Name: Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Naucz się techniki biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy do badania gojenia ran jelita grubego i zmian molekularnych. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę lokalizacji urazu oraz czasu gojenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (D.C.M.) oraz Fundacji Crohna w Nowym Jorku (D.C.M. i A.J.D.). Autorzy dziękują Pani Carmen Ferrarze za pomoc w stworzeniu filmu towarzyszącego temu artykułowi.

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Weill Cornell Medicine." Do: "Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Weill Cornell Medicine i Stony Brook University.
1. Kolonoskopia i indukcja ran
<ol>
	<li>Wstępnie zmontuj elementy endoskopu, wkładając najpierw endoskop ze sztywnym otworem 1,9 mm do osłony (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-B). Podłącz pompę powietrza (aby zapewnić wdmuchiwanie okrężnicy) za pomocą dostarczonego wężyka do zaworu gazowego po lewej stronie osłony obok kanału roboczego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). 
	UWAGA: Chociaż opisana tutaj soczewka ma kąt 0°, do tego celu można również użyć soczewki 30°.</li>
	<li>Upewnij się, że kanał roboczy jest w pozycji otwartej i włóż 3 kleszczyki do biopsji Fr przez kanał roboczy i przesuń go do końca osłonki (upewniając się, że nie wystaje z osłony) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Przymocuj zmontowany endoskop do źródła światła i urządzenia do obrazowania wideo zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li> Znieczulić mysz 5% izofluranem z tlenem w komorze indukcyjnej. Następnie przenieś mysz na endoskopową platformę inscenizacyjną zawierającą system grzewczy (zapobiegający hipotermii) po jej brzusznej stronie i utrzymuj w znieczuleniu za pomocą stożka nosowego z 2% izofluranem z tlenem. Dodaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, delikatnie ściskając tylną stopę, aby sprawdzić odruch. 
	UWAGA: W tej technice można użyć dowolnego szczepu lub dowolnej płci myszy; Jednak zaleca się, aby myszy miały co najmniej 8 tygodni, aby były wystarczająco duże do zabiegu.
	<ol>
		<li>Dodaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona, delikatnie ściskając tylną stopę, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną igłębką do szczurów solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej. Włóż igłę na około 1 cm do odbytu myszy i delikatnie wstrzyj PBS, aby usunąć kał. Kilka granulek kału powinno opuścić mysz wraz z PBS, który został podany w infuzji. 
	UWAGA: Wkroplenie nadmiernej objętości PBS może spowodować tworzenie się piany w świetle, która może zasłaniać view światła.</li>
	<li>Włóż zmontowany endoskop 0,5 cm do odbytu myszy. Wsuń kleszcze do biopsji do światła odbytnicy, aż pełne "szczęki" (w tym zawiasy) kleszczy znajdą się poza końcem pochewki (jak zaobserwowano na monitorze wideo) (Dodatkowy film 1). Obróć kleszcze o 90°, aby szczęki otworzyły się w orientacji wschód-zachód (Dodatkowy film 1).</li>
	<li>Aby wykonać biopsję, otwórz kleszcze i przesuń się o około 1 cm, zamknij kleszcze i jednym płynnym ruchem szybko pociągnij kleszcze, pozostawiając je zamknięte (Dodatkowe wideo 1).
	<ol>
		<li>Unikaj całkowitego wdmuchiwania jelita grubego podczas wykonywania biopsji. Dlatego na tym etapie pozostaw otwartą prawą stronę zaworu gazowego; Chociaż należy zauważyć, że po otwarciu kleszczy istnieje ryzyko uszkodzenia błony śluzowej, gdy okrężnica znajduje się w tej pozycji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wizualizacja i pomiar łożyska rany
<ol>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wideo natychmiast po biopsji, naciskając pedał nożny dołączony do urządzenia rejestrującego kolonoskop. Całkowicie wdmuchnąć okrężnicę, mocno naciskając palec wskazujący na prawą stronę zaworu gazowego, aby całkowicie zakryć otwór, aby wtłoczyć powietrze do endoskopu, a tym samym do okrężnicy. 
	UWAGA: Chociaż protokół ten opisuje zastosowanie pompy powietrza, w której przepływ powietrza jest sterowany ręcznie, można również zastosować pompę perystaltyczną z kontrolowanym dopływem powietrza.</li>
	<li>Wysuń kleszcze z powrotem z pochwy do światła odbytnicy w pozycji zamkniętej (Dodatkowe wideo 1). Przyłóż kleszcze do ściany odbytnicy bezpośrednio nad raną, aż podstawa szczęk zrówna się z górną krawędzią pola widzenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i dodatkowe wideo 1). Kontynuuj pełne wdmuchiwanie jelita grubego, aż będzie można zaobserwować wyraźny widok rany. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby rozciągnąć kleszcze na tyle daleko, aby odsłonić tylko szczęki kleszczy aż do podstawy dla każdej badanej myszy, aby zapewnić stałą odległość między soczewką endoskopu a zmianą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, biała strzałka).</li>
