Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Ten protokół pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób zachowanie cytoszkieletu mikrotubul zachodzi w roślinach. Jednocześnie pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób te elementy strukturalne, które wpływają na kształt komórek i narządów, reagują na zmiany sił mechanicznych. Chociaż metoda ta wymaga niewielkiego wyrafinowania, zapewnia solidny, ilościowy odczyt różnic w odpowiedzi mechanicznej między różnymi genotypami i warunkami.

Zacznij od uprawy nasion arabidopsis z ekspresją domen wiążących mikrotubule połączonych z zielonym białkiem fluorescencyjnym w glebie, w temperaturze 20 i 6 stopni Celsjusza w warunkach długiego dnia przez tydzień. Po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do nowych doniczek z wystarczającą przestrzenią do wzrostu, aby umożliwić silny wzrost wegetatywny, i umieść rośliny w temperaturze 20 i 16 stopni Celsjusza w krótkich warunkach dziennych. Po trzech do pięciu tygodniach przenieś rośliny z powrotem do warunków długiego dnia w tej samej temperaturze, aż rośliny się zakręcą, pozwalając kwiatostanowi urosnąć do dwóch do pięciu centymetrów długości.

W przypadku rozwarstwienia merystema wierzchołkowego pędu umieść kwiatostan i użyj ostrych kleszczy, aby obrać kwiaty u podstawy szypułek, aż trudno będzie zobaczyć szypułki gołym okiem, aby usunąć starsze pąki kwiatowe. Użyj kleszczy, aby utworzyć szczelinę w agros w naczyniu preparacyjnym i posadź podstawę kwiatostanu w grubym Augur. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym.

Zaczynając od najstarszego pąka kwiatowego, popchnij kleszczami, aby usunąć pączek kwiatowy z rośliny. Merystem wierzchołkowy pędu jest zwykle odsłaniany, gdy usuwa się starsze kwiaty do etapu od szóstego do siódmego. I użyj kleszczy, aby popchnąć każdy pączek kwiatowy w dół, aż widoczny będzie merystem wierzchołkowy pędu.

Jak tylko merystem wierzchołkowy pędu zostanie odsłonięty, pozwól świeżo wypreparowanej próbce umieścić ją w pożywce wzrostowej w wysterylizowanym etanolem prostokątnym plastikowym pudełku hodowlanym na zawiasach z merystemem wierzchołkowym pędu tuż odsłoniętym nad powierzchnią pożywki. Dodaj kilka kropli sterylnej wody dejonizowanej do krawędzi pudełka hodowlanego i zamknij pokrywę, aby utrzymać wilgotność wewnątrz pudełka. Owiń pudełko taśmą z mikroporami i umieść pudełko do wzrostu w długich lub ciągłych warunkach dziennych w temperaturze 22 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin.

Gdy roślina wyzdrowieje po procedurze preparacji, przykryj próbkę sterylną wodą dejonizowaną i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieś pudełko hodowlane do pionowego stolika mikroskopu konfokalnego i wybierz soczewkę do zanurzania w wodzie 40 lub 60X. Opuść obiektyw do wody i sprawdź, czy na przedniej soczewce obiektu nie ma pęcherzyków powietrza.

Aby usunąć pęcherzyki, opuść stolik i delikatnie przetrzyj obiektyw chusteczką optyczną. Następnie za pomocą pipety Pasteura dodaj niewielką ilość wody do przedniej soczewki obiektywu przed ponownym zanurzeniem soczewki w wodzie. Następnie użyj filtra GFP i modułu epi-illumination mikroskopu konfokalnego, aby wyregulować kontroler XY w celu zlokalizowania próbki.

Regulując położenie okularów, umieść merystem wierzchołkowy pędu bezpośrednio pod źródłem światła i ustaw ostrość wzdłuż osi Z, aż znajdzie się wierzchołek. Użyj lasera zdolnego do wzbudzenia GFP, aby oświetlić próbkę i dostosuj zoom optyczny mikroskopu tak, aby cały merystem wierzchołkowy pędu i zawiązki kwiatowe pierwszego stopnia znajdowały się w polu widzenia. Następnie dostosuj moc wyjścia lasera i ustawienia wzmocnienia, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu.

Po pozostawieniu próbki na osiadanie przez dwie do pięciu minut, uzyskaj konfokalne stosy Z próbki w odstępach od 0,25 do 0,5 mikrometra Z, dodając rozdzielczość około 0,3 mikrometra piksela. Pod koniec akwizycji natychmiast usuń wodę i przenieś pudełko hodowlane z powrotem do komory wzrostowej. W przypadku perturbacji merystemów wierzchołkowych pędów mikromechanicznych należy uzyskać stosy obrazów sprzed ablacji organizacji mikrotubul korowych, jak właśnie pokazano, i przelać wodę bezkofeinową z pudełka hodowlanego do naczynia hodowlanego.

Przenieś merystem wierzchołkowy pędu pod mikroskopem preparacyjnym i powoli zbliżaj się do merystema wierzchołkowego pędu czystą igłą strzykawkową o wymiarach 0,4 na 20 milimetrów. Krótko zetknąć końcówką igły z obrzeżem kopuły merystemu wierzchołkowego pędu, aby potwierdzić, że ablacja została zakończona. I napełnij naczynie hodowlane sterylną wodą dejonizowaną.

Następnie dodaj 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny do naczynia i natychmiast uzyskuj stosy obrazów, jak pokazano, co dwie godziny przez sześć godzin, zwracając szalkę hodowlaną do inkubacji między każdym punktem czasowym. W celu analizy danych wygeneruj projekcje powierzchniowe stosów obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu i wykonaj ekstrakcję anizotropii mikrotubul korowych za pomocą narzędzia Fibril Tool Macro na Fidżi. Tutaj można zaobserwować typowe obrazy projekcyjne uzyskane z linii GFP wiążących domenę mikrotubul z komórkami w środku kopuły zawierającymi zdezorganizowane mikrotubule korowe, komórkami na obrzeżach, o rozmieszczeniu obwodowym i komórkami domeny granicznej zawierającymi mikrotubule korowe ustawione równolegle do długiej osi komórki.

Obrazowanie poklatkowe pokazuje, że ułożenie mikrotubul korowych zmienia się z wysoce nieuporządkowanej w bardziej uporządkowaną matrycę w ciągu sześciu godzin od ablacji. Tensory można nakładać na obrazy mikrotubul korowych, a wyodrębnione informacje można reprezentować, wykreślając średnią anizotropię w czasie. Dostosowując ustawienia mocy wyjściowej lasera i wzmocnienia, powinniśmy upewnić się, że zapewnia wyraźną obserwację włókien i starać się unikać prześwietlenia, ponieważ nadmiernie nasycone sygnały mogą zakrzywić kierunek rozciągania w późniejszej analizie.

Mikroskopia sił atomowych może być również przeprowadzona w celu oceny, w jaki sposób zmiany sił mechanicznych faktycznie wpływają na fizyczny stan ściany komórkowej.