Name: Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę obrazowania cytoszkieletu mikrotubul w merystemie wierzchołkowym Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościową analizę odpowiedzi mikrotubul na siły mechaniczne w żywych komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wzrost roślin
<ol>
	<li>Nasiona rzodkiewnika siej eksprymujące domenę wiążącą mikrotubule połączone z białkiem zielonej fluorescencji (MBD-GFP)10 na glebie i trzymaj w długim dniu (16 godzin dziennie / 8 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/6 °C przez 1 tydzień do kiełkowania.</li>
	<li>Po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do nowych doniczek z wystarczającą przestrzenią do wzrostu, aby umożliwić silny wzrost wegetatywny. Rośliny należy przechowywać w krótkich warunkach dziennych (8 godzin w dzień / 16 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/16 °C przez 3-5 tygodni.</li>
	<li>Przenieś rośliny do długiego dnia (16 godzin w dzień / 8 godzin w nocy), w temperaturze 20 °C/16 °C i trzymaj, aż rośliny się wykiełkują (2-3 tygodnie). Pozwól kwiatostanowi urosnąć do 2-5 cm długości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia do preparacji, wypełniając małe szalki Petriego (około 5,5 cm szerokości, 1,5 cm głębokości) do około połowy ich głębokości 2% agarozy. Naczynia preparacyjne mogą być również używane do obrazowania pojedynczych punktów czasowych.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową.
	<ol>
		<li>Przygotuj 50 ml 1000-krotnego roztworu podstawowego witaminy z 5 g mio-inozytolu, 0,05 g kwasu nikotynowego, 0,05 g chlorowodorku pirydoksyny, 0,5 g chlorowodorku tiaminy i 0,1 g glicyny.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę wzrostową, składającą się z 1/2 pożywki Murashige i Skoog, 1% sacharozy, 1,6% agaru, 1x witaminy, pH = 5,8. Autoklaw i pozwól mu ostygnąć.</li>
		<li>Na sterylnej, czystej ławce wysterylizuj plastikowe pudełka na zawiasach (około 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm), zanurzając je w 70% etanolu na 15 minut.</li>
		<li>Na sterylnej, czystej ławce, gdy podłoże osiągnie znośne ciepło, dodaj N6-benzyladeninę do końcowego stężenia 200 nM i 1/1000 PPM (mieszanina roślinnych środków konserwujących) i dobrze wymieszaj. Napełnij sterylne pudełka pożywką do około połowy ich głębokości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja SAM
<ol>
	<li>Odetnij kwiatostan i usuń starsze pąki kwiatowe ostrymi kleszczami, obierając kwiaty u podstawy szypułek, aż trudno będzie je zobaczyć gołym okiem.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy wykonaj szczelinę w agarozie w naczyniu preparacyjnym i posadź podstawę kwiatostanu w grubym agarze. Daje to dobre, solidne wsparcie dla dalszego drobnego rozbioru młodszych kwiatów w celu odsłonięcia SAM.</li>
	<li>Usuń pozostałe pąki kwiatowe, dociskając je kleszczami, zaczynając od najstarszych i kolejno przechodząc do młodszych etapów pod mikroskopem preparacyjnym, aż SAM będzie widoczny. SAM jest zwykle odsłaniany, gdy usuwane są starsze kwiaty do stadium 6 do 7. Po odsłonięciu SAM należy uniknąć odwodnienia próbki, szybko przechodząc do następnego kroku.</li>
</ol>
4. Transfer i wzrost hodowlanych SAM
<ol>
