Name: Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę superrozdzielczej mikroskopii z użyciem konwencjonalnych barwników BODIPY do obserwacji organelli w żywych komórkach. Technika umożliwia śledzenie lipidów z rozdzielczością 30 nanometrów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R21GM127965.

UWAGA: Informacje na temat klonowania drożdży i znakowania endogennego można znaleźć w naszej najnowszej publikacji10.
1. Przygotowanie próbek komórek drożdży do obrazowania
<ol>
	<li>Przygotuj płynną kulturę drożdży szczepu w303 na noc. Za pomocą sterylnego drewnianego patyczka umieść niewielką ilość komórek drożdży z płytki agarowej zawierającej ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstrozę do probówki hodowlanej z ~ 2 ml syntetycznej pożywki z kompletną dekstrozą. Inkubować probówkę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem przy prędkości 270 obr./min i temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wykonaj poranne rozcieńczenie komórek w SCD w stosunku 1:50. Kontynuować hodowlę rozcieńczonych komórek przez 4 godziny w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem o prędkości 270 obr./min, pozwalając komórkom rosnąć w fazie wykładniczej i osiągnąć gęstość optyczną (OD) ~0,6, 
	UWAGA: Procedura może się tutaj różnić w zależności od badanego stanu metabolicznego. Konugaty BODIPY nie wymagają komórek w fazie wzrostu wykładniczego. Należy jednak pamiętać o autofluorescencji z martwych komórek w fazie stacjonarnej, ponieważ może ona powodować sygnał tła zbyt silny, aby można było analizować pojedyncze emitery BODIPY-DII.</li>
	<li>Aby zbadać komórki na czczo, hoduj kulturę drożdży przez 2 dni bez wymiany pożywki.</li>
	<li>Po ~30 minutach przed posiewem komórek inkubować szkło nakrywkowe z 80 μl sterylnej konkanawaliny A (ConA) 0,8 mg/ml w dejonizowanymH2Ow temperaturze pokojowej. Po 30 minutach umyj szkło nakrywkowe trzykrotnie dejonizowanymH2O.</li>
	<li>Po ~30 minutach przed obrazowaniem odpipetować komórki na komorze nakrywkowej z odpowiednią objętością świeżego SCD, aby osiągnąć gęstość optyczną ~0,12 (zwykle 60 μL kultury drożdży przy OD ~0,6 w 240 μL SCD). Pozwól komórkom osiąść i przylegać do powierzchni ConA przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać żądany koniugat BODIPY bezpośrednio do komorowego szkła nakrywkowego w końcowym stężeniu ~100 nM. 
	UWAGA: Eksperyment optymalizacji stężenia BODIPY może być wymagany w zależności od lokalnej gęstości BODIPY w określonym przedziale komórkowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek ssaków do obrazowania SMLM
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki U2OS ssaków w niefluorescencyjnym DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 1% antybiotyków penicyliny-streptomycyny w kolbie T25. 
	UWAGA: Komórki mogą być również utrzymywane w DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków penicyliny-streptomycyny, jednak pożywka musi zostać wymieniona przed obrazowaniem roztworem nieautofluorescencyjnym.</li>
	<li>Podziel komórki przy zbieganiu 70-80% 1:5 w jednym dołku 8-dołkowej płytki. Hodować komórki na płytce 8-dołkowej przez 12 do 24 godzin przed obrazowaniem.</li>
	<li>Dodać BODIPY-C12, LysoTracker Green lub dowolny inny koniugat BODIPY w końcowym stężeniu 100 nM (roztwory podstawowe w dimetylosulfotlenku [DMSO]) 10 minut przed obrazowaniem. Czas ten może się różnić w zależności od pożądanego eksperymentu. 
	UWAGA: Obrazowanie można wykonać w temperaturze otoczenia (23 °C) przy użyciu roztworu do obrazowania żywych komórek. Jednak preferowane jest obrazowanie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 za pomocą niefluorescencyjnego DMEM zmieszanego z 10% płodową surowicą bydlęcą, 4 mM glutaminą, 1 mM pirogronianem sodu i 1% antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi w celu utrzymania komórek bliżej warunków fizjologicznych i wyciągnięcia wniosków biologicznych.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Zamontuj odpowiednie zestawy filtrów w ścieżce emisji w oparciu o kolor emisji używanego BODIPY. 
