkach 96-dołkowych (Ryc. 3A). W celu zbadania dyspersyjności zamkniętych ko...

Tutaj opracowaliśmy nową, wielowarstwową, zmodyfikowaną strategię dla płynnych biotuszy (żelatyna metakryloyl o niskiej lepkości), aby zapobiec sedymentacji zamkniętych komórek.

Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Korzystając z naszego protokołu, wielowarstwowość płynnych rozcieńczeń biotuszu nie tylko sprzyja jednorodnej dyspersji zamkniętych komórek, ale także utrzymuje odpowiednie dla komórek środowisko biotuszu. Używamy napięcia międzyfazowego, aby zatrzymać sedymentację zamkniętych komórek w zbiorniku biotuszu, unikając dużego obciążenia komórek naprężeniami ścinającymi podczas drukowania przez wytłaczanie. Korzystając z tej technologii, możemy generować konstrukty tkankowe 3D o jednorodnym rozmieszczeniu komórek, zapewniając funkcjonalną formę tkankową in vitro do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej.Podczas przygotowywania biotuszu należy zwrócić uwagę na temperaturę eksperymentalną i procedurę ładowania higrożelem, ponieważ czynniki te mogą wpływać na jakość tuszu. Przed przystąpieniem do przygotowania należy użyć strzykawkowych jednostek filtrujących o średnicy 0,22 mikrometra, aby wysterylizować wszystkie materiały i rozpuścić żelatynę do 10% stężenia końcowego w PBS o temperaturze 50 stopni Celsjusza w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać bezwodnik metakrylowy do roztworu żelatyny w stosunku wagowym 0,6 do jednego, powoli mieszając przez co najmniej godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przenieś zmieszany roztwór do sterylnej 50-mililitrowej probówki i rozdziel roztwór na warstwy przez odwirowanie. Zebrać górną warstwę GelMA i rozcieńczyć zebrany roztwór dwiema objętościami wody dejonizowanej o temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza. Dializuj roztwór GelMA za pomocą membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów z wodą dejonizowaną przez pięć do siedmiu dni w temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza, zmieniając wodę dwa razy dziennie.Pod koniec dializy należy zamrozić roztwór GelMA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnie liofilizuj roztwór GelMA przez trzy do pięciu dni w liofilizatorze w temperaturze minus 45 stopni Celsjusza i ciśnieniu 0,2 milibara. Następnie rozpuść liofilizowany GelMA w PBS uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 25 milimolowymi HEPES i 0,5% fotoinicjatorem.Aby otrzymać biotusze GelMA z fibroiny jedwabiu, należy zmieszać roztwór GelMA z różnymi objętościami początkowego roztworu fibroiny jedwabiu i różnymi objętościami PBS, jak sugerowano w tabeli. Gdy wszystkie biotusze zostaną przygotowane, należy poddać roztwór sonikacji przez 10 do 20 minut. Podczas gdy atramenty są sonikowane, zbierz komórki z 80% zlewającej się hodowli komórkowej NIH / 3T3 do jednej 15-mililitrowej stożkowej probówki na roztwór biotuszu i granuluj komórki przez odwirowanie.Następnie ostrożnie odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w każdej probówce za pomocą dwóch mililitrów biotuszu w stężeniu od 10 do sześciu komórek na mililitr roztworu biotuszu. Aby załadować biotusz do drukowania, dodaj odessać 400 mikrolitrów obciążonego komórkami jedwabnego fibroiny 0,5 GelMA do dolnej warstwy dwumililitrowej strzykawki. Umieść strzykawkę w lodowatej kąpieli wodnej o temperaturze zero stopni Celsjusza na pięć minut, aby przekształcić dolną warstwę biotuszu w stan żelowy przed załadowaniem 400 mikrolitrów biotuszu jedwabnego o obciążonych komórkach 0,75 GelMA na warstwę fibroiny jedwabiu 0,5 GelMA.Następnie należy umieścić strzykawkę z powrotem w łaźni lodowej na pięć minut, kontynuując dodawanie do strzykawki każdego dodatkowego stężenia biotuszu zawierającego komórki w ten sam sposób. Po uzyskaniu wielowarstwowego systemu biotuszu z różnymi stężeniami fibroiny jedwabiu w różnych warstwach, należy ponownie podgrzać biotusz w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji załaduj na strzykawkę dyszę drukującą o rozmiarze 27 i ustaw prędkość przepływu na 50 mikrolitrów na minutę, prędkość ruchu dyszy na dwa mililitry na sekundę, a wysokość dyszy na jeden milimetr.Następnie wydrukuj konstrukt tkanki w sposób ekstruzji za pomocą specjalnie przygotowanej biodrukarki w temperaturze pokojowej i usieciuj biowydrukowaną konstrukcję tkankową za pomocą 365 nanometrów światła ultrafioletowego przez 40 sekund przy 800 miliwatach. Następnie hodować usieciowany konstrukt tkankowy w DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną w inkubatorze do hodowli komórkowych, zmieniając pożywkę co osiem godzin przez pierwsze dwa dni, a następnie co dwa do trzech dni. W tej reprezentatywnej analizie, wraz z postępem procedury biodrukowania, gęstość komórek w docelowych studzienkach zmniejszyła się we wszystkich grupach.W grupie fibroiny jedwabnej zero GelMA około 70% komórek zdeponowano w dolnej warstwie. W jednej grupie fibroiny jedwabiu około 40% komórek zostało zdeponowanych w dolnej warstwie, a około 5% komórek zostało zdeponowanych w górnej warstwie. W grupie wielowarstwowej fibroiny jedwabnej GelMA osadzanie się zamkniętych komórek było bardziej jednorodne niż w grupach kontrolnych.Najważniejszą częścią tego protokołu jest ładowanie wielowarstwowych biotuszu SF-GelMA. Protokół ten można zastosować do innych analiz biodruku przez wytłaczanie, które wykorzystują biotusze podobne do płynów.

using-multilayered-hydrogel-bioink-three-dimensional-bioprinting-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Opisujemy zestaw protokołów, które razem dostarczają biotusz naśladujący tkankę, za pomocą którego można biodrukować funkcjonalne i żywotne konstrukcje tkanek 3D do wykorzystania w badaniach przesiewowych in vitro.

Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę przekształcenia taniej komercyjnej drukarki 3D w bakteryjną drukarkę 3D, która może ułatwić drukowanie wzorzystych biofilmów. Opisano wszystkie niezbędne aspekty przygotowania biodrukarki i biotuszu, a także metody weryfikacji w celu oceny powstawania biofilmów.

Trójwymiarowe wzory biofilmów inżynieryjnych za pomocą biodrukarki zrób to sam

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Poznaj technikę wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego do trójwymiarowego biodruku, zapobiegającą sedymentacji komórek. Metoda zapewnia jednorodne rozmieszczenie komórek i utrzymuje odpowiednie środowisko dla ich żywotności.

Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

Przeglądaj więcej filmów