Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Precyzyjna czasoprzestrzenna regulacja genów jest kontrolowana przez różne elementy cis-regulatorowe, które oddziałują między nimi. Nasz protokół umożliwia ilościowe badanie kontaktów chromatyny wybranych loci, takich jak promotory. Technika ta pozwala nam zidentyfikować i określić ilościowo częstotliwości interakcji między różnymi elementami regulatorowymi jednocześnie.

Aby wygenerować ciała embrionalne, zacznij od hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy do 60% zbieżności. Następnie wyjmij pożywkę hodowlaną i przemyj dwukrotnie dwoma mililitrami wysterylizowanego PBS. Całkowicie usuń PBS i dodaj dwa mililitry pożywki do odrywania komórek.

Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przez pięć minut dodać do naczynia osiem mililitrów pożywki różnicującej EB. Aby oddzielić kolonie mESC w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej, należy pipetować pożywkę w górę iw dół 15 do 20 razy i przenieść zawiesinę do 10-mililitrowej probówki.

Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 300 razy g przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń supernatant. Po zliczeniu komórek ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej EB.

Odwróć pokrywkę 15-centymetrowego naczynia hodowlanego. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów nanieś 20-mikrolitrowe krople zawieszonych komórek na pokrywie. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na dolnej części naczynia hodowlanego.

Inkubuj naczynie z wiszącymi kroplami przez trzy dni. Aby zebrać komórki po inkubacji, delikatnie umyj pokrywkę 10 mililitrami PBS. Przenieś PBS, który będzie zawierał EBs, do 50-mililitrowej plastikowej tuby.

Po pozostawieniu probówki na 30 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant. EB zostaną pozostawione na dnie tuby. Delikatnie zawiesić EB w 10 mililitrach świeżej pożywki różnicującej EB.

Przenieść zawiesinę na 10-centymetrową bakteriologiczną szalkę Petriego. Trzy do sześciu dni później użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić tworzenie się EB. EB powinny być okrągłe i jednorodnej wielkości.

Zbierz EB z dwóch lub trzech 10-centymetrowych naczyń do 50-mililitrowej plastikowej tuby. Odwirować EB w temperaturze 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić EB w 10 mililitrach PBS.

Ponownie odwirować EB w temperaturze 300 razy g w temperaturze pokojowej, tym razem przez trzy minuty. Usuń supernatant i dodaj dwa mililitry trypsyny-EDTA do osadu. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Podczas inkubacji pipetować w górę i w dół co trzy minuty, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Aby zatrzymać reakcję trypsyny, dodaj osiem mililitrów pożywki różnicującej EB. Po ponownym zawieszeniu komórek w świeżej pożywce EB dodaj paraformaldehyd do końcowego stężenia 1%Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na zmianę.

Ugasić formaldehyd, dodając glicynę do końcowego stężenia 0,125 mola. Zakończ proces utrwalania zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie zamroź granulki komórek w ciekłym azocie. Delikatnie ponownie zawieś osad komórek w świeżo przygotowanym lodowatym buforze do lizy i umieść probówkę na lodzie.

Po 15 minutach odwirować komórki w temperaturze 1 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i przemyć osad 500 mikrolitrami zimnego buforu do lizy. Ponownie zawiesić granulat w 1,5-mililitrowej tubie z 50 mikrolitrami 0,5% SDS w 1x buforze drugim i umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 62 stopni Celsjusza.

Po 10 minutach wyjmij rurkę z bloku grzewczego i dodaj bufor do wytrawiania. Dobrze wymieszać pipetując, unikając nadmiernego pienienia, i inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zapewnić skuteczne trawienie enzymem restrykcyjnym, w tym protokole uwzględniliśmy powtarzalny etap trawienia.

Dlatego ważne jest również, aby dobrze zawiesić jądra w buforze trawiennym. Dodaj kolejne 25 mikrolitrów buforu wytrawiającego, wymieszaj przez odwrócenie i weź osiem mikrolitrów jako niestrawioną kontrolę. Niestrawioną próbkę kontrolną należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.

Następnie dodasz kilka porcji enzymu restrykcyjnego Mbol, inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod rotacją po każdej podwielokrotności. Weź osiem mikrolitrów jako strawioną próbkę kontrolną. Aby usunąć sieciowanie obu próbek kontrolnych, dodaj 80 mikrolitrów buforu TE w 10 mikrolitrach proteinazy K. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Aby sprawdzić wydajność trawienia, uruchom 20-mikrolitrowe porcje na 0,6% żelu. Udane trawienia wykazują fragmenty głównie w zakresie od 3,0 do 5,0 kilopar zasad. Przygotuj DNA do strzyżenia zgodnie z opisem w rękopisie.

Użyj sonikatora, aby ściąć DNA do rozmiaru od 150 do 700 par zasad. Przenieś ścięte DNA do normalnej, nowej probówki z bezpiecznym zamkiem, łącząc wiele dźwięków z tej samej próbki. Dodaj podgrzane kulki oczyszczające DNA w ilości równej 1,8-krotności istniejącej objętości i wymieszaj przez ponowne zawieszenie.

Po pięciu minutach inkubacji zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Trzymając probówki w stojaku magnetycznym, umyj koraliki dwa razy jednym mililitrem świeżo przygotowanego 80% etanolu. Po wysuszeniu kulek na powietrzu w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, eluuj DNA poprzez ponowne zawieszenie kulek w buforze 1x Tris.

Za pomocą metody wiszącej kropli uzyskano jednorodną populację EB sześć dni po indukcji różnicowania ESC. Elektroforeza żelowa była wykonywana w całym protokole w celu kontroli jakości. Efektywne trawienie przez Mbol skutkuje fragmentami o wielkości mniejszej niż trzy pary kilozasad.

Elektroforeza po podwiązaniu wykazała, że większość fragmentów była większa niż trzy pary kilozasad. Po sonikacji spodziewane są rozmiary fragmentów od 400 do 500 par zasad. Po defosforylacji i ligacji adaptera na jednym końcu przeprowadzono dwie rundy PCR w celu amplifikacji celów będących przedmiotem zainteresowania.

Każdy cel został amplifikowany oddzielnie za pomocą dwóch różnych par starterów, A i B dla locus Pou5f1 oraz C i D dla locus T. Spowodowało to rozmaz DNA około 400 par zasad. Alternatywnie, przeprowadzono multipleksowy PCR w celu jednoczesnego amplifikowania celów A i C, co dało podobny rozmiar fragmentu po oczyszczeniu.

W tych profilach 4C jasnoniebieskie pola wskazują lokalizację wzmacniaczy z dynamicznymi zmianami podczas różnicowania. Regiony chromatyny kontaktują się z promotorami genów Pou5f1 i T podczas różnicowania EB. Pou5f1 był regulowany w dół podczas różnicowania EB.

I odwrotnie, T był regulowany w górę podczas różnicowania EB. Skuteczne trawienie enzymem restrykcyjnym, a następnie ligacja zbliżeniowa krzyżującego się genomowego DNA są kluczowymi czynnikami zapewniającymi powodzenie tego protokołu. Kolejną rzeczą jest projekt podkładu do przeszukiwania mapy kontaktów każdego locus.

Procedura ta idealnie nadaje się do badania kontaktu chromatyny w docelowych loci. Jeśli wymagane są zmiany globalne, można zastosować podejścia obejmujące cały genom, takie jak Hi-C, wychwytywanie promotora Hi-C lub HiChIP.