	<li>Umieść świeżo wypreparowaną próbkę, jak opisano w sekcji 1, w pożywce wzrostowej w prostokątnym plastikowym pudełku hodowlanym na zawiasach, z SAM odsłoniętym nad powierzchnią pożywki. Dodaj kilka kropli sterylnej wody dejonizowanej do krawędzi pudełek hodowlanych i zamknij pokrywę, aby utrzymać wilgotność wewnątrz pudełka. Upewnij się, że dodana woda nie zakrywa SAM.</li>
	<li>Zamknij pokrywę i owiń pudełko taśmą z mikroporami. Umieścić pojemnik wzrostowy w warunkach długiego dnia lub ciągłego dnia w temperaturze 22 °C i rosnąć przez 12–24 godziny, aby umożliwić SAM regenerację po procedurze preparacji i dostosowanie się do warunków hodowli.</li>
</ol>
5. Obrazowanie SAM
<ol>
	<li>Napełnij pudełko hodowlane zawierające SAM sterylną wodą dejonizowaną, aby przykryć próbkę. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, mocno rozpylając wodę skierowaną na próbkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umieść pudełko hodowlane na pionowym stoliku mikroskopu konfokalnego. Uważaj, aby pudełko hodowlane nie stykało się z obiektywami mikroskopu. Użyj długodystansowej soczewki do zanurzania w wodzie 40x lub 60x o aperturze numerycznej 0,8-1, która jest optymalna do obrazowania bez szkła nakrkowego.</li>
	<li>Opuść obiektyw do wody i sprawdź, czy na przedniej soczewce obiektywu nie utworzyły się pęcherzyki powietrza. Usuń wszelkie pęcherzyki, obniżając stolik i delikatnie przecierając soczewkę chusteczką optyczną i dodając niewielką ilość wody do przedniej soczewki obiektywu za pomocą pipety Pasteura przed ponownym zanurzeniem w wodzie.</li>
	<li>Korzystając z filtra GFP i modułu epi-illumination mikroskopu konfokalnego, wyreguluj kontroler XY, aby zlokalizować próbkę. Regulując położenie okularów, umieść SAM bezpośrednio pod źródłem światła i ustaw ostrość wzdłuż osi Z, aż wierzchołek znajdzie się w miejscu. 
	UWAGA: Nie patrz bezpośrednio na światło ultrafioletowe.</li>
	<li>Po znalezieniu próbki należy ją oświetlić za pomocą lasera zdolnego do wzbudzania GFP (tj. źródła laserowego o długości fali 488 nm lub 496 nm). Dostosuj zoom optyczny mikroskopu tak, aby cały SAM i zawiązki kwiatowe etapu 1 znajdowały się w polu view. Dalej dostosuj moc wyjścia lasera i ustawienia wzmocnienia, aby zapewnić optymalny stosunek sygnału do szumu. 
	UWAGA: Wysoka intensywność lasera spowoduje fotowybielanie próbki. Paleta niedoświetlenia i prześwietlenia pomaga zapewnić lepszą regulację tych ustawień.</li>
	<li>Pozwól próbce osiąść na 2-5 minut. Uzyskaj konfokalne stosy Z próbki w odstępach 0,25 μm-0,5 μm Z w rozdzielczości około 0,3 μm o rozmiarze piksela. Upewnij się, że całkowity czas obrazowania wymagany do pobrania stosów Z dla jednej próbki nie przekracza 10 minut od momentu zanurzenia próbki w wodzie do zakończenia akwizycji.</li>
	<li>Natychmiast usuń wodę i przenieś pudełko hodowlane z powrotem do komory wzrostowej. Trzymanie próbek przez długi czas pod wodą wpłynie na stan osmotyczny komórek.</li>
</ol>
6. Mikromechaniczne zakłócenia SAM
<ol>
	<li>Skonfiguruj warunki obrazowania zgodnie z opisem w punkcie 5 i uzyskaj stosy obrazów preablacji organizacji mikrotubul korowych.</li>
	<li>Zdekantować wodę w naczyniu do hodowli. Wykonać ablację za pomocą czystej igły strzykawkowej (0,4 mm x 20 mm).
	<ol>
		<li>Używając mikroskopu preparacyjnego, ostrożnie przytrzymaj igłę i powoli zbliż się do SAM. 
