Name: Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę 4C do ilościowej analizy interakcji chromatynowych między wzmacniaczami a promotorami w ciałach embrionalnych myszy. Technika ta umożliwia badanie regulacji ekspresji genów podczas różnicowania komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować F. Le Dily, R. Stadhoudersowi i członkom laboratorium Graf za ich rady i dyskusje. G.S. był wspierany przez stypendium Marie Skłodowska-Curie (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T przez stypendium podoktorskie Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach 7. Programu Ramowego 7PR (ERBN Synergy Grant 4D-Genome, umowa o grant 609989 dla T.G.), hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki, Przemysłu i Konkurencyjności (MEIC) w ramach partnerstwa EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 oraz CERCA Program Generalitat de Catalunya.

1. Wytwarzanie ciała embrionalnego z embrionalnych komórek macierzystych myszy
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną bez surowicy mESC: DMEM/F12 i pożywkę neurobazalną zmieszane w stosunku 1:1. Pożywkę uzupełnia się roztworem aminokwasów endogennych MEM (1x), pirogronianem sodu (1 mM), L-glutaminą (2 mM), penicyliną-streptomycyną (100 U/ml), beta-merkaptoetanolem (50 μM), suplementami N2 i B27 (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) i czynnikiem hamującym białaczkę (LIF) (1 000 U/ml).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę różnicującą EB: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aminokwasami endogennymi MEM (1x), pirogronianem sodu (1 mM), L-glutaminą (2 mM), penicyliną-streptomycyną (100 U/mL), beta-merkaptoetanolem (50 μM).</li>
	<li>Hodowla mESC na 10-centymetrowych plastikowych naczyniach wstępnie pokrytych 0,1% (w/v) żelatyny w pożywce niezawierającej surowicy hodowlanej mESC.</li>
	<li>Gdy mESC osiągną 60% zbieżności, usuń pożywkę hodowlaną i delikatnie przemyj 1x 2 ml wysterylizowanego PBS.</li>
	<li>Całkowicie usunąć PBS i dodać 2 ml pożywki do oddzielania komórek. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dezaktywować reakcję, dodając 8 ml pożywki różnicującej EB do naczynia.</li>
	<li>Dysocjację kolonii mESC poprzez pipetowanie w górę i w dół 15-20 razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Policz komórki (np. za pomocą hemocytometru).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej EB i dostosować stężenie do 2 x 104 komórek/ml.</li>
	<li>Odwróć pokrywkę naczynia hodowlanego o średnicy 15 cm i za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl umieść 20 μl kropli zawieszonych komórek (~400 komórek/kroplę) na pokrywce.</li>
	<li>Ostrożnie odwróć pokrywkę na dolną komorę i inkubuj naczynie z wiszącymi kroplami w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 3 dni.</li>
	<li>Zebrać EBs, delikatnie myjąc wieczko 10 ml PBS i przenieść zawiesinę zawierającą EB do plastikowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umieść rurkę w RT na 30 minut, tak aby EB opadły na dno pod wpływem grawitacji. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić EB w 10 ml świeżej pożywki różnicującej EB i przenieść na bakteriologiczną szalkę Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Sprawdź tworzenie się EB 3-6 dni później za pomocą odwróconego mikroskopu. Wygenerowane EB powinny być okrągłe i jednorodnej wielkości.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95%. EB będą nadal różnicować się w trzy listki zarodkowe i mogą być zbierane w różnych punktach czasowych do analizy.</li>
</ol>
2. Dysocjacja EB
<ol>
	<li>Zbierz EB z dwóch lub trzech 10-centymetrowych naczyń do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować EB przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić EB za pomocą 10 ml PBS. Odwirować EB przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%) do osadu i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Pipetować w górę i w dół co 3 minuty, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Dodać 8 ml pożywki różnicującej EB, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Sprawdź dysocjację EB pod mikroskopem i policz komórki.</li>
</ol>
3. Fiksacja
<ol>
	<li>Zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej EB w stężeniach 1 x 106 komórek/ml. W przypadku probówki o pojemności 50 ml należy użyć maksymalnie 4,5 x 107 komórek w 45 ml pożywki.</li>
	<li>Dodać paraformaldehyd z 37% bulionu (nie starszego niż 6 miesięcy) do 1% stężenia końcowego. 
	UWAGA: Podczas obchodzenia się z paraformaldehydem należy przestrzegać odpowiednich przepisów BHP, ponieważ jest to niebezpieczna substancja chemiczna.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na zmianę.</li>
	<li>Ugasić formaldehyd, dodając glicynę do końcowego stężenia 0,125 M.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na zmianę.</li>
	<li>Przenieś utrwalone komórki do lodu i od teraz utrzymuj w chłodzie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Granulować komórki o gramaturze 300 x g przez 5 minut w wirówce z chłodzeniem.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS (1 ml na 5 x 106 komórek), a następnie przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml z bezpiecznym zamknięciem.</li>
	<li>Osadzać komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i zatrzaskowo zamrozić granulki w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub postępować zgodnie z poniższym protokołem.</li>
</ol>
4. Liza komórek i trawienie enzymów restrykcyjnych
<ol>
	<li>Delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 0,25 ml świeżo przygotowanego lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 i 1x inhibitory proteazy) na 2-5 x 106 komórek. Aby przygotować 5 ml buforu do lizy, patrz Tabela 1.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić osad, który zawiera jądra.</li>
	<li>Przemyć granulowane jądra 500 μl zimnego buforu do lizy</li>.
