Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek
8 czerwca 2020
Konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek żywych komórek (SMLM) poprzez wykorzystanie ich przejściowo tworzących, przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół SMLM do śledzenia i rozpoznawania subkomórkowych obojętnych lipidów i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach ssaków i drożdży w nanoskopowej skali długości.
Nasz protokół opisuje zastosowanie konwencjonalnych barwników BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej z wykorzystaniem ich rzadkich, przesuniętych ku czerwieni stanów. Dzięki temu możemy badać organelle i biomolekuły w żywych komórkach z rozdzielczością 30 nanometrów. Zaletą tej metody jest jej prostota i wszechstronność różnych dostępnych koniugatów BODIPY, które stanowią długotrwałe źródło sygnałów jednocząsteczkowych.
Zademonstrowana przez nas aplikacja może stać się ważna dla uzyskania wglądu w choroby, takie jak stłuszczenie wątroby lub cukrzyca typu 2, poprzez rozpuszczanie kropelek lipidów i kwasów tłuszczowych poniżej limitu dyfrakcji. Uzyskujemy wgląd w biologię kropelek kwasów tłuszczowych i lipidów w komórkach drożdży i ssaków. Jednak technika ta ma zastosowanie do wszystkich innych przezroczystych typów komórek o niskiej fluorescencji tła.
Używając tej techniki po raz pierwszy, upewnij się, że zoptymalizowałeś stężenia di i moce lasera, aby obserwować jasne sygnały pojedynczych cząsteczek. Wizualna demonstracja tej techniki jest ważna, aby zobaczyć, w jaki sposób koncentracja di i optymalizacja mocy lasera skutkują jasnymi sygnałami pojedynczych cząsteczek. Utrzymuj komórki U2OS ssaków w niefluorescencyjnym DMBM z 10% płodową surowicą bydlęcą, czterema milimolowymi glutaminami, jednym milimolowym pirogronianem sodu i jednym procentem penicyliny streptomycyny antybiotyków w kolbie T-25.
Podziel komórki przy zbiegu od 70 do 80% na jeden do pięciu i pipetuj w jednym dołku na płytce ośmiodołkowej. Zmieniaj komórki w płytce ośmiodołkowej przez 12 do 24 godzin. Dziesięć minut przed obrazowaniem dodaj zielony BODIPY-C12 Lysotracker lub drugi koniugat BODIPY, dodaj końcowe stężenie 100 nanomolowych.
Zamontuj odpowiednie zestawy filtrów w ścieżce emisji w oparciu o kolor emisji używanego BODIPY. Włącz mikroskop. Stolik mikroskopowy, lasery 488 nanometrów i 561 nanometrów, a także kamera.
Dodaj kroplę powstającego oleju na obiektyw mikroskopu. Otwórz oprogramowanie HAL4000, które steruje światłem LED w celu obrazowania w jasnym polu, mocami lasera, migawkami laserowymi i ustawieniami aparatu do obrazowania. Ustaw wzmocnienie EMCCD na 30, a temperaturę kamery na minus 68 stopni Celsjusza.
Przygotuj aparat i odpowiednie oprogramowanie do nagrywania filmów z częstotliwością 20 Hz. Włącz grzałkę sceniczną mikroskopu i ustaw ją na temperaturę 37 stopni Celsjusza i poziom dwutlenku węgla na pięć procent. Odpowiednio dostosuj kolor korekcji obiektywu.
Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość, aż system ustawiania ostrości się zatrzaśnie. Przesuwaj stolik za pomocą kontrolera stage, aż w polu widzenia pojawią się zdrowe komórki. Załaduj sekwencje migawki laserowej do wzbudzenia mononumus, a także ściemniacze, do których moc lasera 561-nanometrowego lasera wynosi od 821 kilowatów na centymetr kwadratowy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki, tak aby pory fluorescencji pojedynczej cząsteczki były wykrywane w kanale emisyjnym przesuniętym ku czerwieni.