	UWAGA: Czteropasmowe zwierciadło dichroiczne (zt/405/488/561/640rdc) najpierw oddziela wzbudzenie od światła emisyjnego. Emisja zielona (525 nm) i emisja czerwona (595 nm) są następnie rozdzielane przez dichroiczny rozdzielacz wiązki długoprzepustowej (T562lpxr), a następnie filtry pasmowo-przepustowe ET525/50 w kanale zielonym i ET 595/50 w kanale czerwonym. Dwa kanały są następnie rzutowane na różne obszary tego samego układu kamery. Podobnie, emisja czerwona (595 nm) i emisja dalekiej czerwieni są najpierw rozdzielane przez dichroiczny długoprzepustowy rozdzielacz wiązki (FF652-Di01), a następnie przez filtry pasmowo-przepustowe ET 610/75 w kanale czerwonym i FF731/137 w kanale dalekiej czerwieni.</li>
	<li>Włącz mikroskop, stolik mikroskopowy, lasery (488 nm, 561 nm) i kamerę. W tym przypadku używany jest mikroskop odwrócony z doskonałym systemem ustawiania ostrości oraz kamera EMCCD schłodzona do -68 °C.</li>
	<li>Dodaj kroplę olejku immersyjnego na obiektyw mikroskopu.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie Hal4000 (patrz tabela materiałów), które steruje światłem LED do obrazowania w jasnym polu, mocami lasera, migawkami laserowymi i ustawieniami kamery do obrazowania. Ustaw wzmocnienie EMCCD na 30, a temperaturę aparatu na -68 °C. Przygotuj aparat i odpowiednie oprogramowanie do nagrywania filmów z częstotliwością 20 Hz. 
	UWAGA: Technika ta ma zastosowanie do każdego mikroskopu szerokokątnego zdolnego do obrazowania mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej światłem (PALM) i stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM). Odpowiednie oprogramowanie może się różnić.</li>
	<li>Włączyć grzałkę sceniczną mikroskopu i ustawić ją na temperaturę 37 °C i poziom CO2 na 5%. Odpowiednio wyreguluj kołnierz korekcji obiektywu.</li>
	<li>Zamontuj próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość, aż system ustawiania ostrości się zatrzaśnie. Przesuwaj stolik za pomocą kontrolera stage, aż w polu view pojawią się zdrowe komórki. 
	UWAGA: W przypadku obrazowania z komórkami drożdży w temperaturze pokojowej nie ma potrzeby włączania grzałki ani kontroli CO2.</li>
	<li>Włącz odpowiednie lasery do wzbudzania monomerów, a także dimerów. W przypadku koloru zielonego BODIPY lub zielonego LysoTracker używamy lasera o długości fali 561 nm do wzbudzenia stanówD II dla SMLM oraz lasera o długości fali 488 nm do wzbudzenia monomerów do fluorescencji konwencjonalnej. 
	UWAGA: W przypadku czerwieni BODIPY należy użyć lasera o długości fali 640 nm do wzbudzenia stanów DII dla SMLM oraz lasera o długości fali 561 nm do wzbudzenia monomerów w celu uzyskania konwencjonalnej fluorescencji. W przypadku czerwieni BODIPY dostosuj moce lasera 561 nm i 640 nm, aby uwidocznić fluorescencję masową w kanale czerwonym i wybuchy pojedynczych cząsteczek w kanale dalekiej czerwieni. Typowa moc dla 561 nm wynosi ~0,06 W/cm2 i ~5 kW/cm2 dla 640 nm. W przypadku BODIPY green należy spodziewać się również konwencjonalnej fluorescencji w zielonym kanale emisyjnym pod wzbudzeniem 561 nm. W przypadku czerwieni BODIPY należy spodziewać się konwencjonalnej fluorescencji w kanale czerwonym poniżej wzbudzenia 640 nm. Sygnał ten powstaje w wyniku emisji anty-Stokesa, która staje się przydatna dla obrazów kolokalizacji monomerów/dimerów z ciągłym wzbudzeniem laserowym.</li>
</ol>
4. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Załaduj sekwencje migawki laserowej do wzbudzenia monomerów oraz dimerów. 