	<li>Delikatnie zawiesić osad w probówce o pojemności 1,5 ml z 50 μl 0,5% SDS w 1x buforze 2, a następnie inkubować probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 62 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Wyjmij probówki z bloku grzewczego i dodaj 170 μl buforu do wytrawiania zawierającego 25 μl 10% trytonu X-100 w celu ugaszenia SDS. Dobrze wymieszać pipetując, unikając nadmiernego pienienia.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 25 μl buforu wytrawiającego, wymieszać przez odwrócenie i wziąć 8 μl jako niestrawioną kontrolę. Przechowywać niestrawioną próbkę kontrolną w temperaturze -20 °C. Dodać 100 U MboI enzymu restrykcyjnego (4 μL z 25 U/μL podstawy) do pozostałych jąder i trawić chromatynę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C pod wpływem rotacji. Dodać kolejną porcję 100 j. MboI i inkubować przez dodatkowe 2 godziny.</li>
	<li>Dodać kolejne 100 j. MboI i inkubować przez noc w rotacji w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia dodać kolejne 100 j. MboI i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C na zmianach.</li>
	<li>Pobrać 8 μl jako strawioną próbkę kontrolną. Rozszyfrować rozszyfrowane próbki kontrolne i niestrawione próbki kontrolne z kroku 4.8 poprzez dodanie 80 μl buforu TE (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) i 10 μl proteinazy K (10 mg/ml). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Uruchom 20 μl porcji na żelu 0,6%, aby sprawdzić wydajność trawienia. Udane trawienia wykazują głównie fragmenty w zakresie 3,0-0,5 kb.</li>
</ol>
5. Podwiązanie zbliżeniowe i odwrócenie usieciowania
<ol>
	<li>Próbki strawione przez MboI inkubować w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym przez 20 minut w celu dezaktywacji MboI, a następnie schłodzić do temperatury ciekłej.</li>
	<li>Odwirować probówki przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i rozpuścić osad w 200 μl świeżego buforu ligazy.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 1 000 μl głównej mieszanki do ligacji. W celu przygotowania 1 000 μl głównej mieszanki do podwiązywania, patrz Tabela 2.</li>
	<li>Mieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc z powolnymi obrotami (9 obr./min).</li>
	<li>Wyeliminuj RNA i reszty białkowe, dodając 100 μl proteinazy K (10 mg/ml) i 10 μl RNazy A (10 mg/ml). Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 45–60 minut.</li>
	<li>Kontynuować inkubację próbek w temperaturze 65 °C przez dodatkowe 4 godziny.</li>
</ol>
6. Ścinanie DNA i wybór rozmiaru
<ol>
	<li>Fajne lampy do RT.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podzielić próbkę na trzy podwielokrotności po 400 μl w probówkach o pojemności 2 ml i dodać 2 μl glikogenu (20 mg/m), 40 μl octanu sodu (3 M, pH = 5,2) i 2,5 razy większą objętość (1 ml) 100% etanolu do każdej probówki. Mieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze -80 °C przez 45-60 min.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut. Po odwirowaniu probówki należy trzymać na lodzie i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Umyj granulki DNA, ponownie zawieszając je w 800 μl 70% etanolu. Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie przemyć 800 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 130 μl 1x buforu Tris (10 mM Tris-HCl, pH = 8) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby całkowicie rozpuścić DNA. W razie potrzeby użyć pipetowania w celu ponownego zaparcia osadu.</li>
	<li>Zmierz wydajność DNA; można spodziewać się 2,5-5 μg chromatyny dla 1 x 106 komórek. Sprawdź podwiązanie, uruchamiając ± 200 ng produktu 3C na 0,6% żelu agarozowym. Udane ligacje najczęściej wykazują fragmenty DNA > 3 kb. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę w probówce o pojemności 0,65 ml odpowiedniej do sonikacji do 10 ng/μl w 100 μL 1x objętości buforu Tris (1 μg na probówkę). Standardowa ilość używana do przygotowania biblioteki to 3 μg, więc w razie potrzeby wykonaj sonikację w trzech oddzielnych probówkach.</li>
	<li>Ścinać DNA do wielkości 150-700 pz (średnio = 400-500 pz) przy użyciu następujących parametrów na sonikatorze: Cykle: 6-8 po 20 s na -60 s off. Powinno to sprawić, że DNA będzie nadawało się do wysokoprzepustowego przygotowania biblioteki sekwencjonowania przy użyciu sekwenatorów Illumina.</li>
	<li>Przenieś ścięte DNA do normalnej, nowej probówki z bezpiecznym zamkiem. Połącz wiele dźwięków z tej samej próbki.</li>
	<li>Ogrzej butelkę kulek oczyszczających DNA w RT. Od teraz używaj końcówek o niskim wiązaniu.</li>
	<li>Dodaj 1,8 raza objętość koralików do probówki DNA i delikatnie zawieś.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Umyj koraliki 2x 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówki w stojaku magnetycznym. 
	UWAGA: Usuń cały etanol, w tym resztki kropel.</li>
	<li>Suszyć kulki na powietrzu krótko (2-3 min) w temperaturze RT. 