		UWAGA: Wstrzymywanie oddechu i posługiwanie się igłą z luźnym uchwytem pomaga uniknąć potrząsania.</li>
		<li>Krótko zetknij się z kopułą SAM z końcówką igły, aby potwierdzić, że ablacja została wykonana. Najlepiej wykonać ablację na obrzeżach SAM, co pozwala na wizualizację zachowania i przejścia niezorganizowanych mikrotubul korowych w centralnej części kopuły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij naczynie hodowlane sterylną wodą dejonizowaną i dodaj idodek propidyny (10 μg/ml). Oprócz monitorowania sygnału mikrotubul korowych GFP, wizualizacja jodku propidyny za pomocą oddzielnego kanału może wyraźnie oznaczyć obszary komórek poddanych ablacji. Jodek propidyny jest oświetlany za pomocą lasera o długości fali 561 nm lub innego odpowiedniego lasera o emisji rejestrowanej w zakresie 600-650 nm.</li>
	<li>Natychmiast po ablacji należy pobrać stosy obrazów (patrz punkt 6) i powtarzać proces akwizycji co 2 godziny przez okres 6 godzin. Po każdym punkcie czasowym należy zwrócić szalkę hodowlaną wraz z próbką do komory inkubacyjnej. Upewnij się, że na pożywce hodowlanej pozostało trochę wody i owiń naczynie hodowlane taśmą z mikroporami, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
</ol>
7. Wizualizacja danych i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Generuj rzuty powierzchni za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak MORPHOGRAPHX11, FIJI12 lub makro SurfCut13.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję anizotropii mikrotubul korowych za pomocą makro FibrilTool14 w FIJI. 
	UWAGA: Szczegółowe protokoły korzystania z oprogramowania można uzyskać z odpowiednich cytatów.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ocena zdarzeń mechanicznej transdukcji sygnału ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji regulatorów molekularnych zaangażowanych w szlaki mechano-percepcji i transdukcji. Opisany tutaj protokół zapewnia ilościowy wgląd w takie zdarzenia poprzez wykorzystanie odpowiedzi mikrotubul korowych jako odczytu dla takiego procesu w SAM Arabidopsis. Opisana tutaj procedura jest rutynowo stosowana w kilku badaniach na różnych typach tkanek 16,17,18,19.<su...

Komórki roślinne są otoczone zewnątrzkomórkową matrycą polisacharydów i glikoprotein, która mechanicznie przypomina materiał kompozytowy wzmocniony włóknami, zdolny do dynamicznej zmiany swoich właściwości mechanicznych1. Wzrost w komórkach roślinnych jest napędzany przez pobieranie wody do komórki, co powoduje jednoczesne narastanie sił rozciągających na ścianę komórkową. W odpowiedzi na takie siły modyfikacje stanu fizycznego ściany komórkowej pozwalają na ekspansję komórki. Komórki ze ścianami pierwotnymi są zdolne do szybkiego wzrostu w porównaniu z wtórną ścianą komórkową zawierającą komórki, głównie ze względu na różnice w składzie chemicznym zawartych w nich polisacharydów. Pierwotne komórki ściany składają się z celulozy, hemicelulozy i pektyny oprócz glikoprotein i nie mają ligniny, składnika obecnego w wtórnej ścianie komórkowej2. Celuloza, polimer glukozy połączony wiązaniami β-1,4, jest głównym składnikiem ścian komórkowych. Jest zorganizowany w struktury fibrylarne, które są w stanie wytrzymać duże siły rozciągające występujące podczas wzrostu komórek3. Oprócz wytrzymywania sił rozciągających, zbrojenie mechaniczne w kierunku preferencyjnym powoduje rozszerzanie się turgoru wzdłuż osi prostopadłej do orientacji netto mikrofibryla celulozowego. Na organizację mikrowłókien celulozy ma wpływ cytoszkielet mikrotubul korowych, ponieważ kierują one ruchem kierunkowym kompleksów syntetyzujących celulozę znajdujących się na błonie komórkowej4. Dlatego monitorowanie organizacji mikrotubul korowych za pomocą białka związanego z mikrotubulami lub tubuliny połączonej z cząsteczką fluorescencyjną służy jako wskaźnik zastępczy do obserwacji nakładających się wzorów celulozy w komórkach roślinnych.