	UWAGA: Zazwyczaj używamy dziewięciu ramek wzbudzenia pojedynczej cząsteczki przy 561 nm, a następnie jednej konwencjonalnej ramki wzbudzenia przy 488 nm. Zapewnia to jaśniejszy konwencjonalny sygnał fluorescencyjny i pozwala uniknąć wycieku innego pobudliwego fluoroforu o długości fali 488 nm, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP), do czerwonego kanału detekcji pojedynczej cząsteczki w zastosowaniach obrazowania wielokolorowego. Alternatywnie, włącz laser 561 nm w sposób ciągły i polegaj na emisji anty-Stokesa dla konwencjonalnych obrazów w kanale o krótszej długości fali.</li>
	<li>Dostosuj moce lasera tak, aby błyski fluorescencji pojedynczej cząsteczki były wykrywane w kanale emisyjnym przesuniętym ku czerwieni pod wzbudzeniem 561 nm, a konwencjonalna fluorescencja pojawiała się w zielonym kanale emisyjnym ze wzbudzeniem 488 nm. Typowe moce lasera 561 nm wynoszą około 0,8-1 kW/cm2 dla SMLM i 0,035-0,07 W/cm2 dla lasera 488 nm w konwencjonalnym trybie obrazowania fluorescencyjnego.</li>
	<li>Wybierz folder docelowy dla filmów i nagraj 5 000-20 000 klatek akwizycji, aby zebrać wystarczającą liczbę lokalizacji do rekonstrukcji obrazów w super rozdzielczości.</li>
	<li>Przejdź do różnych pól widoku i powtórz powyższe kroki, aby zebrać dane z większej liczby komórek.</li>
</ol>
5. Analiza danych i śledzenie pojedynczych cząsteczek
<ol>
	<li>Załaduj film do oprogramowania do analizy SMLM. 
	UWAGA: Można użyć dowolnego software18. Używamy INSIGHT (patrz Tabela materiałów) i weryfikujemy krzyżowo wyniki za pomocą wtyczki ThunderSTORM19 dla imageJ (Fidżi).</li>
	<li>Wizualnie prześwietl film i dostosuj ustawienia kontrastu tak, aby widoczne było mruganie fluorescencji pojedynczej cząsteczki. W razie potrzeby ogranicz obszar lub zakres ramek do analizy danych SMLM, jeśli części próbki stale fluoryzują.</li>
	<li>Ustaw parametry identyfikacji pojedynczej cząsteczki do dopasowania do 2D Gaussian PSF (ROI: 7 x 7 pikseli o rozmiarze piksela 160 nm, szerokości 260-650 nm, wysokości > 50 fotonów). Wizualne przesiewanie kilku przykładowych ramek, aby sprawdzić parametry identyfikacji i niezawodnie wykryć wyraźne wybuchy fluorescencji pojedynczej cząsteczki (patrz rysunek 1C). 
	UWAGA: Niektóre parametry identyfikacyjne, takie jak wysokość i szerokość, można nieznacznie dostosować, aby zoptymalizować rozpoznawanie wizualnie odbieranych sygnałów fluorescencyjnych pojedynczej cząsteczki.</li>
	<li>Przeprowadź analizę obrazu SMLM ze zoptymalizowanymi parametrami identyfikacji, a następnie wyrenderuj każdą pojedynczą cząsteczkę jako gaussa 2D, którego szerokość jest ważona przez odwrotny pierwiastek kwadratowy z wykrytej liczby fotonów.</li>
	<li>Oceń jakość danych. Użyj ograniczonych zakresów ramek, aby obserwować rozkłady pojedynczych cząsteczek w bardziej konkretnych momentach w czasie. Może to odpowiadać za ruch organelli podczas pozyskiwania danych.</li>
	<li>Aby dokładniej przeanalizować rozkład przestrzenny i dynamikę rozkładów cząsteczek, należy wyeksportować uzyskaną listę cząsteczek zawierającą współrzędne, ramki wyglądu, fotony, szerokości i wysokości lokalizacji. Zaimportuj listę cząsteczek w niestandardowych pisemnych procedurach analizy.</li>
	<li>Aby uzyskać informacje przestrzenne o rozkładzie pojedynczej cząsteczki, należy obliczyć funkcję rozkładu promieniowego ρ(r), która reprezentuje gęstość lokalizacji w funkcji odległości radialnej20. Aby uzyskać ρ(r), oblicz unikalne odległości parami wszystkich lokalizacji, skonstruuj histogram z przedziałami wyśrodkowanymi w ri o wysokości H(ri) i o szerokości dr i podziel przez 2πri*dr; (ρ(ri) = H(ri)/π(ri+dr)2-r i2). Funkcja rozkładu radialnego może być następnie wykorzystana do ilościowego określenia i porównania stopnia grupowania, a także charakterystycznej wielkości klastrów.</li>
	<li>Aby uzyskać dynamiczne informacje o dyfuzji cząsteczek, połącz lokalizacje, które pojawiają się na przykład w obrębie 3 pikseli (0,48 μm) w kolejnych ramkach pozyskiwania danych, aby utworzyć ślady pojedynczych cząsteczek. 