	<li>Jeśli wykonujesz biopsję na wielu myszach tego samego dnia, usuń biopsję tkanki poprzedniej myszy z kleszczy (za pomocą dołączonej szczoteczki do czyszczenia) i wytrzyj osłonę soczewki 70% etanolem, aby ją wyczyścić przed wywołaniem rany u następnej myszy. 
	UWAGA: Chociaż ten protokół opisuje przeprowadzanie pojedynczej biopsji na mysz, wiele biopsji można wykonać na jednej myszy, pod warunkiem, że tkanka pobrana z poprzedniej biopsji zostanie usunięta z kleszczy, aby zapewnić możliwość wykonania pełnej biopsji podczas kolejnych biopsji.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce pozbawionej innych myszy i na ręczniku, aby utrzymać drożność dróg oddechowych, dopóki nie dojdzie do siebie po znieczuleniu po zakończeniu zabiegu. Monitoruj mysz, aby upewnić się, że wraca do zdrowia po znieczuleniu, jak wskazuje odzyskanie aktywności. 
	UWAGA: Do wywołania rany i uwidocznienia łożyska rany w dniu 0 potrzebne są dwie osoby (jedna obsługująca endoskop, a druga obsługująca kleszcze biopsyjne), ale tylko jedna osoba jest potrzebna do wizualizacji ran w kolejnych dniach (jak opisano poniżej).</li>
	<li>Należy postępować zgodnie z tą samą procedurą przygotowania myszy i kolonoskopii do kolejnych pomiarów rany (zazwyczaj 2., 4. i 6. dzień po biopsji), jak opisano powyżej w punktach 1.1-1.4, z wyjątkiem indukcji rany.</li>
	<li>Po wprowadzeniu endoskopu zlokalizuj łożysko rany na monitorze wideo w tych punktach czasowych i przesuń kleszcze do biopsji (w pozycji zamkniętej) bezpośrednio nad łożysko rany, wdmuchnij okrężnicę i rozpocznij nagrywanie wideo, jak opisano w sekcjach 2.1 i 2.2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
	UWAGA: Zlokalizowanie łożyska rany może być trudne po upływie 6 dni od biopsji.</li>
	<li>W kolejnych dniach należy przesunąć kleszcze do światła na taką samą odległość, jak w dniu 0, aby zapewnić stałą odległość między soczewką endoskopu a zmianą w ciągu kilku dni. Zapewnienie stałej odległości między soczewką a zmianą zwiększy dokładność pomiarów w miarę upływu czasu. 
	UWAGA: W tych dniach może wykonywać pomiary jedna osoba (endoskop jest obsługiwany prawą ręką, a kleszcze biopsyjne są wysuwane lewą ręką).</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich pomiarów otwórz nagrania wideo z seryjnej kolonoskopii w oprogramowaniu do edycji wideo, które umożliwia tworzenie nieruchomych ujęć z wideo.</li>
	<li>Przewiń film do klatki pokazującej punkt w czasie, w którym łożysko rany można łatwo zwizualizować, zamknięte kleszcze znajdują się nad łożyskiem rany i przy ścianie odbytnicy, a ściana jest napięta. Zrób migawkę tej klatki i zakoduj nazwę pliku, aby upewnić się, że pomiary łożysk ran są przeprowadzane w sposób zaślepiony.</li>
	<li>Otwórz obrazy z zakodowanymi nazwami plików w NIH ImageJ, aby określić ilościowo rozmiar łożyska rany. Na karcie Analiza wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz pole Obszar.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Zaznaczanie odręczne z paska menu głównego i narysuj obwód wokół rany (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Na karcie Analiza wybierz pozycję Zmierz, a wartość tej miary zostanie automatycznie wypełniona w oknie Wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego po zakończeniu pomiarów dla wszystkich obrazów, wybierając Zapisz jako na karcie Plik w oknie Wyniki i zmieniając rozszerzenie tak, aby stało się plikiem arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Oblicz rozmiar rany w dniach następujących po indukcji rany (tj. w dniach 2, 4 i 6) w stosunku do rozmiaru w dniu 0 (bezpośrednio po zranieniu) w arkuszu kalkulacyjnym. Aby to osiągnąć, należy podzielić rozmiar rany w każdym dniu przez rozmiar rany w dniu 0 i przeliczyć tę wartość na wartość procentową. 
	UWAGA: W normalnych warunkach przy użyciu tej metody oglądania kolonoskopowego, największe zamknięcie rany obserwuje się po pierwszych 2 dniach (~75% zmniejszenie rozmiaru), z bardziej stopniowym zamykaniem w 4 i 6 dniu (odpowiednio ~80% i ~95% zmniejszenie rozmiaru).</li>
</ol>
3. Pobranie łożyska rany do analizy molekularnej
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą uduszenia CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy (lub równoważnej techniki) w wybranym dniu po biopsji.</li>
	<li>Zbierz dystalną część okrężnicy, otwierając skórę i mięśnie brzucha, aby odsłonić jamę ciała. Umieść zamknięte nożyczki pod okrężnicą i delikatnie unieś, aby uwolnić ją z leżącej poniżej krezki, a następnie przetnij okrężnicę w jej środku i przy odbycie, aby usunąć ją z myszy.</li>
	<li>Wypłucz zawartość kału za pomocą igły do szczurów przymocowanej do strzykawki o pojemności 20 ml wypełnionej lodowatym 1x PBS, a następnie połóż okrężnicę na bibule filtracyjnej.</li>
	<li>Rozetnij okrężnicę wzdłużnie na bibule filtracyjnej, upewniając się, że strona krezkowa przylega do bibuły filtracyjnej. Nałóż 0,2% błękitu metylenowego na błonę śluzową za pomocą pipety do wyciskania, gdy tkanka nadal znajduje się na bibule filtracyjnej, a następnie odcedź nadmiar błękitu metylenowego. Obejrzyj okrężnicę pod mikroskopem preparacyjnym i zlokalizuj łożysko rany (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>Używając 4-calowych nożyczek do mikro tęczówki, przetnij wokół krawędzi łożyska rany (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A, przerywane kółko), uważając, aby nie przeciąć warstwy mięśniowej (chyba że mięsień jest pożądany) i przenieś wypreparowane łożysko rany do rurki za pomocą cienkiej pęsety do szybkiego zamrażania lub pożądanej metody przechowywania. 
	UWAGA: Ilość tkanki pobranej w ten sposób jest wystarczająca do ekstrakcji RNA do sekwencjonowania RNA lub równoważnej analizy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie tkanki do analizy histologicznej
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji i zbierz okrężnicę zgodnie z opisem w kroku 3.1-3.2.</li>
	<li>Rozetnij okrężnicę wzdłużnie na bibule filtracyjnej, upewniając się, że strona krezkowa przylega do bibuły filtracyjnej. Delikatnie nałóż 4% paraformaldehydu (lub utrwalacz z wyboru) za pomocą pipety do wyciskania i przykryj tkankę parafilmem. Pozostaw płasko w szczelnie zamkniętym pojemniku na 4-6 godzin.</li>
	<li>Przenieś tkanki do 70% etanolu w celu przechowywania. Gdy tkanki będą gotowe do przetworzenia, usuń parafilm i nałóż 0,2% błękitu metylenowego na błonę śluzową za pomocą pipety do wyciskania, gdy tkanka jest jeszcze na bibule filtracyjnej. Następnie odcedź nadmiar błękitu metylenowego.</li>
	<li>Obejrzyj okrężnicę pod mikroskopem preparacyjnym i zlokalizuj łożysko rany (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Używając skalpela z ostrzem #10, przetnij bezpośrednio środek łożyska rany i kontynuuj przecinanie pozostałej części jelita grubego w linii prostej, tak aby okrężnica została przecięta na pół, wzdłuż (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, linia).</li>
	<li>Przetwarzaj okrężnicę, a następnie zatapianie parafiny (jedna lub obie strony, które pozostają po cięciu) tak, aby strona, która została przecięta skalpelem (strona, która była środkiem łożyska rany przed rozcięciem) była skierowana w dół w parafinie. Przejdź do cięcia sekcji i barwienia w celu uzyskania pożądanych plam lub producentów.</li>
	<li>Jeśli do danego barwienia wymagane są kriosekcje, należy pobrać okrężnicę zgodnie z opisem w kroku 3.1 i otworzyć wzdłużnie na bibule filtracyjnej, upewniając się, że strona krezkowa przylega do bibuły filtracyjnej stroną skierowaną w dół.</li>
	<li>Przeciąć łożysko rany na pół w świeżo pobranej okrężnicy, jak opisano w kroku 4.5 i zanurzyć okrężnicę (jedną lub obie strony, które pozostają po przecięciu) tak, aby strona przecięta skalpelem była skierowana w dół w podstawowej formie do połowy wypełnionej pożywką do zamrażania tkanek.</li>
	<li>Zabezpiecz chusteczkę na miejscu delikatną pęsetą i umieść formę bazową na metalowej płytce na suchym lodzie, aby utwardzić medium do zamrażania. Gdy dolna część podłoża zostanie zamrożona (a tkanka zostanie przytrzymana na miejscu), zwolnij tkankę i wypełnij pozostałą objętość formy bazowej środkiem zamrażającym i umieść z powrotem na suchym lodzie.
	<ol>
		<li>Po zamrożeniu całej objętości pożywki zamrażającej przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C do momentu podzielenia na sekcje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku skrawków parafiny lub zamrożonych, należy wyciąć i wybarwić dodatkowe skrawki za pomocą H&E, aby upewnić się, że łożysko rany zostało uchwycone na skrawku przed przystąpieniem do barwienia specyficznego dla badania. Rysunek 3B pokazuje przykład sekcji, w której można wyraźnie zaobserwować łożysko rany.</li>
</ol>

<ol><li>Boal Carvalho, P., Cotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Healing+in+Ulcerative+Colitis%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review.</a> Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).</li>
<li>Chen, M. L., Sundrud, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+and+T-Cell+Subsets+in+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).</li>
<li>Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Trafficking+to+the+Small+Intestine+and+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon.</a> Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).</li>
<li>Halfvarson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+human+gut+microbiome+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease.</a> Nature Microbiology. 2, 17004(2017).</li>
<li>Johansson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+penetrate+the+normally+impenetrable+inner+colon+mucus+layer+in+both+murine+colitis+models+and+patients+with+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis.</a> Gut. 63 (2), 281-291 (2014).</li>
<li>Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+the+Intestinal+Barrier%3A+Leukocyte-Epithelial+Cell+Interactions%2C+Cell+Junction+Remodeling%2C+and+Mucosal+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair.</a> Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).</li>
<li>Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+evidence+supporting+mucosal+healing+and+deep+remission+as+important+treatment+goals+for+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).</li>
<li>Fung, K. Y., Putoczki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease+and+Colitis-Associated+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer.</a> Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).</li>
<li>Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).</li>
<li>Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+for+studying+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease.</a> Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).</li>
<li>Seno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+colonic+mucosal+wound+repair+requires+Trem2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).</li>
<li>Alam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+of+injured+murine+gut+elicits+a+local+pro-restitutive+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota.</a> Nature Microbiology. 1, 15021(2016).</li>
<li>Alam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+regulates+commensal-mediated+mucosal+homeostasis+and+restitution+and+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1.</a> Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).</li>
<li>Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+stimulates+intestinal+epithelial+proliferation+and+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury.</a> PLoS One. 9 (12), 114195(2014).</li>
<li>Leoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A1%2C+formyl+peptide+receptor%2C+and+NOX1+orchestrate+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).</li>
<li>Manieri, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosally+transplanted+mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+healing+by+promoting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li>
<li>Neurath, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+development+and+wound+healing+using+endoscopic+techniques+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice.</a> Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).</li>
<li>Montrose, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonoscopic-Guided+Pinch+Biopsies+in+Mice+as+a+Useful+Model+for+Evaluating+the+Roles+of+Host+and+Luminal+Factors+in+Colonic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation.</a> American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).</li>
<li>Bruckner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+endoscopy+for+in+vivo+multimodal+imaging+of+carcinogenesis+and+assessment+of+intestinal+wound+healing+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zapewnienie spójnych i dokładnych biopsji, a także pomiarów wielkości rany ma ogromne znaczenie przy próbie skutecznej oceny szybkości zamykania się rany w tym modelu. Dlatego należy podjąć kilka środków, aby mieć pewność, że procedury są przeprowadzane prawidłowo. Po pierwsze, głębokość biopsji nie może być zbyt płytka ani głęboka. Jeśli jest zbyt płytki, nie będzie wystarczającego okna do oceny zamknięcia rany. Rycina 2 przedstawia optymalną głębokość i rozmiar biopsji w dniu 0. Zwróć uwag...

