Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Metoda ta stanowi idealne podejście do badania gojenia się ran okrężnicy oraz zmian molekularnych i histologicznych, które zachodzą po urazie. Metoda ta może również rzucić światło na patogenezę IBD. Główną zaletą tej techniki jest precyzyjna kontrola lokalizacji urazu i czasu procesu gojenia się rany.

Osoby wykonujące tę metodę po raz pierwszy mogą mieć trudności z włożeniem kolonoskopu do okrężnicy myszy i tworzeniem spójnych ran. Powtarzalne praktykowanie tych technik powinno przezwyciężyć te problemy. Biorąc pod uwagę wiele skoordynowanych kroków i niuansów związanych z tą procedurą, wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy włożyć endoskop ze sztywnym otworem o średnicy 1,9 milimetra do osłony endoskopu. I przymocuj zmontowany endoskop do źródła światła i urządzenia do obrazowania wideo zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj dostarczonej rurki, aby podłączyć pompę powietrza do zaworu gazowego po lewej stronie osłony obok kanału roboczego.

Upewnij się, że kanał roboczy jest w pozycji otwartej i włóż trzy francuskie kleszcze do biopsji przez kanał roboczy. Przesuń kleszcze do końca pochwy, nie wystając z pochwy. Następnie umieść znieczuloną mysz na endoskopowej platformie do oceny stopnia zaawansowania po jej brzusznej stronie i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na odruch pedałowania.

Po nałożeniu maści do oczu napełnij trzymililitrową strzykawkę dołączoną igłą do zgłębnika szczura PBS o temperaturze pokojowej. I włóż igłę około jednego centymetra do odbytu myszy. Delikatnie zaparzaj PBS, aż kał zostanie usunięty.

Kilka granulek kału powinno opuścić mysz wraz z PBS, który został podany w infuzji. Włóż zmontowany endoskop na 0,5 centymetra do odbytu i wsuń kleszcze biopsyjne do oczyszczonego światła odbytnicy, aż pełne szczęki kleszczy znajdą się poza końcem pochewki. Obróć kleszcze o 90 stopni, tak aby szczęki otworzyły się w orientacji wschód-zachód i otwórz końcówki i przesuń kleszcze o około jeden centymetr, zamykając i chowając kleszcze jednym płynnym, szybkim ruchem, aby pobrać biopsję.

Aby uniknąć całkowitego wdmuchiwania jelita grubego podczas wykonywania biopsji, pozostaw prawą stronę zaworu gazowego otwartą. Bezpośrednio po biopsji naciśnij pedał nożny przymocowany do urządzenia rejestrującego kolonoskop, aby rozpocząć nagrywanie wideo. I mocno dociśnij palec wskazujący do prawej strony zaworu gazowego, aby całkowicie zakryć otwór, wtłaczając powietrze do endoskopu, a tym samym do okrężnicy.

Wycofaj kleszcze z powrotem z pochwy i do światła odbytnicy w pozycji zamkniętej. I przyłóż kleszcze do ściany odbytnicy bezpośrednio nad raną, aż podstawa szczęk zrówna się z górną krawędzią pola widzenia. Kontynuuj pełne wdmuchiwanie jelita grubego, aż będzie można zaobserwować wyraźny widok rany.

Aby uzyskać najlepsze wymiary łożyska rany, uzbrój się w cierpliwość, a następnie ustaw kolonoskop pod precyzyjnym kątem, aby uzyskać najlepszy obraz łożyska rany. Otwórz film w odpowiednim programie komputerowym i przesuń wideo do klatki pokazującej punkt w czasie, w którym można łatwo zwizualizować łożysko rany. I w którym zamknięte kleszcze znajdują się nad łożyskiem rany i przy ścianie odbytnicy, a ściana jest napięta.

W każdym punkcie czasowym uzyskaj migawkę tej klatki i zakoduj nazwę pliku, aby upewnić się, że pomiary łożysk ran są przeprowadzane w sposób zaślepiony. Aby określić ilościowo rozmiar łożyska rany, otwórz obrazy w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby narysować obwód wokół rany. W obszarze Analiza wybierz pozycję Miara.