	UWAGA: Odległość łączenia będzie zależeć od dyfuzji cząsteczek i gęstości lokalizacji. Maksymalną odległość łączenia można oszacować, analizując gęstość lokalizacji w każdej ramce21,22. Średnią gęstość określono na 0,043 lokalizacji naμm2; W związku z tym promień 0,48 μm mieścił się w wystarczająco niskiej gęstości, aby zapewnić, że różne cząsteczki nie są ze sobą połączone.</li>
	<li>Uśrednić przemieszczenia dla różnych czasów opóźnienia Δt z wielu ścieżek trwających co najmniej trzy razy opóźnienia, aby utworzyć wykres przemieszczenia średniokwadratowego (MSD) w funkcji Δt. Dopasuj krzywą MSD w funkcji Δt za pomocą równania MSD = 4DΔt + σ2, aby obliczyć średni współczynnik dyfuzji D3.</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077(2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li>
<li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+%28FAST%29+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+A%3A+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li>
<li>Bröring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%28BF2%29-2%2C2%27-bidipyrrins+%28BisBODIPYs%29%3A+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+Der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li>
<li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29%3A+Dimers+with+application+to+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li>
<li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li>
<li>Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li>
<li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym protokole pokazaliśmy, w jaki sposób konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do uzyskiwania obrazów SMLM z poprawą rozdzielczości przestrzennej o rząd wielkości. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu wcześniej opisanych, przesuniętych ku czerwieni stanów DII konwencjonalnych barwników BODIPY, które przejściowo tworzą się w wyniku spotkań dwucząsteczkowych. Stany te mogą być specyficznie wzbudzone i wykryte za pomocą przesuniętych ku czerwieni długości fal i są wystarczająco rzadkie i krótkotrwał...

Techniki mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM) i mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywnie (PALM), pojawiły się jako metody generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości z informacjami wykraczającymi poza limit dyfrakcji optycznej Abbego1,2 oraz do śledzenia dynamiki pojedynczych biomolekuł3,4. Jednym z wymagań stawianych sondom kompatybilnym z SMLM jest możliwość kontrolowania liczby aktywnych fluoroforów w dowolnym momencie, aby uniknąć przestrzennego nakładania się ich funkcji rozproszenia punktowego (PSF). W każdej z tysięcy ramek akwizycji danych lokalizacja każdego fluoroforu fluorescencyjnego jest następnie określana z precyzją ~20 nm poprzez dopasowanie odpowiadającej mu funkcji rozproszenia punktowego. Tradycyjnie, włączanie i wyłączanie mrugania fluoroforów było kontrolowane za pomocą stochastycznego fotoprzełączania1,2,5 lub chemicznie indukowane wewnętrzne6. Inne podejścia obejmują indukowaną aktywację fluorogenów po przejściowym związaniu z białkiem aktywującym fluorogen7,8 oraz programowalne wiązanie-rozwiązywanie znakowanych oligomerów DNA we fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) lub wzbudzeniu arkusza świetlnego9. Niedawno informowaliśmy o nowatorskiej i wszechstronnej strategii etykietowania dla SMLM10, w której wcześniej zgłaszano przesunięte ku czerwieni stany dimeryczne (DII) konwencjonalnych koniugatów di-pirometanu boru (BODIPY)11,12,13 tworzą się przejściowo i stają się specyficznie wzbudzone i wykryte za pomocą przesuniętych ku czerwieni długości fal.
BODIPY są powszechnie stosowanymi barwnikami z setkami wariantów, które specjalnie oznaczają subkomórkowe przedziały i biomolekuły14,15,16. Ze względu na łatwość użycia i możliwości zastosowania w żywych komórkach, warianty BODIPY są dostępne na rynku do konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu opisujemy szczegółowy i zoptymalizowany protokół, w jaki sposób setki dostępnych na rynku koniugatów BODIPY mogą być wykorzystywane do SMLM z żywych komórek. Dzięki dostrojeniu stężenia monomerów BODIPY i optymalizacji mocy lasera wzbudzającego, parametrów obrazowania i analizy danych, uzyskuje się wysokiej jakości obrazy o wysokiej rozdzielczości i dane śledzenia pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach. W przypadku stosowania przy niskim stężeniu (25-100 nM), koniugaty BODIPY mogą być jednocześnie używane do SMLM w kanale przesuniętym ku czerwieni i do korelacyjnej konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej w konwencjonalnym kanale emisyjnym. Uzyskane dane dotyczące pojedynczych cząsteczek mogą być analizowane w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej struktur nieruchomych oraz wyodrębnienia stanów dyfuzyjnych cząsteczek w żywych komórkach17. Dostępność sond BODIPY zarówno w wersji zielonej, jak i czerwonej pozwala na obrazowanie wielokolorowe, jeśli jest używane w odpowiedniej kombinacji z innymi kompatybilnymi fluoroforami.