Przewód pokarmowy (GI) to złożony układ narządów, biorąc pod uwagę jego liczne funkcje, typy komórek gospodarza (np. nabłonkowe, immunologiczne, zrębowe, itp.), a także biliony mikrobów. W świetle tej złożoności choroby przewodu pokarmowego często wiążą się ze współdziałaniem wszystkich tych czynników. Na przykład choroby zapalne jelit (IBD) są związane z cyklami zapalenia i remisji w przewodzie pokarmowym, obejmującymi aktywację komórek zapalnych, dysbiozę i naprawę nabłonka1,2,3,4,5,6,7. Posiadanie odpowiednich systemów modelowych do badania IBD i innych stanów zapalnych przewodu pokarmowego ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patogenezy choroby. Istnieje kilka modeli do badania patogenezy IBD, w tym genetycznie modyfikowanych myszy i stosowania substancji chemicznych, takich jak siarczan sodu dekstranu (DSS) u gryzoni8,9,10. Do ograniczeń tych modeli należy niezdolność do precyzyjnej kontroli indukcji stanu zapalnego, a także trudności w ocenie gojenia się ran. Alternatywne metody naśladowania aspektów patogenezy IBD mogą okazać się przydatne w opracowywaniu terapii.
Biopsje szczypienne pod kontrolą kolonoskopową u myszy oferują użyteczny system modelowy do badania patogenezy reakcji zapalnej, gojenia się ran, a także interakcji gospodarz-mikrob w okrężnicy. Podejście to zostało po raz pierwszy użyte jako narzędzie eksperymentalne w 2009 roku, które wykazało jego użyteczność do badania ostrej reakcji zapalnej i gojenia się ran w gut11. W kolejnych badaniach wykorzystano tę technikę do oceny roli różnych szlaków sygnałowych, a także mikrobioty jelitowej, w gojeniu się ran okrężnicy11,12,13,14,15,16,17,18. Niedawno nasza grupa wykorzystała ten model do zbadania znaczenia sygnalizacji sfingozyno-1-fosforanu i bakterii w ostrej odpowiedzi na uszkodzenie okrężnicy19. Chociaż jest to przydatne, przeprowadzanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach może być technicznie trudne. Na przykład perforacja jelita może wystąpić po indukcji urazu, a zapewnienie spójnych pomiarów łożyska rany za pomocą seryjnej kolonoskopii może być trudne. Ponadto prawidłowe ułożenie tkanki okrężnicy w celu uwidocznienia łożyska rany do analiz histologicznych lub immunohistochemicznych może być trudne. Chociaż istnieją pewne informacje na temat tych metod18,20, dokładny opis tych technik wraz z pomocami wizualnymi obiecuje zwiększyć niezawodność i szerszą użyteczność tego modelu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę przeprowadzania biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopii u myszy, śledzenia zamykania się rany w czasie i przygotowania tkanki do przeprowadzenia analiz histologicznych i molekularnych łożyska rany. Stworzenie standardowej metody przeprowadzania tych technik może rozszerzyć zastosowanie tego modelu do badania wcześniej niezbadanych mediatorów, które są potencjalnie ważne dla zapalenia przewodu pokarmowego i gojenia się ran.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze do biopsji, 3 ks.</td><td>Karl Storz</td><td>61071ZJ</td><td></td></tr><tr><td>Coloview Tower system</td><td>Karl Storz</td><td>skontaktuj się z firmą</td><td></td></tr><tr><td>Osłona badawcza, 9 Fr, zestaw</td><td>Teleskop Hopkinsa Karl Storz</td><td>61029DK</td><td></td></tr>, <tr><td>0', 1,9 mm x 10 cm</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>izofluoran</td><td>Covetrus</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>błękit metylenowy</td> Nożyczki do mikro tęczówki <td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Integra</td><td>18-1619</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIH ImageJ</td><td></td><td>NIH N/</td><td>A dostępne do bezpłatnego pobrania z: https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Pompa akwariowa Pawfly MA-60</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>skalpal z ostrzem #10</td><td>Hill-Rom</td><td>372610</td><td></td></tr></tbody></table>

wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Zrozumienie zmian tkankowych i komórkowych, które zachodzą w reakcji na ostre urazy, jak również podczas procesu gojenia się ran, ma ogromne znaczenie podczas badania chorób przewodu pokarmowego (GI). Model biopsji szczypania okrężnicy jest użytecznym narzędziem do definiowania tych procesów. Dodatkowo można badać wzajemne oddziaływanie między zawartością światła w jelitach (np. drobnoustrojami) a okrężnicą. Jednak indukcja rany i możliwość wiarygodnego śledzenia zamykania się rany w czasie może być wyzwaniem. Ponadto przygotowanie i orientacja tkanek muszą być przeprowadzane w ustandaryzowany sposób, aby optymalnie zbadać zmiany histologiczne i molekularne. W tym artykule przedstawiono szczegółową metodę opisującą uraz wywołany biopsją oraz monitorowanie zamykania się rany poprzez powtórne kolonoskopie. Opisano podejście, które zapewnia spójne i powtarzalne pomiary wielkości rany, możliwość pobrania łożyska rany do analiz molekularnych, a także wizualizacji łożyska rany po przecięciu tkanek. Zdolność do skutecznego zastosowania tych technik pozwala na badanie ostrej reakcji na uraz, gojenia się ran i interakcji luminal-gospodarz w obrębie jelita grubego.

Małe elementy (soczewka, osłona, kleszczyki biopsyjne) niezbędne do wykonania biopsji przedstawiono na Rysunku 1 wraz ze wskaźnikami prawidłowego montażu tych komponentów. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy akceptowalnych widoków łożyska rany w celu dokładnego określenia wielkości łożyska rany oraz szybkości jej zamykania. Przykład widoku łożyska rany ex vivo przedstawiono na Rysunku 3A, w tym wskaźniki obwodu łożyska rany...

Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury wywoływania biopsji szczypanych pod kontrolą kolonoskopii u myszy i śledzenia zamykania ran w czasie rzeczywistym. Dodatkowo przedstawiono metody przygotowania tkanek do analiz histologicznych, immunohistochemicznych i molekularnych łożyska rany.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount ...

Metoda ta stanowi idealne podejście do badania gojenia się ran okrężnicy oraz zmian molekularnych i histologicznych, które zachodzą po urazie. Metoda ta może również rzucić światło na patogenezę IBD. Główną zaletą tej techniki jest precyzyjna kontrola lokalizacji urazu i czasu procesu gojenia się rany.Osoby wykonujące tę metodę po raz pierwszy mogą mieć trudności z włożeniem kolonoskopu do okrężnicy myszy i tworzeniem spójnych ran. Powtarzalne praktykowanie tych technik powinno przezwyciężyć te problemy. Biorąc pod uwagę wiele skoordynowanych kroków i niuansów związanych z tą procedurą, wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie.Przed rozpoczęciem zabiegu należy włożyć endoskop ze sztywnym otworem o średnicy 1,9 milimetra do osłony endoskopu. I przymocuj zmontowany endoskop do źródła światła i urządzenia do obrazowania wideo zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj dostarczonej rurki, aby podłączyć pompę powietrza do zaworu gazowego po lewej stronie osłony obok kanału roboczego.Upewnij się, że kanał roboczy jest w pozycji otwartej i włóż trzy francuskie kleszcze do biopsji przez kanał roboczy. Przesuń kleszcze do końca pochwy, nie wystając z pochwy. Następnie umieść znieczuloną mysz na endoskopowej platformie do oceny stopnia zaawansowania po jej brzusznej stronie i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na odruch pedałowania.Po nałożeniu maści do oczu napełnij trzymililitrową strzykawkę dołączoną igłą do zgłębnika szczura PBS o temperaturze pokojowej. I włóż igłę około jednego centymetra do odbytu myszy. Delikatnie zaparzaj PBS, aż kał zostanie usunięty.Kilka granulek kału powinno opuścić mysz wraz z PBS, który został podany w infuzji. Włóż zmontowany endoskop na 0,5 centymetra do odbytu i wsuń kleszcze biopsyjne do oczyszczonego światła odbytnicy, aż pełne szczęki kleszczy znajdą się poza końcem pochewki. Obróć kleszcze o 90 stopni, tak aby szczęki otworzyły się w orientacji wschód-zachód i otwórz końcówki i przesuń kleszcze o około jeden centymetr, zamykając i chowając kleszcze jednym płynnym, szybkim ruchem, aby pobrać biopsję.Aby uniknąć całkowitego wdmuchiwania jelita grubego podczas wykonywania biopsji, pozostaw prawą stronę zaworu gazowego otwartą. Bezpośrednio po biopsji naciśnij pedał nożny przymocowany do urządzenia rejestrującego kolonoskop, aby rozpocząć nagrywanie wideo. I mocno dociśnij palec wskazujący do prawej strony zaworu gazowego, aby całkowicie zakryć otwór, wtłaczając powietrze do endoskopu, a tym samym do okrężnicy.Wycofaj kleszcze z powrotem z pochwy i do światła odbytnicy w pozycji zamkniętej. I przyłóż kleszcze do ściany odbytnicy bezpośrednio nad raną, aż podstawa szczęk zrówna się z górną krawędzią pola widzenia. Kontynuuj pełne wdmuchiwanie jelita grubego, aż będzie można zaobserwować wyraźny widok rany.Aby uzyskać najlepsze wymiary łożyska rany, uzbrój się w cierpliwość, a następnie ustaw kolonoskop pod precyzyjnym kątem, aby uzyskać najlepszy obraz łożyska rany. Otwórz film w odpowiednim programie komputerowym i przesuń wideo do klatki pokazującej punkt w czasie, w którym można łatwo zwizualizować łożysko rany. I w którym zamknięte kleszcze znajdują się nad łożyskiem rany i przy ścianie odbytnicy, a ściana jest napięta.W każdym punkcie czasowym uzyskaj migawkę tej klatki i zakoduj nazwę pliku, aby upewnić się, że pomiary łożysk ran są przeprowadzane w sposób zaślepiony. Aby określić ilościowo rozmiar łożyska rany, otwórz obrazy w ImageJ i użyj narzędzia do zaznaczania z wolnej ręki, aby narysować obwód wokół rany. W obszarze Analiza wybierz pozycję Miara.Wartość tego pomiaru zostanie automatycznie wypełniona w oknie Wyniki. Po uzyskaniu wszystkich pomiarów oblicz rozmiar rany w kolejnych dniach w stosunku do rozmiaru w dniu zero w arkuszu kalkulacyjnym. W odpowiednim doświadczalnym punkcie końcowym otwórz warstwy skóry i mięśni brzucha, aby odsłonić jamę ciała zwierzęcia doświadczalnego i umieść zamknięte kleszcze pod okrężnicą.Delikatnie podnieś okrężnicę, aby uwolnić ją z leżącej poniżej krezki i przetnij tkankę w jej środku oraz przy odbycie, aby zebrać ją od myszy. Użyj 20-mililitrowej strzykawki wypełnionej lodowatym PBS i wyposażonej w igłę do szczurów, aby wypłukać zawartość kału. I umieść oczyszczoną dwukropek na kawałku bibuły filtracyjnej.Otwórz okrężnicę wzdłużnie, uważając, aby strona krezkowa przylegała do bibuły filtracyjnej. I użyj pipety Pasteura, aby pokryć błonę śluzową 0,2% błękitem metylenowym. Po kilku sekundach odcedź nadmiar plamy i obejrzyj okrężnicę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zlokalizować łożysko rany.Użyj czterocalowych nożyczek Micro Iris, aby przeciąć krawędź łóżka, uważając, aby nie przeciąć warstwy mięśni. I użyj cienkiej pęsety, aby przenieść wyciętą tkankę do probówki w celu zaszybkiego zamrożenia i/lub przechowywania. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym otwórz pobraną okrężnicę wzdłużnie na kawałku bibuły filtracyjnej, krezką do dołu.Delikatnie przykryj tkankę wybranym utrwalaczem. Przykryj tkankę parafilmem w szczelnie zamkniętym pojemniku na 4 do 6 godzin przed przechowywaniem w 70% etanolu. W dniu przetwarzania należy usunąć parafilm i dodać 0,2% błękitu metylenowego do tkanki, jak pokazano.Po odsączeniu nadmiaru plamy umieść tkankę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zlokalizować łożysko rany. Za pomocą skalpela z ostrzem numer 10 przeciąć bezpośrednio środek łożyska rany i kontynuować przecinanie pozostałej części okrężnicy w linii prostej, tak aby okrężnica została przecięta na pół wzdłuż. W przypadku kriosekcji należy osadzić kawałki okrężnicy tak, aby strona przecięta skalpelem była skierowana w dół w podstawowej formie do połowy wypełnionej środkiem do zamrażania tkanek.Zabezpiecz chusteczkę na miejscu delikatną pęsetą i umieść formę bazową na metalowej płytce lub grubej folii aluminiowej na suchym lodzie, aby utwardzić medium zamrażające. Po zamrożeniu dolnej części podłoża napełnij pozostałą objętość formy bazowej środkiem zamrażającym o temperaturze pokojowej. I włóż formę z powrotem do suchego lodu, aż cały blok tkanki zostanie zamrożony.Następnie przenieś formę do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż do pokrojenia. W tym miejscu pokazano reprezentatywne obrazy akceptowalnych widoków łożyska rany w celu dokładnego ilościowego określenia wielkości łożyska rany i szybkości zamykania rany. W tym widoku ex vivo łożyska rany można zaobserwować wskaźniki obwodu łożyska rany i miejsca, w którym należy przeciąć tkankę, aby umożliwić wizualizację łożyska rany po przekroju.Na tym reprezentatywnym obrazie można wyraźnie zaobserwować przekrój plamy H i E na łożysku rany. Ważne jest, aby uzyskać natychmiastowe obrazy łożyska rany we wszystkich punktach czasowych, aby zapewnić dokładną ocenę szybkości gojenia się rany. Po biopsji szczypty można wstrzyknąć różne interesujące nas środki do łożyska rany, aby przetestować ich wpływ na szybkość gojenia się rany.

performing-colonoscopic-guided-pinch-biopsies-mice-evaluating

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje generowanie modelu myszy jelita grubego przez segmentową infekcję adeno-cre. Zakażony odcinek jelita grubego prowadzi do nowotworzenia w obrębie tego odcinka błony śluzowej, w wyniku czego gruczolaki ostatecznie przechodzą w raka inwazyjnego i przerzutowego. Model ten stanowi atrakcyjną platformę do badań nad biologią nowotworów i przedklinicznych badań terapeutycznych.

Segmentalna infekcja Adeno-Cre: technika generowania izolowanego raka jelita grubego przy użyciu genetycznie modyfikowanych modeli myszy

Ten film demonstruje protokół wykonywania biopsji szczypty pod kontrolą kolonoskopu u myszy. Ta technika pomaga wizualnie analizować światło okrężnicy i pobierać próbki tkanek do szczegółowych badań.

Kolonoskopowa biopsja szczypty pod kontrolą w modelu mysim: technika wizualizacji i ekstrakcji próbek tkanek z okrężnicy myszy

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania łożyska rany wywołanego kolonoskopią w odpowiednim momencie do szczegółowej analizy molekularnej. Analiza ta pomaga zrozumieć proces gojenia się ran w stanach zapalnych przewodu pokarmowego.

Kolonoskopowy model rany mysiej sterowanej: metoda izolowania łożyska rany wywołanej biopsją od jelita grubego, aby zrozumieć proces gojenia

W ciągu ostatnich kilku lat, endoskopy nowej generacji stały się ważnymi diagnostycznymi pomocami badawczymi do oceny mysiego zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół endoskopowej oceny stanu zapalnego i guzów jelita grubego u myszy, a także nowatorski system punktacji, który wykorzystuje identyfikatory dziesiętne do dokumentowania endoskopowego nasilenia zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego.

Elastyczna kolonoskopia u myszy w celu oceny ciężkości zapalenia jelita grubego i guzów jelita grubego przy użyciu zwalidowanego systemu punktacji endoskopowej

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Naucz się techniki biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy do badania gojenia ran jelita grubego i zmian molekularnych. Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę lokalizacji urazu oraz czasu gojenia.

Wykonywanie biopsji szczyptowych pod kontrolą kolonoskopową u myszy i ocena późniejszych zmian w tkankach

Przeglądaj więcej filmów