Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej
7 października 2020
Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.
Protokół ten zapewnia metodę izolowania kardiomiocytów w kształcie pręcików z dowolnej tkanki serca, która może być następnie wykorzystana do pomiaru ploidalności i stanu zarodkowania tych kardiomiocytów bez ręcznej analizy. W porównaniu z innymi technikami, nasz protokół zapewnia bardziej spójną wydajność komórek i morfologię komórek, a w przeciwieństwie do cytometrii przepływowej jesteśmy w stanie wizualnie zweryfikować stan zarodkowania i ploidalności kardiomiocytów. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ podział i skojarzenie tkanki serca jest łatwiejsze do docenienia.
Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy w pozycji leżącej na plecach i przyklejenia taśmą wyprostowanych kończyn. Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Następnie przetnij aortę zstępującą i żyłę główną jelita.
Użyj pompy perystaltycznej dołączonej do zestawu infuzyjnego z igłą motylkową o rozmiarze 23, aby wykonać perfuzję serca, wstrzykując trzy mililitry roztworu PBS chlorku potasu przez lewą komorę. Uważaj, aby nie przebić przegrody nosowej. Następnie wstrzyknij 10 mililitrów 4% roztworu PFA przez 10 minut w tempie jednego mililitra na minutę.
Użyj nożyczek, aby usunąć całe serce. W razie potrzeby wyizoluj określony region. Umieść tkankę w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr 4% roztworu PFA.
Inkubuj go na bujaku przez godzinę. Umieść serce na szalce Petriego z roztworem PBS. Ściśnij go, aby pozbyć się pozostałego PFA w komorach i umyj go w PBS.
Umieść nieruchome serce w nowej 1,5-mililitrowej probówce zawierającej roztwór kolagenianu. Następnie inkubuj serce na bujaczku w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umieść serce na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej roztwór kolagenianu i rozdziel je na milimetrowe kawałki za pomocą kleszczy lub nożyczek.
Następnie użyj pipety transferowej, aby dalej rozcierać zdysocjowaną tkankę przez dwie minuty. Jeśli cząstki tkanki nadal pozostają, użyj pipety z węższą końcówką i kontynuuj rozcieranie, aż większość tkanki zostanie rozbita. Umieść nylonową siatkę o grubości od 200 do 600 mikrometrów na 15-milimetrowej probówce wirówkowej.
Dodaj pięć mililitrów PBS do zdysocjowanych komórek i przefiltruj je przez nylonową siatkę. Umyj nylonową siatkę, przepuszczając dodatkowe cztery mililitry PBS. Następnie odwirować przefiltrowany roztwór o stężeniu od 10 do 100 razy G przez jedną minutę.
Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS przed barwieniem. Po pobraniu obrazu J na Fidżi otwórz Fidżi i kliknij Pomoc, aktualizacja i zarządzanie witrynami aktualizacji. Sprawdź grupę biomed i wtyczki IFPB.
Aby pobrać wtyczki zależności, ellipse split i morpho lib J.Następnie kliknij zamknij i zastosuj zmiany. Następnie pobierz RStudio i otwórz go. Skopiuj kod z rękopisu tekstowego do wiersza poleceń RConsole i naciśnij enter.
następnie wpisz Y w odpowiedzi na wszystkie monity, aby zainstalować wszystkie nasze zależności. Aby przeprowadzić kwantyfikację obrazu, otwórz Fiji i przeciągnij analizęnukleacji. py do paska stanu.
Gdy otworzy się okno edycji skryptu, kliknij uruchom w lewym dolnym rogu. Pojawi się okno dialogowe z pytaniem o lokalizację katalogu danych wyjściowych. Wybierz folder, w którym będą przechowywane wszystkie dane analityczne, rysunki i inne dane używane przez oprogramowanie.
W parametrach analizy wybierz lokalizację obrazów, które mają być analizowane, i wprowadź format nazwy pliku obrazu za pomocą wyrażeń regularnych. Po wybraniu żądanych ustawień należy kliknąć OK.As na ekranie pojawiają się obrazy z różnych etapów potoku analizy, sprawdź je, aby upewnić się, że progowanie i segmentacja zachodzą prawidłowo. Otwórz analyzemultinucleatedserver.
r w Rstudio. Następnie w zmiennej o nazwie folder name wpisz ścieżkę pliku do folderu danych wyjściowych wybranego w ostatnim kroku bez ostatniego ukośnika. Kliknij uruchom aplikację w lewym górnym rogu okna edycji skryptu.
Użyj suwaków, aby ustawić progi dla minimalnego ważnego progu średniej intensywności jądra, minimalnego ważnego progu obszaru jądrowego i maksymalnej ważnej minimalnej średnicy fretki dla kardiomiocytów. Przewiń w dół i kliknij przycisk Zastosuj wybrane progi, a następnie kliknij przycisk Wykres rozkładu intensywności, który spowoduje wyświetlenie wykresu rozkładu intensywności jądra całej próbki, a także oddzielnych wykresów podrzędnych dla każdej zmiennej grupującej. Aby uwzględnić zmienność wewnątrz próby, przewiń w dół i zaznacz opcję Normalizuj oddzielnie według grupy, a następnie kliknij Oblicz ploidalność i wykreśl szacowany rozkład ploidalności.
Gdy pojawi się znormalizowany wykres całej próbki, powinny być widoczne dwa wzorce szczytów. Użyj suwaków i wybierz progi, aby odizolować piki diploidalne i tetraploidalne od siebie i wartości odstających. Następnie przewiń w dół i kliknij oblicz ploidalność i zarodkowanie.
Na koniec kliknij przycisk wykres i zapisz w folderze wyników. Metoda ta może być stosowana do izolowania jednolicie pojedynczych kardiomiocytów, które są stosunkowo czyste bez zanieczyszczania komórek. Jest łatwy do wdrożenia i zapewnia stałą wydajność i jakość kardiomiocytów z różnych izolacji.
Kardiomiocyty wyizolowane za pomocą tego protokołu mogą być barwione za pomocą przeciwciał i azydków sprzężonych z fluorochromem. Aby pokazać charakterystyczny wzór barwienia linii Z sarkomerów, komórki wybarwiono przeciwciałami rozpoznającymi alfa aktyninę. W oddzielnym eksperymencie EdU podawano myszom przed wyizolowaniem utrwalonych kardiomiocytów.
Po izolacji wykryto kardiomiocyty jednojądrowe, dwujądrowe i trójjądrowe, które przeszły fazę S. Aby zidentyfikować poszczególne jądra, oryginalny obraz barwiony DNA został określony progowo na podstawie intensywności. Do masek jądrowych dopasowano elipsy, dzielące poszczególne jądra na segmenty.
Następnie piksele obrazu zostały podzielone na terytoria w oparciu o elipsę, do której są najbardziej bliskie, a granice tych terytoriów wykorzystano do narysowania linii przechodzących przez klastry jądrowe. Podobny proces segmentacji zastosowano do wykrywania kardiomiocytów. Ta strategia segmentacji wykazała, że większość kardiomiocytów nowonarodzonych myszy jest jednojądrowata.
