Zastosowanie wielowarstwowego biotuszu hydrożelowego w trójwymiarowym biodruku w celu jednorodnego rozmieszczenia komórek

Korzystając z naszego protokołu, wielowarstwowość płynnych rozcieńczeń biotuszu nie tylko sprzyja jednorodnej dyspersji zamkniętych komórek, ale także utrzymuje odpowiednie dla komórek środowisko biotuszu. Używamy napięcia międzyfazowego, aby zatrzymać sedymentację zamkniętych komórek w zbiorniku biotuszu, unikając dużego obciążenia komórek naprężeniami ścinającymi podczas drukowania przez wytłaczanie. Korzystając z tej technologii, możemy generować konstrukty tkankowe 3D o jednorodnym rozmieszczeniu komórek, zapewniając funkcjonalną formę tkankową in vitro do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej.

Podczas przygotowywania biotuszu należy zwrócić uwagę na temperaturę eksperymentalną i procedurę ładowania higrożelem, ponieważ czynniki te mogą wpływać na jakość tuszu. Przed przystąpieniem do przygotowania należy użyć strzykawkowych jednostek filtrujących o średnicy 0,22 mikrometra, aby wysterylizować wszystkie materiały i rozpuścić żelatynę do 10% stężenia końcowego w PBS o temperaturze 50 stopni Celsjusza w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać bezwodnik metakrylowy do roztworu żelatyny w stosunku wagowym 0,6 do jednego, powoli mieszając przez co najmniej godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przenieś zmieszany roztwór do sterylnej 50-mililitrowej probówki i rozdziel roztwór na warstwy przez odwirowanie. Zebrać górną warstwę GelMA i rozcieńczyć zebrany roztwór dwiema objętościami wody dejonizowanej o temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza. Dializuj roztwór GelMA za pomocą membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów z wodą dejonizowaną przez pięć do siedmiu dni w temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza, zmieniając wodę dwa razy dziennie.

Pod koniec dializy należy zamrozić roztwór GelMA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnie liofilizuj roztwór GelMA przez trzy do pięciu dni w liofilizatorze w temperaturze minus 45 stopni Celsjusza i ciśnieniu 0,2 milibara. Następnie rozpuść liofilizowany GelMA w PBS uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 25 milimolowymi HEPES i 0,5% fotoinicjatorem.

Aby otrzymać biotusze GelMA z fibroiny jedwabiu, należy zmieszać roztwór GelMA z różnymi objętościami początkowego roztworu fibroiny jedwabiu i różnymi objętościami PBS, jak sugerowano w tabeli. Gdy wszystkie biotusze zostaną przygotowane, należy poddać roztwór sonikacji przez 10 do 20 minut. Podczas gdy atramenty są sonikowane, zbierz komórki z 80% zlewającej się hodowli komórkowej NIH / 3T3 do jednej 15-mililitrowej stożkowej probówki na roztwór biotuszu i granuluj komórki przez odwirowanie.

Następnie ostrożnie odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w każdej probówce za pomocą dwóch mililitrów biotuszu w stężeniu od 10 do sześciu komórek na mililitr roztworu biotuszu. Aby załadować biotusz do drukowania, dodaj odessać 400 mikrolitrów obciążonego komórkami jedwabnego fibroiny 0,5 GelMA do dolnej warstwy dwumililitrowej strzykawki. Umieść strzykawkę w lodowatej kąpieli wodnej o temperaturze zero stopni Celsjusza na pięć minut, aby przekształcić dolną warstwę biotuszu w stan żelowy przed załadowaniem 400 mikrolitrów biotuszu jedwabnego o obciążonych komórkach 0,75 GelMA na warstwę fibroiny jedwabiu 0,5 GelMA.

Następnie należy umieścić strzykawkę z powrotem w łaźni lodowej na pięć minut, kontynuując dodawanie do strzykawki każdego dodatkowego stężenia biotuszu zawierającego komórki w ten sam sposób. Po uzyskaniu wielowarstwowego systemu biotuszu z różnymi stężeniami fibroiny jedwabiu w różnych warstwach, należy ponownie podgrzać biotusz w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji załaduj na strzykawkę dyszę drukującą o rozmiarze 27 i ustaw prędkość przepływu na 50 mikrolitrów na minutę, prędkość ruchu dyszy na dwa mililitry na sekundę, a wysokość dyszy na jeden milimetr.

Następnie wydrukuj konstrukt tkanki w sposób ekstruzji za pomocą specjalnie przygotowanej biodrukarki w temperaturze pokojowej i usieciuj biowydrukowaną konstrukcję tkankową za pomocą 365 nanometrów światła ultrafioletowego przez 40 sekund przy 800 miliwatach. Następnie hodować usieciowany konstrukt tkankowy w DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną w inkubatorze do hodowli komórkowych, zmieniając pożywkę co osiem godzin przez pierwsze dwa dni, a następnie co dwa do trzech dni. W tej reprezentatywnej analizie, wraz z postępem procedury biodrukowania, gęstość komórek w docelowych studzienkach zmniejszyła się we wszystkich grupach.

W grupie fibroiny jedwabnej zero GelMA około 70% komórek zdeponowano w dolnej warstwie. W jednej grupie fibroiny jedwabiu około 40% komórek zostało zdeponowanych w dolnej warstwie, a około 5% komórek zostało zdeponowanych w górnej warstwie. W grupie wielowarstwowej fibroiny jedwabnej GelMA osadzanie się zamkniętych komórek było bardziej jednorodne niż w grupach kontrolnych.

Najważniejszą częścią tego protokołu jest ładowanie wielowarstwowych biotuszu SF-GelMA. Protokół ten można zastosować do innych analiz biodruku przez wytłaczanie, które wykorzystują biotusze podobne do płynów.