	UWAGA: Nie suszyć koralików dłużej niż 5 minut. Spowoduje to zmniejszenie wydajności DNA.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki za pomocą 90 μl 1x buforu Tris (10 mM Tris-HCl, pH = 8) w celu elucji DNA.</li>
	<li>Zmierz wydajność DNA i przeanalizuj podwielokrotność 5 μl na 1,5% żelu. Straty powinny być bardzo małe w porównaniu z wydajnością presoniczną.</li>
</ol>
7. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania
<ol>
	<li>Dodać 15 μl mieszanki wzorcowej z zestawu do przygotowywania biblioteki. Aby naprawić końce ściętego DNA, połącz 10 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego naprawy końców i 5 μl mieszanki enzymów naprawy końców.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodaj 1,1 raza objętość kulek oczyszczających DNA i delikatnie zawiesij.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Umyj koraliki dwukrotnie 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówki w stojaku magnetycznym. Usuń etanol.</li>
	<li>Suszyć kulki na powietrzu przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 42 μl 1x buforu Tris (10 mM Tris-HCl, pH = 8) w celu elucji DNA.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 8 μl mieszanki głównej dA-tailing. Aby przygotować główną mieszankę dA-tailing, połącz 5 μl 10x buforu reakcyjnego dA-tailing i 3 μl egzo-minusa fragmentu Klenowa.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodaj 2 μl fosfatazy alkalicznej jelit cielęcych () w celu defosforylacji DNA.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie 60 minut w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Dodaj 1,1 raza objętości kulek oczyszczających DNA i delikatnie zawieś.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Umyj koraliki 2x 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówki w stojaku magnetycznym.</li>
	<li>Wysuszyć kulki na powietrzu krótko (2-3 min) w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 35 μl 1x buforu Tris (10 mM Tris-HCl, pH = 8), aby wymyć DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję podwiązania adaptera. Stosować zmniejszone stężenia adaptera/ligazy, jak podano w tabeli 3.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 3 μl mieszaniny glikozylazy DNA uracylu i enzymu endonukleazy VII (np. USER) glikozylazy DNA, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Zwiększyć objętość do 100 μl wodą, gotować 5 minut w temperaturze 96 °C, a następnie przechowywać próbki na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 1,1 raza objętości kulek oczyszczających DNA i delikatnie zawieś.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Umyj koraliki 2x 1 ml świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówki w stojaku magnetycznym.</li>
	<li>Suszyć kulki na powietrzu przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 50 μl 1x buforu Tris (10 mM Tris-HCl, pH = 8), aby wymyć DNA.</li>
</ol>
8. Biblioteka interakcji chromatyny 4C wzmocnienie i oczyszczanie
<ol>
	<li>Amplifikuj bibliotekę 4C przy użyciu 10 μl biblioteki do przeprowadzenia pierwszego PCR. Konfigurację i program PCR można znaleźć w Tabeli 4.</li>
	<li>Wykonaj zagnieżdżony PCR. Zagnieżdżoną konfigurację i program PCR można znaleźć w tabeli 5.</li>
	<li>Zbierz produkty PCR dla każdej biblioteki i oczyść je za pomocą 1,1-krotnych kulek oczyszczających DNA.</li>
	<li>Zmierz wydajność DNA i przeanalizuj podwielokrotność 5 μl na 1,5% żelu.</li>
	<li>Dostosuj koncentrację biblioteki i uporządkuj bibliotekę. W przypadku indeksowania biblioteki można utworzyć w puli przed sekwencjonowaniem.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Martello, G., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The nature of embryonic stem cells.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+uno+plures%3A+molecular+designs+for+embryonic+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency.</a> Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).</li>
<li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells International. 2012, 738910(2012).</li>
<li>Gaszner, M., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulators%3A+exploiting+transcriptional+and+epigenetic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms.</a> Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).</li>
<li>Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+promoters%3A+emerging+characteristics+and+insights+into+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).</li>
<li>Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ever-Changing+Landscapes%3A+Transcriptional+Enhancers+in+Development+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution.</a> Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).</li>
<li>Schoenfelder, S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+enhancer-promoter+contacts+in+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Lettice, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+five+digits+is+controlled+by+a+bipartite+long-range+cis-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator.</a> Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+from+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
<li>van de Werken, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+4C-seq+data+analysis+to+screen+for+regulatory+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions.</a> Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).</li>
<li>Schwartzman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UMI-4C+for+quantitative+and+targeted+chromosomal+contact+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling.</a> Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).</li>
<li>Tian, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whsc1+links+pluripotency+exit+with+mesendoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification.</a> Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interplay+between+enhancer-promoter+topology+and+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity.</a> Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).</li>
<li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+chromatin+interactions+of+the+Nanog+locus+in+pluripotency%2C+differentiation%2C+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).</li>
<li>de Wit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+genome+in+three+dimensions+is+shaped+around+pluripotency+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors.</a> Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).</li>
<li>Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-seq+from+beginning+to+end%3A+A+detailed+protocol+for+sample+preparation+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis.</a> Methods. , (2019).</li>
<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+Capture+Hi-C%3A+High-resolution%2C+Genome-wide+Profiling+of+Promoter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda hodowli w wiszącej kropli nie wymaga dodatkowych czynników wzrostu ani cytokin i w sposób powtarzalny generuje jednorodne populacje EB z wcześniej określonej liczby mESC5. W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego 4C zaadaptowany z podejścia UMI-4C w celu ilościowego określenia kontaktu wzmacniacz-promotor czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii w modelu różnicowania EB. Zidentyfikowaliśmy regiony chromatyny, które kontaktują się z promotorami genów Pou5f1 i T w dynamiczny sposób podczas różnicowania EB. Pou5f1 był regulowany w dół podczas różnicowania EB, a częstotliwość kontaktu między promotorem Pou5f1 a jego dystalnym wzmacniaczem zmniejszyła się. I odwrotnie, T był regulowany w górę podczas różnicowania EB i zidentyfikowaliśmy trzy wzmacniacze, dla których częstotliwości kontaktu z ich promotorem są zmniejszone (Figura 3). Aby potwierdzić identyfikację, można przeprowadzić test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) aktywnego znacznika histonowego H3K27ac24, ponieważ wykazano, że ten znacznik histonowy jest związany z aktywacją wzmacniacza, a wzmacniacze tracą ten znak podczas ich inaktywacji11.