Wzór cytoszkieletu mikrotubul korowych jest pod kontrolą sił mechanicznych pochodzących z morfologii komórek i tkanek. Organizacja mikrotubul korowych nie ma żadnej preferencyjnej organizacji w czasie w komórkach znajdujących się na wierzchołku SAM, podczas gdy komórki na obrzeżach i granicy między SAM a wyłaniającym się narządem mają stabilny, wysoce zorganizowany nadkomórkowy układ mikrotubul korowych5. Opracowano kilka podejść mających na celu fizyczne zakłócenie stanu mechanicznego komórek. Zmiany stanu osmotycznego, a także leczenie związkami farmakologicznymi i enzymatycznymi, które wpływają na sztywność ściany komórkowej, mogą powodować późniejsze zmiany sił rozciągających doświadczanych przez komórkę6,7. Inną alternatywą jest zastosowanie urządzeń, które pozwalają na stopniowy wzrost sił ściskających odczuwanych przez tkanki8. Wykazano również, że zastosowanie sił odśrodkowych wpływa na siły mechaniczne bez fizycznego kontaktu z komórkami9. Jednak najpowszechniej stosowany sposób zmiany sił kierunkowych w grupie komórek wykorzystuje fakt, że wszystkie komórki naskórka są pod napięciem, a fizyczna ablacja komórek wyeliminuje lokalnie ciśnienie turgoru, a także zakłóci adhezję między komórkami, modyfikując w ten sposób siły rozciągające doświadczane przez sąsiednie komórki. Odbywa się to albo poprzez celowanie w impulsowy laser ultrafioletowy o dużej mocy, albo za pomocą cienkiej igły.
Tutaj omawiamy proces obrazowania i oceny zachowania mikrotubul korowych pod kątem zakłóceń mechanicznych w SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>taśma mikroporowa</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Metody Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>mio-inozytol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benzyladenina</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>kwas nikotynowy</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pudełko na zawiasach</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Roślinna mieszanina konserwująca)</td><td>Technologia komórek roślinnych</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek pirydoksyny</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>chlorowodorek tiaminy</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Zrozumienie regulacji wzrostu i morfogenezy na poziomie komórek i tkanek było głównym tematem badań biologicznych przez wiele dziesięcioleci. Postępy w technologiach molekularnych i obrazowania pozwoliły nam uzyskać wgląd w to, w jaki sposób sygnały biochemiczne wpływają na zdarzenia morfogenetyczne. Jednak coraz bardziej oczywiste jest, że oprócz sygnałów biochemicznych, sygnały mechaniczne wpływają również na kilka aspektów wzrostu komórek i tkanek. Merystem wierzchołkowy rzodkiewnika (SAM) to struktura w kształcie kopuły odpowiedzialna za wytwarzanie wszystkich narządów nadziemnych. Organizacja cytoszkieletu mikrotubul korowych, który pośredniczy w odkładaniu się celulozy apoplastycznej w komórkach roślinnych, jest przestrzennie odrębna. Wizualizacja i ilościowa ocena wzorców mikrotubul korowych są niezbędne do zrozumienia biofizycznej natury komórek w SAM, ponieważ celuloza jest najsztywniejszym elementem ściany komórkowej rośliny. Stereotypowa forma organizacji mikrotubul korowych jest również konsekwencją sił fizycznych obejmujących całą tkankę występujących w SAM. Perturbacja tych sił fizycznych i późniejsze monitorowanie organizacji mikrotubul korowych pozwala na identyfikację białek kandydujących zaangażowanych w pośredniczenie w mechanopercepcji i transdukcji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pomaga badać takie procesy.