W tym raporcie przedstawiamy zoptymalizowany protokół do pozyskiwania i analizowania danych SMLM z żywych komórek przy użyciu BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 czerwonego i lysotracker-zielonego w wielu kolorach. Rozpuszczamy kwasy tłuszczowe i obojętne lipidy w żywych komórkach drożdży i ssaków z rozdzielczością ~30 nm. Wykazaliśmy ponadto, że komórki drożdży regulują przestrzenny rozkład zewnętrznie dodanych kwasów tłuszczowych w zależności od ich stanu metabolicznego. Odkrywamy, że dodane kwasy tłuszczowe BODIPY (FA) lokalizują się w retikulum endoplazmatycznym (ER) i kropelkach lipidów (LD) w warunkach karmienia, podczas gdy BODIPY-FA tworzą klastry inne niż LD w błonie plazmatycznej na czczo. Rozszerzamy zastosowanie tej techniki do obrazowania lizosomów i LD w żywych komórkach ssaków. Nasz zoptymalizowany protokół dla SMLM wykorzystujący konwencjonalne koniugaty BODIPY może być użytecznym źródłem do badania procesów biologicznych w nanoskali z niezliczonymi dostępnymi koniugatami BODIPY.

<table><tbody><tr><td>BODIPY C12</td><td>ThermoFisher</td><td>D3822</td><td>Zielony analog kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>BODIPY C12 Czerwony</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>Analog czerwonych kwasów tłuszczowych</td></tr><tr><td>BODIPY(493/503)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Neutralny marker lipidowy</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td>Immobilizacja komórek na powierzchni szkła</td></tr><tr><td>Drop-out Mix Kompletny bez bazy azotowej</td><td>US Biological</td><td>D9515</td><td>Aminokwasy dla SCD</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Źródło węgla dla SCD</td></tr><tr><td>Eight Well</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.58-N</td><td>Komorowe szkła nakrywkowe</td></tr><tr><td>Eight Well, Lb-Tek II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Komorowe okulary nakrywkowe</td></tr><tr><td>ET525/50</td><td>Chroma</td><td></td><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td></tr><tr><td>ET595/50</td><td>Chroma</td><td></td><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td></tr><tr><td>ET610/75</td><td>Chroma</td><td></td><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FF652</td><td>Semrock</td><td></td><td>Rozdzielacz wiązki</td></tr><tr><td>FF731/137</td><td>Semrock</td><td></td><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>Pożywka</td></tr> <tr><td>do hodowli komórkowychHal4000</td><td>Zhuang Lab, Uniwersytet</td><td></td> Harvarda <td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Ixon89Ultra DU-897U</td><td>Andor</td><td></td><td>Kamera EMCCD do wykrywania fotonów</td></tr><tr><td>Laser 405, 488, 561, 640 nm</td><td>CW-OBIS</td><td></td><td>Lasery do wzbudzenia Insight3</td></tr><tr><td></td><td>Zhuang Lab, Uniwersytet</td><td></td> Harvarda <td>Oprogramowanie do lokalizacji pojedynczych cząsteczek</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Aminokwas wymagany do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Roztwór do obrazowania żywych komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Bufor obrazowania</td></tr><tr><td>Lysotracker Green ThermoFisher</td><td></td><td>L7526</td><td>Marker lizosomów na bazie Bodipy</td></tr><tr><td>Ssacze Komórki ATCC U2OS (Manassas, VA)</td><td>Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td> Zanurzenie w oleju <td>Nikon</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Cel Penicylina streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Suplement do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>T562lpxr</td><td>Chroma</td><td></td><td>Rozdzielacz wiązki</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Dysocjacja komórki przylegającej</td></tr><tr><td>W303 Szczep MATa</td><td>Horizon-Dharmacon</td><td>YSC1058</td><td>Szczep drożdży rodzicielskich</td></tr><tr><td>Drożdże Baza azotowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1250</td><td>Baza azotowa bez aminokwasów</td></tr><tr><td>zt405/488/561/640rdc</td><td>Chroma</td><td></td><td>Quadband lustro dichroiczne</td></tr></tbody></table>