Częstość występowania kardiomiocytów jednojądrowych jest znacznie niższa u myszy dwutygodniowych, gdzie stanowią one około 25% całej populacji kardiomiocytów. Kiedy mierzono status ploidalności poszczególnych jąder w kardiomiocytach, u młodych myszy wykryto większą częstość występowania jąder tetraploidalnych. Podczas izolowania kardiomiocytów ważne jest, aby sprawdzić, czy wszystkie grudki komórek rozpadły się po ich roztarciu.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na opracowaniu powtarzalnej metody izolacji kardiomiocytów z tkanki serca osobników dorosłych w celu pomiaru zawartości ich DNA oraz stanu nukleacji. Metoda ta zapewnia stałą wydajność uzyskiwania komórek i umożliwia wizualną weryfikację nukleacji oraz ploidii kardiomiocytów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Izolacja kardiomiocytów
- Pomiar ploidii i nukleacji
- Analiza morfologii komórek
Wstęp
- Znaczenie kardiomiocytów w funkcji serca
- Potrzeba niezawodnych technik izolacji
- Porównanie z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa
Zastosowane metody
- Perfuzja i sekcja tkanki serca
- Zastosowanie roztworu PBS z chlorkiem potasu do izolacji
- Analiza obrazu z wykorzystaniem oprogramowania Fiji i RStudio w celu ilościowego oznaczenia nukleacji i ploidii
Główne wyniki
- Pomyślne wyizolowanie pręcikowatych kardiomiocytów
- Wykazanie wizualnego potwierdzenia nukleacji i ploidalności
- Wyniki wykazały spójną wydajność i morfologię wyizolowanych komórek
Wnioski
- Metoda ta zapewnia prosty i niezawodny sposób izolacji kardiomiocytów.
- Badanie to ma istotne znaczenie dla przyszłych badań nad biologią kardiomiocytów oraz chorobami serca.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja i analiza ilościowa kardiomiocytów z utrwalonej tkanki serca rozwiązuje kluczowy problem w procesie walidacji celów kardiologicznych oraz redukcji ryzyka mechanistycznego. Niniejszy protokół umożliwia spójną ocenę nukleacji i ploidalności, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w translacyjnych badaniach kardiologicznych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji portfelowych, zapewniając powtarzalne, zachowujące morfologię wyniki komórkowe do dalszej immunocytochemii oraz analizy zawartości DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę biologii kardiomiocytów w celu walidacji celów w modelach chorób serca.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji i kwantyfikacji nukleacji oraz ploidii.
- Ułatwia odtwarzalne przygotowanie próbek, redukując niejednoznaczność biologiczną w badaniach na wczesnym etapie.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane populacje kardiomiocytów z zachowaną morfologią do immunocytochemii i analiz ilościowych.
- Poprawia powtarzalność i porównywalność testów między eksperymentami poprzez minimalizację zmienności między próbkami.
- Umożliwia wiarygodną późniejszą ocenę wpływu związków na strukturę kardiomiocytów i zawartość DNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki komórkowe z punktami końcowymi istotnymi dla choroby, takimi jak ploidalność i status nukleacji.
- Wspiera ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając spójną charakterystykę fenotypową.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, dostarczając ilościowych, opartych na obrazowaniu parametrów komórkowych do porównań między badaniami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając izolację kardiomiocytów z utrwalonych tkanek, obrazowanie ilościowe oraz zautomatyzowaną analizę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez bezpośredni pomiar cech jądra kardiomiocytów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, gotowe do analizy populacje komórek do immunobarwienia i analizy zawartości DNA.
- Analityka: Zapewnia zautomatyzowane, ilościowe wyniki dotyczące nukleacji i ploidalności, co ułatwia porównywanie warunków i zapewnia rygor statystyczny.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie fenotypów komórkowych do modeli chorób i strategii biomarkerowych.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Oferuje zestandaryzowany przepływ pracy, który można dostosować do różnych typów tkanek serca i ustawień eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność izolacji oraz analizy kardiomiocytów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkryć w kardiologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana biegłość w obchodzeniu się z tkanką serca oraz w ilościowej analizie obrazu.
- Niezbędny dostęp do sprzętu perfuzyjnego, mikroskopii oraz platform analizy komputerowej (Fiji, RStudio).
- Wymagana standaryzacja parametrów przygotowania próbek i analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda możliwa do adaptacji dla różnych źródeł tkanki serca i etapów rozwoju.
- Dokładna kwantyfikacja jąder zależy od rygorystycznego progowania i segmentacji.