Standardowa technika 4C została szeroko wykorzystana do zbadania profilu kontaktu chromatyny w określonych miejscach genomowych25. Jednak podejście to jest trudne do ilościowej interpretacji nawet po rozległej normalizacji 26,27,28 ze względu na odchylenia wprowadzone przez niejednorodność wielkości fragmentu PCR i niemożność rozróżnienia duplikatów PCR. Nasza ilościowa metoda 4C jest w dużej mierze identyczna z techniką UMI-4C, która umożliwia kwantyfikację pojedynczych cząsteczek za pomocą sonikacji i etapu PCR z zagnieżdżoną ligacją, aby ominąć ograniczenia klasycznego podejścia 4C23. Jednak w przeciwieństwie do UMI-4C, który wykorzystuje unikalne identyfikatory molekularne, nasz ilościowy protokół 4C pozwala na ilościowe oznaczanie pojedynczych cząsteczek w oparciu o specyficzne pęknięcie DNA powstałe na etapie sonikacji. To sprawia, że nasz protokół jest kompatybilny z komercyjnymi zestawami do przygotowywania bibliotek DNA, eliminując potrzebę stosowania starterów z unikalnymi identyfikatorami molekularnymi.
Nasz protokół obejmuje kilka kluczowych kroków, które należy wziąć pod uwagę. Podobnie jak w klasycznej metodzie 4C28, krytycznymi czynnikami naszego protokołu są efektywność trawienia i ligacji podczas przygotowania cząsteczek 3C. Niska wydajność trawienia/ligacji może znacznie zmniejszyć złożoność interakcji z fragmentem zainteresowania, co skutkuje zmniejszoną rozdzielczością. Jak opisano wcześniej23, kolejnym krytycznym krokiem protokołu jest zaprojektowanie starterów do wzmocnienia biblioteki. Drugie startery reakcji PCR powinny znajdować się w odległości 5-15 nt od badanego miejsca restrykcji. W przypadku odczytu sekwencjonowania 75 nt pozwala to na co najmniej 40 nt po lewej stronie długości przechwytywania do mapowania. Starter stosowany w pierwszej reakcji PCR powinien być zaprojektowany przed drugim starterem, bez nakładania się na siebie, a oba powinny być wystarczająco specyficzne, aby zapewnić skuteczną amplifikację DNA. W przypadku multipleksowania startery powinny być projektowane niezależnie, dążąc do temperatury topnienia (Tm) 60-65 °C. Ponadto, podobnie jak w przypadku innych technik 3C, rozdzielczość ilościowej metody 4C jest określana przez enzym restrykcyjny zastosowany w protokole25. Protokół ten wykorzystuje enzym restrykcyjny z miejscem rozpoznawania 4 pz, MboI. Maksymalna rozdzielczość tego enzymu wynosi około 500 pz, ale jest to wysoce zależne od locus i rzadko osiągane. Innym ograniczeniem jest to, że interakcje zachodzące między elementami znajdującymi się w tym samym fragmencie restrykcyjnym nie są wykrywalne. Ponadto nie można odróżnić interakcji zachodzących w odległości od jednego miejsca restrykcji od niestrawionego tła. Zastosowanie etapu wypełniania przed podwiązaniem może pozwolić na wykrycie tych interakcji.
Ilościowy 4C idealnie nadaje się do badania kontaktów chromatyny docelowych loci. Jednak specyficzny etap amplifikacji PCR ogranicza liczbę loci, które można badać jednocześnie. Sposobem na zwiększenie liczby docelowych loci jest multipleksowanie etapów PCR w celu jednoczesnej amplifikacji kilku celów, ale wymaga to kompatybilności stosowanych starterów i przetestowania każdej pary starterów przed wdrożeniem. Jeśli pożądane są globalne zmiany architektury chromatyny w promotorach, bardziej odpowiednie byłyby podejścia obejmujące cały genom, takie jak Hi-C, PC Hi-C lub HiChIP 29,30,31.

U myszy, wewnętrzna masa komórkowa (ICM) 3,5-dniowych zarodków zawiera embrionalne pluripotencjalne komórki macierzyste. ICM dalej rozwija się w epiblast w 4,5 dniu, wytwarzając komórki ektodermy, mezodermy i endodermy, trzy główne listki rozrodcze w zarodku. Chociaż komórki pluripotencjalne w ICM istnieją tylko przejściowo in vivo, mogą być wychwycone w hodowli poprzez ustanowienie mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC)1,2,3. MESC pozostają w stanie niezróżnicowanym i namnażają się w nieskończoność, ale pod wpływem bodźców wewnętrznych i zewnętrznych są również zdolne do wyjścia ze stanu pluripotencji i wytworzenia komórek trzech rozwojowych listków rozrodczych2,4. Co ciekawe, podczas hodowli w zawiesinie w małych kropelkach, mESC tworzą trójwymiarowe agregaty (tj. EB), które różnicują się we wszystkie trzy listki zarodkowe5. Test tworzenia EB jest ważnym narzędziem do badania procesu specyfikacji wczesnej linii.
Podczas określania linii, komórki każdej warstwy zarodkowej nabywają specyficzny program ekspresji genów4. Precyzyjna czasoprzestrzenna ekspresja genów jest regulowana przez różne elementy cis-regulatorowe, w tym promotory rdzenia, wzmacniacze, tłumiki i izolatory6,7,8,9. Wzmacniacze, regulacyjne segmenty DNA zwykle obejmujące kilkaset par zasad, koordynują ekspresję genów specyficzną dla tkanki8. Wzmacniacze są aktywowane lub wyciszane przez wiązanie czynników transkrypcyjnych i kofaktorów, które regulują lokalną strukturę chromatyny8,10. Powszechnie stosowanymi technikami identyfikacji przypuszczalnych wzmacniaczy są immunoprecypitacja chromatyny w całym genomie, a następnie sekwencjonowanie (ChIP-seq) oraz test chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu technik sekwencjonowania (ATAC-seq). Tak więc aktywne wzmacniacze charakteryzują się specyficznymi aktywnymi znacznikami histonów i zwiększoną lokalną dostępnością DNA11,12,13,14. Ponadto uważa się, że wzmacniacze rozwoju wymagają fizycznej interakcji z pokrewnym promotorem8,9. Rzeczywiście, wykazano, że warianty wzmacniacza i delecje, które zakłócają kontakty wzmacniacz-promotor, mogą prowadzić do wad rozwojowych15. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na nowatorskie techniki, które dostarczą dodatkowych informacji do identyfikacji funkcjonalnych wzmacniaczy kontrolujących ekspresję genów rozwojowych.