Wartość tego pomiaru zostanie automatycznie wypełniona w oknie Wyniki. Po uzyskaniu wszystkich pomiarów oblicz rozmiar rany w kolejnych dniach w stosunku do rozmiaru w dniu zero w arkuszu kalkulacyjnym. W odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym otwórz warstwy skóry i mięśni brzucha, aby odsłonić jamę ciała zwierzęcia doświadczalnego i umieść zamknięte kleszcze pod okrężnicą.

Delikatnie podnieś okrężnicę, aby uwolnić ją z leżącej poniżej krezki i przetnij tkankę w jej środku oraz przy odbycie, aby zebrać ją od myszy. Użyj 20-mililitrowej strzykawki wypełnionej lodowatym PBS i wyposażonej w igłę do szczurów, aby wypłukać zawartość kału. I umieść oczyszczoną dwukropek na kawałku bibuły filtracyjnej.

Otwórz okrężnicę wzdłużnie, uważając, aby strona krezkowa przylegała do bibuły filtracyjnej. I użyj pipety Pasteura, aby pokryć błonę śluzową 0,2% błękitem metylenowym. Po kilku sekundach odcedź nadmiar plamy i obejrzyj okrężnicę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zlokalizować łożysko rany.

Użyj czterocalowych nożyczek Micro Iris, aby przeciąć krawędź łóżka, uważając, aby nie przeciąć warstwy mięśni. I użyj cienkiej pęsety, aby przenieść wyciętą tkankę do probówki w celu zaszybkiego zamrożenia i/lub przechowywania. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym otwórz pobraną okrężnicę wzdłużnie na kawałku bibuły filtracyjnej, krezką do dołu.

Delikatnie przykryj tkankę wybranym utrwalaczem. Przykryj tkankę parafilmem w szczelnie zamkniętym pojemniku na 4 do 6 godzin przed przechowywaniem w 70% etanolu. W dniu przetwarzania należy usunąć parafilm i dodać 0,2% błękitu metylenowego do tkanki, jak pokazano.

Po odsączeniu nadmiaru plamy umieść tkankę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zlokalizować łożysko rany. Za pomocą skalpela z ostrzem numer 10 przeciąć bezpośrednio środek łożyska rany i kontynuować przecinanie pozostałej części okrężnicy w linii prostej, tak aby okrężnica została przecięta na pół wzdłuż. W przypadku kriosekcji należy osadzić kawałki okrężnicy tak, aby strona przecięta skalpelem była skierowana w dół w podstawowej formie do połowy wypełnionej środkiem do zamrażania tkanek.

Zabezpiecz chusteczkę na miejscu delikatną pęsetą i umieść formę bazową na metalowej płytce lub grubej folii aluminiowej na suchym lodzie, aby utwardzić medium zamrażające. Po zamrożeniu dolnej części podłoża napełnij pozostałą objętość formy bazowej środkiem zamrażającym o temperaturze pokojowej. I włóż formę z powrotem do suchego lodu, aż cały blok tkanki zostanie zamrożony.

Następnie przenieś formę do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż do pokrojenia. W tym miejscu pokazano reprezentatywne obrazy akceptowalnych widoków łożyska rany w celu dokładnego ilościowego określenia wielkości łożyska rany i szybkości zamykania rany. W tym widoku ex vivo łożyska rany można zaobserwować wskaźniki obwodu łożyska rany i miejsca, w którym należy przeciąć tkankę, aby umożliwić wizualizację łożyska rany po przekroju.

Na tym reprezentatywnym obrazie można wyraźnie zaobserwować przekrój plamy H i E na łożysku rany. Ważne jest, aby uzyskać natychmiastowe obrazy łożyska rany we wszystkich punktach czasowych, aby zapewnić dokładną ocenę szybkości gojenia się rany. Po biopsji szczypty można wstrzyknąć różne interesujące nas środki do łożyska rany, aby przetestować ich wpływ na szybkość gojenia się rany.