Rysunek 1 przedstawia typowe obrazy projekcyjne uzyskane z linii MBD-GFP, w których komórki w centrum kopułki wykazują zdezorganizowane mikrotubule korowe, a komórki na obrzeżach wykazują rozkład obwodowy (Rysunek 1A,B), podczas gdy komórki domeny granicznej zawierają mikrotubule korowe ułożone równolegle do długiej osi komórki. Obserwacje te wykazują różnice w przestrzennym rozkładzie mikrotubul korowych w różny...

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Ten protokół pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób zachowanie cytoszkieletu mikrotubul zachodzi w roślinach. Jednocześnie pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób te elementy strukturalne, które wpływają na kształt komórek i narządów, reagują na zmiany sił mechanicznych. Chociaż metoda ta wymaga niewielkiego wyrafinowania, zapewnia solidny, ilościowy odczyt różnic w odpowiedzi mechanicznej między różnymi genotypami i warunkami.Zacznij od uprawy nasion arabidopsis z ekspresją domen wiążących mikrotubule połączonych z zielonym białkiem fluorescencyjnym w glebie, w temperaturze 20 i 6 stopni Celsjusza w warunkach długiego dnia przez tydzień. Po wykiełkowaniu przenieś sadzonki do nowych doniczek z wystarczającą przestrzenią do wzrostu, aby umożliwić silny wzrost wegetatywny, i umieść rośliny w temperaturze 20 i 16 stopni Celsjusza w krótkich warunkach dziennych. Po trzech do pięciu tygodniach przenieś rośliny z powrotem do warunków długiego dnia w tej samej temperaturze, aż rośliny się zakręcą, pozwalając kwiatostanowi urosnąć do dwóch do pięciu centymetrów długości.W przypadku rozwarstwienia merystema wierzchołkowego pędu umieść kwiatostan i użyj ostrych kleszczy, aby obrać kwiaty u podstawy szypułek, aż trudno będzie zobaczyć szypułki gołym okiem, aby usunąć starsze pąki kwiatowe. Użyj kleszczy, aby utworzyć szczelinę w agros w naczyniu preparacyjnym i posadź podstawę kwiatostanu w grubym Augur. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym.Zaczynając od najstarszego pąka kwiatowego, popchnij kleszczami, aby usunąć pączek kwiatowy z rośliny. Merystem wierzchołkowy pędu jest zwykle odsłaniany, gdy usuwa się starsze kwiaty do etapu od szóstego do siódmego. I użyj kleszczy, aby popchnąć każdy pączek kwiatowy w dół, aż widoczny będzie merystem wierzchołkowy pędu.Jak tylko merystem wierzchołkowy pędu zostanie odsłonięty, pozwól świeżo wypreparowanej próbce umieścić ją w pożywce wzrostowej w wysterylizowanym etanolem prostokątnym plastikowym pudełku hodowlanym na zawiasach z merystemem wierzchołkowym pędu tuż odsłoniętym nad powierzchnią pożywki. Dodaj kilka kropli sterylnej wody dejonizowanej do krawędzi pudełka hodowlanego i zamknij pokrywę, aby utrzymać wilgotność wewnątrz pudełka. Owiń pudełko taśmą z mikroporami i umieść pudełko do wzrostu w długich lub ciągłych warunkach dziennych w temperaturze 22 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin.Gdy roślina wyzdrowieje po procedurze preparacji, przykryj próbkę sterylną wodą dejonizowaną i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieś pudełko hodowlane do pionowego stolika mikroskopu konfokalnego i wybierz soczewkę do zanurzania w wodzie 40 lub 60X. Opuść obiektyw do wody i sprawdź, czy na przedniej soczewce obiektu nie ma pęcherzyków powietrza.Aby usunąć pęcherzyki, opuść stolik i delikatnie przetrzyj obiektyw chusteczką optyczną. Następnie za pomocą pipety Pasteura dodaj niewielką ilość wody do przedniej soczewki obiektywu