Od czasu rozwoju techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C)16, mapowanie kontaktów chromosomowych jest intensywnie wykorzystywane do oceny fizycznej odległości między elementami regulatorowymi. Co ważne, niedawno opracowano wysokoprzepustowe warianty technik 3C, zapewniające różne strategie utrwalania, trawienia, ligacji i odzyskiwania kontaktów między fragmentami chromatyny17. Wśród nich Hi-C in situ stał się popularną techniką pozwalającą na sekwencjonowanie produktów ligacji 3C w całym genomie18. Jednak wysokie koszty sekwencjonowania wymagane do osiągnięcia rozdzielczości odpowiedniej do analizy kontaktów wzmacniacz-promotor sprawiają, że technika ta jest niepraktyczna w badaniu określonych loci. W związku z tym opracowano alternatywne metody analizy docelowych loci w wyższej rozdzielczości19,20,21,22. Jedna z tych metod, a mianowicie 4C, znana jako strategia jeden przeciwko wszystkim, pozwala na wykrycie wszystkich sekwencji, które kontaktują się z miejscem wybranym jako punkt widzenia. Jednak wadą standardowej techniki 4C jest wymagany odwrócony PCR, który amplifikuje fragmenty o różnej wielkości, faworyzując małe produkty i stronniczą kwantyfikację po sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Niedawno opracowano UMI-4C, nowy wariant techniki 4C wykorzystujący unikalne identyfikatory molekularne (UMI) do ilościowego i ukierunkowanego profilowania kontaktów chromosomowych, który omija ten problem23. Podejście to wykorzystuje częste obcinacze, sonikację i protokół PCR za pośrednictwem ligacji zagnieżdżonej, co wiąże się z amplifikacją fragmentów DNA o stosunkowo równomiernym rozkładzie długości. Ta jednorodność zmniejsza odchylenia w procesie amplifikacji preferencji PCR dla krótszych sekwencji i umożliwia skuteczne odzyskiwanie i dokładne zliczanie przestrzennie połączonych cząsteczek/fragmentów.
Tutaj opisujemy protokół, który dostosowuje technikę UMI-4C do identyfikacji i ilościowego określenia kontaktów chromatyny między promotorami i wzmacniaczami instruujących o linii czynników transkrypcyjnych podczas różnicowania EB.

<table><tbody><tr><td>0,1% Żelatyna EmbryoMax</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td></td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>10136224</td><td>Oczyszczanie 4C/DNA</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Hodowla</td></tr> <tr>komórkowa<td>Bioruptor Pico</td><td>Diagencode</td><td>B01060010</td><td>4C/sonikacja</td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td>4C</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0212</td><td>4C</td></tr><tr><td>cOmplete Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td>4C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 średni</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Cell hodowla</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>4C</td></tr><tr><td>ESGRO Czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td><td>EMD Milipore</td><td>ESG1107</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (37%)</td><td>Sigma</td><td>252549-25ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>GE17-1323-01</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>ThermoFischer</td><td>R0551</td><td>4C</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA polimeraza</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>4C</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I3021-50ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td></td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td>4C</td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>N2 suplement</td><td>Gibco</td><td>A1370701</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>NEBNext Przygotowanie biblioteki DNA NEB</td><td></td><td>E6040</td><td>4C</td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>4C/trawienie</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1036</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometr</td><td>ThermoFischer</td><td>Q33238</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Zestaw testowy</td><td>ThermoFischer</td><td>Q32851</td><td>4C</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>ThermoFischer</td><td>EN0531</td><td>4C</td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Hodowla</td></tr> <tr><td>komórkowaStemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>T4 Lufor reakcyjny ligazy DNA</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>4C</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny ligazy DNA</td><td>T4 NEB</td><td>M0202M</td><td>4C</td></tr></tbody></table>

identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4c)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Podczas rozwoju ssaków, losy komórek są determinowane poprzez ustanowienie sieci regulacyjnych, które definiują specyficzność, czas i przestrzenne wzorce ekspresji genów. Ciała embrionalne (EB) pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych są popularnym modelem do badania różnicowania trzech głównych listków zarodkowych i definiowania obwodów regulacyjnych podczas określania losu komórki. Chociaż dobrze wiadomo, że specyficzne tkankowo wzmacniacze odgrywają ważną rolę w tych sieciach poprzez interakcję z promotorami, przypisanie ich do odpowiednich genów docelowych nadal pozostaje wyzwaniem. Aby było to możliwe, potrzebne są podejścia ilościowe do badania kontaktów wzmacniacz-promotor i ich dynamiki podczas rozwoju. W tym przypadku zaadaptowaliśmy metodę 4C do zdefiniowania wzmacniaczy i ich kontaktów z pokrewnymi promotorami w modelu różnicowania EB. Metoda wykorzystuje często tnące enzymy restrykcyjne, sonikację i protokół PCR z zagnieżdżoną ligacją, kompatybilny z komercyjnymi zestawami do przygotowywania bibliotek DNA. Następnie biblioteki 4C poddawane są wysokoprzepustowemu sekwencjonowaniu i analizowane bioinformatycznie, co pozwala na wykrycie i kwantyfikację wszystkich sekwencji, które mają kontakt z wybranym promotorem. Uzyskane dane sekwencjonowania można również wykorzystać do uzyskania informacji na temat dynamiki kontaktów wzmacniacz-promotor podczas różnicowania. Technika opisana dla modelu różnicowania EB jest łatwa do wdrożenia.