Dostosuj moc lasera między punktem 035 a punktem 07 watów na centymetr kwadratowy dla lasera 488-nanometrowego, tak aby w zielonym kanale emisyjnym pojawiła się konwencjonalna fluorescencja. Wybierz folder docelowy dla filmów i nagraj od 5000 do 20000 klatek akwizycji, aby zebrać wystarczającą liczbę lokalizacji do rekonstrukcji obrazów w super rozdzielczości. Przechodzenie do różnych pól widoku i powtarzanie tych czynności w celu zebrania danych dla większej liczby komórek.
Załaduj film do oprogramowania do analizy mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki. Wizualnie prześwietl film i dostosuj ustawienia kontrastu, tak aby widoczne było mruganie fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Aby ustawić parametry identyfikacji pojedynczej cząsteczki w celu dopasowania 2D Gaussian, PSF.
Przejrzyj wizualnie kilka przykładowych ramek, aby sprawdzić parametry identyfikacji i niezawodnie wykryć wyraźne rozbłyski fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki. Analiza prasowa w celu wykonania mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki wyobraź sobie analizę ze zoptymalizowanymi parametrami identyfikacji. A następnie renderuj każdą pojedynczą cząsteczkę jako Gaussa 2D, którego szerokość jest ważona przez odwrotność pierwiastka kwadratowego z wykrytej liczby fotonów.
Oceń jakość danych. Użyj ograniczonych zakresów ramek, aby obserwować rozkłady pojedynczych cząsteczek w bardziej konkretnych przypadkach i czasie. Uwzględnia to ruch organelli podczas pozyskiwania danych.
W tym badaniu przedstawiliśmy zoptymalizowaną procedurę przygotowania próbki, pozyskiwania i analizy danych z mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek przy użyciu koniugatów BODIPY. Aby zademonstrować przykładowy przebieg procesu pozyskiwania i analizowania danych z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek, zastosowano BODIPY w drożdżach do rozdzielania kropelek lipidów poniżej granicy dyfrakcji optycznej. Przykłady różnych trybów obrazowania wielokolorowego BODIPY w połączeniu z innymi sondami, takimi jak GFP i mEos2, przedstawiono tutaj.
BODIPY-C12 tworzy się w ruchomych nielipidowych skupiskach kropelek na obrzeżach komórek na czczo, w przeciwieństwie do ich włączenia do kropelek lipidów w warunkach karmienia. Aby jeszcze bardziej rozszerzyć możliwości mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek koniugatów BODIPY na komórki ssaków, zobrazowano BODIPY-C12 i Lysotracker green w żywych komórkach U2OS. Optymalizacja stężenia BODIPY, jak również zwiększenie mocy lasera, są kluczowymi krokami w celu wizualizacji jasnych sygnałów pojedynczych cząsteczek i rekonstrukcji obrazów o super rozdzielczości.
Metoda ta może być stosowana z dowolnym innym koniugatem BODIPY w celu uzyskania wglądu w wysoką rozdzielczość w specjalny czasowy rozkład określonych biomolekuł wewnątrz żywych komórek. Nasza technika utorowała drogę do dalszych badań nad biologią kropelek lipidów i kwasów tłuszczowych w skali soczewek nanoskopowych. Jednak to zastosowanie wykracza daleko poza specyficzne filopectetes ze względu na dostępność różnych funkcjonalnych koniugatów BODIPY.
Prosimy o przestrzeganie standardowych procedur operacyjnych dotyczących obchodzenia się z próbkami biologicznymi i barwnikami, a także o bycie naszymi zobowiązanymi hedgingowcami i przestrzeganie procedur bezpieczeństwa lasera.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wykorzystujący konwencjonalne barwniki BODIPY do superrozdzielczej mikroskopii, umożliwiającej obserwację organelli i biocząstek w żywych komórkach z wysoką precyzją. Metoda ta pozwala na śledzenie subkomórkowych lipidów neutralnych i kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków i drożdży z rozdzielczością 30 nanometrów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Barwniki BODIPY mogą tworzyć przemijające, przesunięte na czerwono stany przydatne do mikroskopii.