przed ponownym zanurzeniem soczewki w wodzie. Następnie użyj filtra GFP i modułu epi-illumination mikroskopu konfokalnego, aby wyregulować kontroler XY w celu zlokalizowania próbki.Regulując położenie okularów, umieść merystem wierzchołkowy pędu bezpośrednio pod źródłem światła i ustaw ostrość wzdłuż osi Z, aż znajdzie się wierzchołek. Użyj lasera zdolnego do wzbudzenia GFP, aby oświetlić próbkę i dostosuj zoom optyczny mikroskopu tak, aby cały merystem wierzchołkowy pędu i zawiązki kwiatowe pierwszego stopnia znajdowały się w polu widzenia. Następnie dostosuj moc wyjścia lasera i ustawienia wzmocnienia, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu.Po pozostawieniu próbki na osiadanie przez dwie do pięciu minut, uzyskaj konfokalne stosy Z próbki w odstępach od 0,25 do 0,5 mikrometra Z, dodając rozdzielczość około 0,3 mikrometra piksela. Pod koniec akwizycji natychmiast usuń wodę i przenieś pudełko hodowlane z powrotem do komory wzrostowej. W przypadku perturbacji merystemów wierzchołkowych pędów mikromechanicznych należy uzyskać stosy obrazów sprzed ablacji organizacji mikrotubul korowych, jak właśnie pokazano, i przelać wodę bezkofeinową z pudełka hodowlanego do naczynia hodowlanego.Przenieś merystem wierzchołkowy pędu pod mikroskopem preparacyjnym i powoli zbliżaj się do merystema wierzchołkowego pędu czystą igłą strzykawkową o wymiarach 0,4 na 20 milimetrów. Krótko zetknąć końcówką igły z obrzeżem kopuły merystemu wierzchołkowego pędu, aby potwierdzić, że ablacja została zakończona. I napełnij naczynie hodowlane sterylną wodą dejonizowaną.Następnie dodaj 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny do naczynia i natychmiast uzyskuj stosy obrazów, jak pokazano, co dwie godziny przez sześć godzin, zwracając szalkę hodowlaną do inkubacji między każdym punktem czasowym. W celu analizy danych wygeneruj projekcje powierzchniowe stosów obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu i wykonaj ekstrakcję anizotropii mikrotubul korowych za pomocą narzędzia Fibril Tool Macro na Fidżi. Tutaj można zaobserwować typowe obrazy projekcyjne uzyskane z linii GFP wiążących domenę mikrotubul z komórkami w środku kopuły zawierającymi zdezorganizowane mikrotubule korowe, komórkami na obrzeżach, o rozmieszczeniu obwodowym i komórkami domeny granicznej zawierającymi mikrotubule korowe ustawione równolegle do długiej osi komórki.Obrazowanie poklatkowe pokazuje, że ułożenie mikrotubul korowych zmienia się z wysoce nieuporządkowanej w bardziej uporządkowaną matrycę w ciągu sześciu godzin od ablacji. Tensory można nakładać na obrazy mikrotubul korowych, a wyodrębnione informacje można reprezentować, wykreślając średnią anizotropię w czasie. Dostosowując ustawienia mocy wyjściowej lasera i wzmocnienia, powinniśmy upewnić się, że zapewnia wyraźną obserwację włókien i starać się unikać prześwietlenia, ponieważ nadmiernie nasycone sygnały mogą zakrzywić kierunek rozciągania w późniejszej analizie.Mikroskopia sił atomowych może być również przeprowadzona w celu oceny, w jaki sposób zmiany sił mechanicznych faktycznie wpływają na fizyczny stan ściany komórkowej.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę obrazowania cytoszkieletu mikrotubul w merystemie wierzchołkowym Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościową analizę odpowiedzi mikrotubul na siły mechaniczne w żywych komórkach roślinnych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Przeglądaj więcej filmów