Sześć dni po indukcji różnicowania ESC w wiszących kroplach, uzyskaliśmy jednorodną populację EB, które zostały wykorzystane do dalszych analiz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Dostosowaliśmy metodę UMI-4C23, aby określić ilościowo specyficzną interakcję chromatyny u promotorów genów specyficznych dla linii w EBs24. Schematyczny przegląd protokołu z reprezentatywnymi żelami do kontroli jakości na różnych etapach jest pokazany na Rysunek 2A. Przeprowadzono pierwszą kontrolę jakości w celu określenia skuteczności trawienia enzymem restrykcyjnym MboI. Efektywne trawienie wykazało rozmiar fragmentu mniejszy niż 3 kbp (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Warto zauważyć, że trawienie chromatyny mESC i EB było trudne, a czasami utrzymywała się resztkowa niestrawiona chromatyna. Druga kontrola jakości została przeprowadzona po ligacji, aby sprawdzić, czy większość fragmentów była teraz &gt; 3 kbp (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Następnie fragmenty chromatyny otrzymane po sonikacji analizowano za pomocą elektroforezy żelowej. Spodziewano się wielkości fragmentów 400-500 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</silna></silna></silna></silna>
Po defosforylacji i jednostronnym podwiązaniu adaptera, przeprowadzono dwie rundy PCR w celu wzmocnienia interesujących celów. Podejście zagnieżdżone wykorzystano do zaprojektowania zestawu dwóch starterów dla każdego locus. Pomogło to poprawić swoistość. Każdy cel został amplifikowany oddzielnie dwiema różnymi parami starterów w celu optymalizacji warunków PCR (tj. par starterów A i B dla locus Pou5f1 oraz par starterów C i D odpowiednio dla locus T) i spowodował rozmaz DNA około 400 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Alternatywnie, przeprowadzono multipleksowy PCR w celu jednoczesnego amplifikacji celów A i C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D) i uzyskano podobny rozmiar fragmentu po oczyszczeniu (<silna klasa="xfig"> Figura 2D). Startery używane do przygotowania biblioteki 4C (loci Pou5f1 i T) znajdują się w tabeli 6.</silna></silna></silna>
Do analizy danych, surowe odczyty sekwencjonowania zostały najpierw zestawione z genomem myszy mm10, wszystkie zostały zduplikowane, a odczyty o niskiej jakości (&lt; 20) zostały usunięte. Dla każdej przynęty uzyskano informacje o każdym fragmencie restrykcyjnym poprzez obliczenie liczby odczytanych fragmentów i uzyskano surowy profil kontaktowy. Następnie obszar zainteresowania zdefiniowano jako wszystkie fragmenty restrykcyjne z odległością 2 kbp i 250 kbp od przynęty. Rozmiar każdego fragmentu restrykcyjnego został zwiększony poprzez sekwencyjną agregację sąsiednich fragmentów restrykcyjnych w celu wygładzenia profili, aż do osiągnięcia progu 5% całkowitej liczby nieprzetworzonych kontaktów w obszarze zainteresowania. Aby upewnić się, że powtórzenia zostały zintegrowane, a warunki zostały porównane, uwzględniliśmy zarówno nachylenia, jak i losowe przechwycenia na poziomie fragmentów restrykcyjnych. Średni profil dla każdego warunku i zmiana zagięcia między nimi zostały wykreślone, jak pokazano na Rysunek 3. Podczas różnicowania EB kontakty między wzmacniaczami a promotorem genu pluripotencji Pou5f1 zmniejszyły się, podczas gdy kontakty wzmacniacz-promotor instruktażowego czynnika transkrypcyjnego T linii mesendodermy wzrosły (<silna klasa="xfig">Rycina 3), dostarczając funkcjonalnych informacji na temat tych wzmacniaczy rozwoju.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy mESC i pochodnych ciał zarodkowych. Dzień 0 mESC wyhodowany w warunkach bez surowicy (po lewej) i jednorodne EB dnia 6 (po prawej) obserwowane przez odwrócony mikroskop. Podziałka = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Przepływ pracy 4C i reprezentatywne obrazy głównych kroków protokołu. (A) Schematyczny przebieg pracy ilościowego 4C. RS = miejsce ograniczenia; US = upstream; DS = downstream; UP = uniwersalny podkład; D = odległość między RS i DS powinna wynosić idealnie 5-15 pz. (B) Przykłady chromatyny (I) trawionej przez MboI, chromatyny ligowanej w jądrach (II) i chromatyny sonikowanej (III). Liczby po lewej stronie wskazują rozmiary DNA określone przez drabinę DNA dla każdej próbki. (C) Przykłady amplifikacji PCR w dwóch loci: Pou5f1 (startery A i B) i T (startery C i D). (D) Przykłady amplifikacji multipleksowej PCR w loci Pou5f1 i T przy użyciu starterów A i C. ES = embrionalne komórki macierzyste; EB = ciała embrionalne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Przykłady profili 4C. Ilościowe profile 4C dla przynęt znajdujących się na promotorach genu Pou5f1 i T oznaczane w mESC i EBS dnia 6. Górny panel przedstawia wykresy średnich kontaktów wygenerowanych z dwóch niezależnych kontrprób biologicznych; dolny panel pokazuje średnią zmianę krotności kontaktowej EB dnia 6 w porównaniu z mESC (średnia z dwóch kontrprób). Jasnoniebieskie pola wskazują lokalizację wzmacniaczy z dynamicznymi zmianami podczas różnicowania. Rysunek zaczerpnięty z Tian et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl, pH 8,0</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mln NaCl</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x kompletne inhibitory proteazy Roche</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Woda</td>
			<td>4,74 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Bufor do lizy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na 1000 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Woda</td>
			<td>869 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X bufor ligazy DNA NEB T4</td>
			<td>120 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg / ml albuminy surowicy bydlęcej</td>
			<td>6 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 U / μL Ligaza DNA T4</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przygotowanie mieszanki głównej do podwiązania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dla 15 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X bufor reakcji szybkiej ligacji</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter NEBNext</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szybka ligaza DNA T4</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Reakcja na podwiązanie adaptera.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Konfiguracja PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biblioteka z adapterem na martwych</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda klasy PCR</td>
			<td>20,25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 μM Podkład specyficzny dla celu</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elementarz indeksu NEB 10 μM</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor Herculase II 5X</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Złącza dNTP 10 mm</td>
			<td>1,25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza Herculase II</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 1: 98 °C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 2: 98 °C - 20 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 3: 65 °C - 30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 4: 72 °C - 45 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 5: przejdź do kroku 2, aby wykonać w sumie 15-18 cykli</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 6: 72 °C - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 7: 4 °C – przytrzymaj</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Amplifikacja biblioteki interakcji chromatyny 4C, pierwszy PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zagnieżdżona konfiguracja PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA z pierwszego PCR</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda klasy PCR</td>
			<td>20,25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specyficzny podkład 10 μM + podkład P5 Illumina</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podkład 10 μM P7 Illumina</td>
			<td>3,75 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor Herculase II 5X</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Złącza dNTP 10 mm</td>
			<td>1,25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza Herculase II</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zagnieżdżony program PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 1: 98 °C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 2: 98 °C - 20 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 3: 65 °C - 30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 4: 72 °C - 45 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 5: przejdź do kroku 2, aby wykonać w sumie 15-18 cykli</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 6: 72 °C - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok 7: 4 °C – przytrzymaj</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Amplifikacja biblioteki interakcji chromatyny 4C, zagnieżdżony PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nazwa</td>
			<td>Sekwencja (5'-3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGAGAG</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>US-Oct4-A</td>
			<td>TCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Oct4-B</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT powiedział: CTCTTCCGATCTGTGTGTGTGTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-Październik 4-B</td>
			<td>ACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-T-C</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-T-C</td>
			<td>GATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-T-D</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGCAAGGAGACCCGGGAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>US-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC</td> powiedział:
		</tr>
		<tr>
			<td>Zasilacz UP-4C</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGA powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i1 (Biblioteka Adap-i1</td>)
			<td>CAAGCAGAGACGGCATACGAGATCGTGATGATGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i2</td> powiedział:
			<td>CAAGCAGAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i3 (Biblioteka ADAP-i3</td>)
			<td>CAAGCAGAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA CAAGCAGAGAGAGAGAGAGACGTGTGCTCTTCCGATC powiedział:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adap-i4 (Biblioteka Adap-i4</td>)
			<td>CAAGCAGAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTTCCGATC powiedział:</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Podstawki używane do przygotowania biblioteki 4C.

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Precyzyjna czasoprzestrzenna regulacja genów jest kontrolowana przez różne elementy cis-regulatorowe, które oddziałują między nimi. Nasz protokół umożliwia ilościowe badanie kontaktów chromatyny wybranych loci, takich jak promotory. Technika ta pozwala nam zidentyfikować i określić ilościowo częstotliwości interakcji między różnymi elementami regulatorowymi jednocześnie.Aby wygenerować ciała embrionalne, zacznij od hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy do 60% zbieżności. Następnie wyjmij pożywkę hodowlaną i przemyj dwukrotnie dwoma mililitrami wysterylizowanego PBS. Całkowicie usuń PBS i dodaj dwa mililitry pożywki do odrywania komórek.Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przez pięć minut dodać do naczynia osiem mililitrów pożywki różnicującej EB. Aby oddzielić kolonie mESC w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej, należy pipetować pożywkę w górę iw dół 15 do 20 razy i przenieść zawiesinę do 10-mililitrowej probówki.Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 300 razy g przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń supernatant. Po zliczeniu komórek ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej EB.Odwróć pokrywkę 15-centymetrowego naczynia hodowlanego. Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów nanieś 20-mikrolitrowe krople zawieszonych komórek na pokrywie. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na dolnej części naczynia hodowlanego.Inkubuj naczynie z wiszącymi kroplami przez trzy dni. Aby zebrać komórki po inkubacji, delikatnie umyj pokrywkę 10 mililitrami PBS. Przenieś PBS, który będzie zawierał EBs, do 50-mililitrowej plastikowej tuby.Po pozostawieniu probówki na 30 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant. EB zostaną pozostawione na dnie tuby. Delikatnie zawiesić EB w 10 mililitrach świeżej pożywki różnicującej EB.Przenieść zawiesinę na 10-centymetrową bakteriologiczną szalkę Petriego. Trzy do sześciu dni później użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić tworzenie się EB. EB powinny być okrągłe i jednorodnej wielkości.Zbierz EB z dwóch lub trzech 10-centymetrowych naczyń do 50-mililitrowej plastikowej tuby. Odwirować EB w temperaturze 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić EB w 10 mililitrach PBS.Ponownie odwirować EB w temperaturze 300 razy g w temperaturze pokojowej, tym razem przez trzy minuty. Usuń supernatant i dodaj dwa mililitry trypsyny-EDTA do osadu. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Podczas inkubacji pipetować w górę i w dół co trzy minuty, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Aby zatrzymać reakcję trypsyny, dodaj osiem mililitrów pożywki różnicującej EB. Po ponownym zawieszeniu komórek w świeżej pożywce EB dodaj paraformaldehyd do końcowego stężenia 1%Inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na zmianę.Ugasić formaldehyd, dodając glicynę do końcowego stężenia 0,125 mola. Zakończ proces utrwalania zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie zamroź granulki komórek w ciekłym azocie. Delikatnie ponownie zawieś osad komórek w świeżo przygotowanym lodowatym buforze do lizy i umieść probówkę na lodzie.Po 15 minutach odwirować komórki w temperaturze 1 000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i przemyć osad 500 mikrolitrami zimnego buforu do lizy. Ponownie zawiesić granulat w 1,5-mililitrowej tubie z 50 mikrolitrami 0,5% SDS w 1x buforze drugim i umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 62 stopni Celsjusza.Po 10 minutach wyjmij rurkę z bloku grzewczego i dodaj bufor do wytrawiania. Dobrze wymieszać pipetując, unikając nadmiernego pienienia, i inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zapewnić skuteczne trawienie enzymem restrykcyjnym, w tym protokole uwzględniliśmy powtarzalny etap trawienia.Dlatego ważne jest również, aby dobrze zawiesić jądra w buforze trawiennym. Dodaj kolejne 25 mikrolitrów buforu wytrawiającego, wymieszaj przez odwrócenie i weź osiem mikrolitrów jako niestrawioną kontrolę. Niestrawioną próbkę kontrolną należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.Następnie dodasz kilka porcji enzymu restrykcyjnego Mbol, inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod rotacją po każdej podwielokrotności. Weź osiem mikrolitrów jako strawioną próbkę kontrolną. Aby usunąć sieciowanie obu próbek kontrolnych, dodaj 80 mikrolitrów buforu TE w 10 mikrolitrach proteinazy K. Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Aby sprawdzić wydajność trawienia, uruchom 20-mikrolitrowe porcje na 0,6% żelu. Udane trawienia wykazują fragmenty głównie w zakresie od 3,0 do 5,0 kilopar zasad. Przygotuj DNA do strzyżenia zgodnie z opisem w rękopisie.Użyj sonikatora, aby ściąć DNA do rozmiaru od 150 do 700 par zasad. Przenieś ścięte DNA do normalnej, nowej probówki z bezpiecznym zamkiem, łącząc wiele dźwięków z tej samej próbki. Dodaj podgrzane kulki oczyszczające DNA w ilości równej 1,8-krotności istniejącej objętości i wymieszaj przez ponowne zawieszenie.Po pięciu minutach inkubacji zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Trzymając probówki w stojaku magnetycznym, umyj koraliki dwa razy jednym mililitrem świeżo przygotowanego 80% etanolu. Po wysuszeniu kulek na powietrzu w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut, eluuj DNA poprzez ponowne zawieszenie kulek w buforze 1x Tris.Za pomocą metody wiszącej kropli uzyskano jednorodną populację EB sześć dni po indukcji różnicowania ESC. Elektroforeza żelowa była wykonywana w całym protokole w celu kontroli jakości. Efektywne trawienie przez Mbol skutkuje fragmentami o wielkości mniejszej niż trzy pary kilozasad.Elektroforeza po podwiązaniu wykazała, że większość fragmentów była większa niż trzy pary kilozasad. Po sonikacji spodziewane są rozmiary fragmentów od 400 do 500 par zasad. Po defosforylacji i ligacji adaptera na jednym końcu przeprowadzono dwie rundy PCR w celu amplifikacji celów będących przedmiotem zainteresowania.Każdy cel został amplifikowany oddzielnie za pomocą dwóch różnych par starterów, A i B dla locus Pou5f1 oraz C i D dla locus T. Spowodowało to rozmaz DNA około 400 par zasad. Alternatywnie, przeprowadzono multipleksowy PCR w celu jednoczesnego amplifikowania celów A i C, co dało podobny rozmiar fragmentu po oczyszczeniu.W tych profilach 4C jasnoniebieskie pola wskazują lokalizację wzmacniaczy z dynamicznymi zmianami podczas różnicowania. Regiony chromatyny kontaktują się z promotorami genów Pou5f1 i T podczas różnicowania EB. Pou5f1 był regulowany w dół podczas różnicowania EB.I odwrotnie, T był regulowany w górę podczas różnicowania EB. Skuteczne trawienie enzymem restrykcyjnym, a następnie ligacja zbliżeniowa krzyżującego się genomowego DNA są kluczowymi czynnikami zapewniającymi powodzenie tego protokołu. Kolejną rzeczą jest projekt podkładu do przeszukiwania mapy kontaktów każdego locus.Procedura ta idealnie nadaje się do badania kontaktu chromatyny w docelowych loci. Jeśli wymagane są zmiany globalne, można zastosować podejścia obejmujące cały genom, takie jak Hi-C, wychwytywanie promotora Hi-C lub HiChIP.

identification-enhancer-promoter-contacts-embryoid-bodies

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przedstawiamy niewymagający kodowania przepływ pracy dla biologów w celu identyfikacji specyficznych tkankowo wzmacniaczy genów przy użyciu wyłącznie narzędzi opartych na przeglądarce. Nasz protokół wykorzystuje publiczne znaczniki histonowe H3K4me1/H3K27ac i dane Hi-C, umożliwiając naukowcom bez doświadczenia w programowaniu dostęp, analizę i identyfikację potencjalnych elementów regulacyjnych związanych z ich interesującymi genami.

Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę 4C do ilościowej analizy interakcji chromatynowych między wzmacniaczami a promotorami w ciałach embrionalnych myszy. Technika ta umożliwia badanie regulacji ekspresji genów podczas różnicowania komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C) (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Przeglądaj więcej filmów