- Obrazowanie żywych komórek jest kluczowe dla badania dynamicznych procesów komórkowych.
- Rozumienie biologii lipidów jest ważne dla poznania chorób metabolicznych.
- Konwencjonalne techniki mikroskopowe mają ograniczenia w rozdzielczości małych struktur.
Cel badania
- Optymalizacja protokołu użycia barwników BODIPY w mikroskopii SMLM żywych komórek.
- Rozdzielcze przedstawienie kropel lipidowych i kwasów tłuszczowych poniżej granicy dyfrakcji.
- Podanie uniwersalnej metody stosownej do różnych przezroczystych typów komórek.
Zastosowane metody
- Superrozdzielcze mikroskopowanie z użyciem koniugatów BODIPY.
- Śledzenie lipidów neutralnych i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach.
- Zastosowanie techniki zarówno w komórkach ssaków jak i drożdży.
- Wykorzystanie rzadkich, przesuniętych na czerwono stanów dla ulepszonych obrazów.
Główne wyniki
- Osiągnięto rozdzielczość 30 nanometrów w obrazowaniu żywych komórek.
- Skuteczna obserwacja kropel lipidowych i kwasów tłuszczowych w czasie rzeczywistym.
- Zdemonstrowano przydatność metody do różnych typów komórek.
- Zdobyto wgląd w biologię lipidów istotny dla chorób takich jak choroba wątroby tłuszczowej i cukrzyca typu 2.
Wnioski
- Optymalizowany protokół SMLM poprawia badania nad biologią lipidów.
- Ta metoda może prowadzić do lepszego zrozumienia chorób metabolicznych.
- Konwencjonalne barwniki BODIPY oferują proste i efektywne rozwiązanie do obrazowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables nanoscale visualization of lipid droplets and fatty acids in living cells, supporting target validation in metabolic disease research. By resolving subcellular lipid dynamics at 30-nanometer resolution, it provides mechanistic insights into pathways relevant to fatty liver disease and type 2 diabetes. The method leverages widely available BODIPY conjugates, offering a scalable and reproducible tool for early discovery and assay development in lipid-focused therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet formation and fatty acid trafficking mechanisms in live cells.
- Operational Value: Uses conventional BODIPY dyes, reducing need for specialized probe synthesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative single-molecule localization data for assessing compound effects on lipid metabolism.
- Operational Value: Compatible with high-density plating and live-cell imaging workflows in 8-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links nanoscale lipid organization to cellular phenotypes under fed and fasted conditions.
- Operational Value: Supports longitudinal tracking of lipid dynamics in disease-relevant models like U2OS and yeast.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to probe lipid-dependent mechanisms before lead optimization, particularly in metabolic disease targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about lipid droplet dynamics and fatty acid mobility in live-cell systems.
- Screening: Enables assay-ready readouts of lipid redistribution and organelle association upon compound treatment.
- Analytics: Provides super-resolution localization precision and single-molecule tracking data for spatial and temporal analysis.
- Translational Research: Connects observed lipid phenotypes in yeast and mammalian cells to human metabolic disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Adaptable across hundreds of BODIPY conjugates for multiplexed lipid and organelle profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lipid signaling and storage pathways.
- Operational Value: Standardized sample preparation and laser settings ensure reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating target engagement in lipid homeostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds modulating lipid droplet or fatty acid flux.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and single-molecule data analysis.
- Needs EMCCD camera, laser excitation (488 nm, 561 nm), and oil immersion objectives.
- Demands standardization of BODIPY concentration and laser power settings across users.
- Applicable to live yeast and mammalian cells with low autofluorescence; optimization needed for other models.
- Limited by photobleaching and blinking kinetics of BODIPY ground-state dimers under imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:24
Preparation of Mammalian Cells for SMLM (Single-Molecule Localization Microscopy) Imaging
2:10
Equipment Preparation
3:22
Data Acquisition
4:18
Data Analysis and Single-Molecule Tracking
5:31
Results: SMLM Imaging Using BODIPY Conjugates
6:38
Conclusion