konwencjonalne koniugaty bodipy do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Techniki mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM) pokonują granicę dyfrakcji optycznej konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i mogą rozpoznać struktury wewnątrzkomórkowe i dynamikę biomolekuł z precyzją ~20 nm. Warunkiem wstępnym SMLM są fluorofory, które przechodzą ze stanu ciemnego do fluorescencyjnego, aby uniknąć czasoprzestrzennego nakładania się ich funkcji rozproszenia punktowego w każdej z tysięcy ramek akwizycji danych. BODIPY są dobrze znanymi barwnikami z licznymi koniugatami stosowanymi w konwencjonalnej mikroskopii. Przejściowe tworzenie przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego BODIPY (DII) powoduje jasną emisję pojedynczej cząsteczki, umożliwiając mikroskopię lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM). Tutaj przedstawiamy prosty, ale wszechstronny protokół SMLM z konwencjonalnymi koniugatami BODIPY w żywych komórkach drożdży i ssaków. Procedura ta może być wykorzystana do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości i śledzenia pojedynczych stanów BODIPY-DII w celu wyodrębnienia informacji czasoprzestrzennych koniugatów BODIPY. Stosujemy tę procedurę do rozpuszczania kropelek lipidów (LD), kwasów tłuszczowych i lizosomów w żywych komórkach drożdży i ssaków w nanoskopowej skali długości. Ponadto demonstrujemy możliwość obrazowania wielokolorowego za pomocą barwników BODIPY w połączeniu z innymi sondami fluorescencyjnymi. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują zróżnicowany rozkład przestrzenny i ruchliwość kwasów tłuszczowych BODIPY i obojętnych lipidów w drożdżach w warunkach karmienia i na czczo. Ten zoptymalizowany protokół dla SMLM może być używany z setkami dostępnych na rynku koniugatów BODIPY i jest użytecznym źródłem do badania procesów biologicznych w nanoskali, daleko wykraczających poza zastosowania tej pracy.

W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowaną procedurę przygotowania próbek, akwizycji i analizy danych dla SMLM z wykorzystaniem koniugatów BODIPY, opartą na powyższym protokole (Rycina 1A). Aby zademonstrować przykład schematu postępowania przy pozyskiwaniu i analizie danych SMLM, zastosowaliśmy BODIPY (493/503) w drożdżach w celu obrazowania kropli lipidowych (LD) poniżej limitu dyfrakcji optycznej (Rycina 1B-F). Przykłady różnych trybów ...

Konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek żywych komórek (SMLM) poprzez wykorzystanie ich przejściowo tworzących, przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół SMLM do śledzenia i rozpoznawania subkomórkowych obojętnych lipidów i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach ssaków i drożdży w nanoskopowej skali długości.

Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Nasz protokół opisuje zastosowanie konwencjonalnych barwników BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej z wykorzystaniem ich rzadkich, przesuniętych ku czerwieni stanów. Dzięki temu możemy badać organelle i biomolekuły w żywych komórkach z rozdzielczością 30 nanometrów. Zaletą tej metody jest jej prostota i wszechstronność różnych dostępnych koniugatów BODIPY, które stanowią długotrwałe źródło sygnałów jednocząsteczkowych.Zademonstrowana przez nas aplikacja może stać się ważna dla uzyskania wglądu w choroby, takie jak stłuszczenie wątroby lub cukrzyca typu 2, poprzez rozpuszczanie kropelek lipidów i kwasów tłuszczowych poniżej limitu dyfrakcji. Uzyskujemy wgląd w biologię kropelek kwasów tłuszczowych i lipidów w komórkach drożdży i ssaków. Jednak technika ta ma zastosowanie do wszystkich innych przezroczystych typów komórek o niskiej fluorescencji tła.Używając tej techniki po raz pierwszy, upewnij się, że zoptymalizowałeś stężenia di i moce lasera, aby obserwować jasne sygnały pojedynczych cząsteczek. Wizualna demonstracja tej techniki jest ważna, aby zobaczyć, w jaki sposób koncentracja di i optymalizacja mocy lasera skutkują jasnymi sygnałami pojedynczych cząsteczek. Utrzymuj komór

conventional-bodipy-conjugates-for-live-cell-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę superrozdzielczej mikroskopii z użyciem konwencjonalnych barwników BODIPY do obserwacji organelli w żywych komórkach. Technika umożliwia śledzenie lipidów z rozdzielczością 30 nanometrów.

Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów