Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

Praktyka stosowania składników botanicznych w celu poprawy zdrowia sięga tysięcy lat wstecz. W ostatnim czasie zwiększony popyt w połączeniu z niezrównoważonymi praktykami zbiorów i zmianami klimatycznymi wywarły presję na łańcuch dostaw. Z tego powodu zafałszowania botaniczne stają się coraz większym problemem, co sprawia, że identyfikacja botaniczna staje się coraz bardziej istotną częścią kontroli jakości.

Idealnie byłoby, gdyby identyfikacja była przeprowadzana jak najbliżej źródła, dzięki czemu zasoby mogą być efektywnie alokowane do materiału o prawidłowej tożsamości. Istnieje wiele podejść do identyfikacji botanicznej. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna odbywa się za pomocą oceny morfologicznej i chemicznych metod analitycznych.

Identyfikacja morfologiczna opiera się na różnicach w cechach makroskopowych i mikroskopowych materiałów roślinnych. Wymaga jednak dobrze wyszkolonego botanika, a jego zastosowanie do sproszkowanych materiałów botanicznych jest ograniczone. Chemiczne metody analityczne są szeroko stosowane w farmakopeach i laboratoriach, ale nie są idealne do badań terenowych ze względu na rozmiar przyrządów i wymagania środowiskowe.

Ostatnio metody genomiczne pojawiły się jako alternatywna technika identyfikacji gatunków botanicznych ze względu na wysoką wierność i specyficzność informacji genomicznej w materiałach roślinnych. Dzięki narzędziom do diagnostyki molekularnej dostępnym obecnie w formie urządzeń przenośnych, takie podejście staje się możliwe do zastosowania w terenie. Celem tego protokołu jest wprowadzenie metody identyfikacji botanicznej w sytuacjach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, np. gospodarstwo dostarczające materiał botaniczny, przy użyciu przenośnego systemu qPCR.

Matricaria chamomilla, powszechnie znana jako rumianek niemiecki, od wieków była stosowana jako lek ziołowy w celu promowania zdrowia. Aby ukazać specyfikę obecnej metody, dla porównania uwzględniono różnicowanie rumianku niemieckiego od innego powszechnie stosowanego kwiatu rumianku, znanego jako rumianek rzymski. Procedura identyfikacji pola została zademonstrowana w środku niemieckiej farmy rumianku.

Ustaw obszar testowy w terenie z płaską i poziomą powierzchnią. Zidentyfikuj reprezentatywną roślinę, która odzwierciedla cechy większości roślin na polu kwiatów rumianku. Zbierz główkę kwiatu z reprezentatywnej rośliny za pomocą sterylnych rękawiczek.

Umieść próbkę w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 mililitra. Powtórz i zbierz ulotkę o długości około 0,5 do 0,7 centymetra z tej samej rośliny. Rozgrzej inkubator w suchej kąpieli do 95 stopni Celsjusza.

Do każdej probówki zbiorczej dodaj 100 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego. Aby uzyskać lepszą wydajność ekstrakcji DNA, zmiel próbkę za pomocą tłuczka do tkanek. Zamknij rurkę.

Upewnij się, że tkanka botaniczna jest pokryta roztworem ekstrakcyjnym przez cały proces ekstrakcji. Umieść probówki do pobierania w podgrzewanym inkubatorze do suchej kąpieli i inkubuj probówki do pobierania w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut Po 10 minutach wyjmij probówki z inkubatora do suchej kąpieli. Dodać 100 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego z zestawu do ekstrakcji DNA i wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.

Powtórz ten sam krok w przypadku ekstrakcji ulotki. Wstrząśnij, aby jeszcze bardziej wymieszać roztwór. Problem z roślinami zwykle nie wydaje się być zdegradowany po tym zabiegu.

Kolor płynu może się zmienić i stać się mętny. Skonfiguruj warunki termocyklingu instrumentu qPCR zgodnie z tabelą pierwszą, która rozpoczyna się od stałego kroku temperatury dla początkowej denaturacji, po którym następuje 25 cykli amplifikacji, a kończy się wzrostem temperatury w celu uzyskania krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości. Przed użyciem rozmrozić główną mieszankę qPCR i startery wymienione w tabeli drugiej w temperaturze pokojowej.

Zaplanuj reakcję, która zostanie załadowana do każdej studzienki. Studzienki zawierające kontrole dodatnie z gatunkami docelowymi, kontrole dodatnie z gatunkami niebędącymi gatunkami docelowymi, próbki i kontrole ujemne. W tym przykładzie użyto 10 dołków, pięć do niemieckiego testu identyfikacji rumianku i kolejne pięć do testu identyfikacji rumianku rzymskiego.

W odniesieniu do każdego rodzaju badania identyfikacji gatunku jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunku docelowego, jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków niedocelowych, dwie studzienki wypełnia się próbkami DNA kwiatów i liści pobranymi z pola, a jedną studzienkę przydziela się do kontroli ujemnej. Tabela trzecia opisuje każdy typ studzienki. Przygotować wzorcową mieszaninę reakcji zgodnie z tabelą czwartą dla każdego badania identyfikacji gatunku botanicznego.

Typowa mieszanka wzorcowa reakcji zawiera uniwersalną mieszankę wzorcową qPCR, dwukrotne, startery specyficzne dla gatunku do przodu i do tyłu oraz wodę wolną od nukleaz. Przed użyciem dokładnie wymieszać główną mieszankę reakcyjną przez pipetowanie. Umieść wkład reakcyjny PCR stroną zadrukowaną do góry na płaskiej i stabilnej powierzchni.

Załadować 18 mikrolitrów głównej mieszanki reakcyjnej skonfigurowanej w poprzednim kroku do dołków nabojowych zgodnie z dołkami zdefiniowanymi tutaj. W tej demonstracji dodaj niemiecką mieszankę wzorcową reakcji testu identyfikacji rumianku do studzienek oznaczonych do testu GC, GCT w studzienkach pierwszym, trzecim, piątym, siódmym, dziewiątym i główną mieszankę testową testu identyfikacji rumianku rzymskiego do studzienek oznaczonych do testu RC, RCT w studzienkach drugich, czwartych, sześciu, ośmiu, 10. Przenieść dwa mikrolitry próbki DNA z supernatantu probówek do ekstrakcji DNA i wstępnie wyekstrahowanych kontroli dodatnich DNA do studzienek z wkładami wstępnie załadowanymi mieszanką wzorcową qPCR.

Po dodaniu każdej matrycy DNA do głównej mieszanki qPCR, delikatnie wymieszać roztwór, pipetując. Ostrożnie uszczelnij wkład folią samoprzylepną. Załaduj wkład do komory termocyklingowej i zamknij ją.

Ustaw urządzenie qPCR tak, aby działało. W obecnym protokole barwnik interkalacyjny jest używany do pomiaru amplifikacji docelowych fragmentów w czasie rzeczywistym. Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli wymaganych do przekroczenia przez sygnał fluorescencyjny wstępnie zdefiniowanego progu.

Wartość Ct mniejsza niż 25 cykli została uznana za dodatnie wzmocnienie. Na tym rysunku rzymska kontrola pozytywna została tylko wzmocniona w teście identyfikacji rumianku rzymskiego, ale nie w niemieckim teście identyfikacyjnym rumianku. Niemiecka kontrola pozytywna rumianku i próbki terenowe zostały tylko amplifikowane w niemieckim teście identyfikacji rumianku, ale nie w teście identyfikacji rumianku rzymskiego.

Kontrola ujemna nie została wzmocniona w żadnym z testów. Aby dodatkowo potwierdzić specyficzną amplifikację w kontrolach pozytywnych i próbkach, frakcje PCR i produkty z każdej studzienki przeprowadzono w laboratorium na 2% żelu agarozowym. Wszystkie studzienki o wartości Ct mniejszej niż 25 dały amplikony o oczekiwanych rozmiarach, które różnią się między rumiankiem niemieckim a rumiankiem rzymskim.

Pozostałe tory nie wykazały żadnego konkretnego produktu wzmacniającego, co zgadza się z brakiem sygnału fluorescencyjnego dla tych studni, co zaobserwowano w testach terenowych. Po amplifikacji PCR przeprowadzono analizę krzywej topnienia przy użyciu tego samego oprogramowania, które było używane do monitorowania sygnału fluorescencyjnego. Wraz ze wzrostem temperatury dwuniciowe amplikony zaczynają się dysocjować, co powoduje spadek intensywności fluorescencji.

Zmiany intensywności fluorescencji zostały następnie przekształcone w krzywe pików topnienia w celu dalszego różnicowania rumianku niemieckiego od rumianku rzymskiego na podstawie ich charakterystycznych pików topnienia. Na tym rysunku szczyt topnienia pozytywnej kontroli rumianku niemieckiego wynosi 85,6 stopni Celsjusza i różni się od szczytu topnienia pozytywnej kontroli rumianku rzymskiego. Amplikony PCR z próbek terenowych wytwarzają piki topnienia zbliżone do dodatniej kontroli rumianku niemieckiego.

Tożsamość próbki terenowej określa się na podstawie określonego amplifikacji i charakterystycznej temperatury topnienia, która odpowiada kontrolom. W tym przykładzie zarówno kwiat, jak i liść zebrane na polu są identyfikowane jako Matricaria chamomilla, rumianek niemiecki. Wyniki testu rumianku rzymskiego dla tych dwóch próbek są negatywne.

Protokół demonstruje identyfikację rumianku niemieckiego w terenie za pomocą przenośnego systemu qPCR. Podobne metody możemy opracować, aby poszerzyć portfolio składników botanicznych, które można testować. Mamy nadzieję, że ten film dostarczy cennych materiałów szkoleniowych dla naukowców, nawet osób niebędących ekspertami, do przeprowadzania identyfikacji botanicznej w terenie lub w środowisku o ograniczonym sprzęcie laboratoryjnym.

Testy identyfikacji terenowej oparte na DNA nie tylko dają bardzo dokładne wyniki, które są zgodne z analizą laboratoryjną, ale także skracają czas i koszty związane z tradycyjnymi metodami wykonywanymi w laboratorium.