Name: Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę zewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego z nerwu węchowego ryb morskich. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę wrażliwości węchowej niezależnie od zewnętrznego zasolenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez fundusze FEDER poprzez Regionalny Program Operacyjny Algarve - CRESC Algarve 2020 oraz przez Fundusze Krajowe za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia w ramach projektu ALG-01-0145-FEDER-30262 oraz projekty FCT PTDC/BIA-BMA/30262/2017, UID/Multi/04326/2019 i DL57/2016/CP1361/CT0041 (przyznane ZV).

Hodowla zwierząt i eksperymenty były prowadzone w certyfikowanych obiektach doświadczalnych i były zgodne z portugalskim ustawodawstwem krajowym (DL 113/2013) na podstawie licencji "grupy-1" wydanej przez Generalną Dyrekcję Weterynarii Ministerstwa Rolnictwa, Rozwoju Wsi i Rybołówstwa Portugalii. Ponieważ protokół ten obejmuje postępowanie ze zwierzętami, musi zostać zatwierdzony przez lokalny i/lub krajowy organ, który reguluje dobrostan zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach naukowych, ponadto naukowcy muszą mieć odpowiednie przeszkolenie i licencje do przeprowadzania takich procedur.
1. Przygotowanie bodźca
UWAGA: Większość ryb ma bardzo wrażliwy układ węchowy, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania bodźców węchowych do wykorzystania w eksperymencie. Szkło używane do przygotowania bodźców należy umyć w 5% wybielaczu (podchloryn sodu), dokładnie spłukać wodą z kranu i wysuszyć. Bezpośrednio przed użyciem dokładnie spłucz szklane naczynia wodą morską (tą samą wodą, której użyto do rozcieńczenia bodźca). Uważaj, aby żadna z tych wód nie miała kontaktu z gołą skórą.
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml 10-2 M L-glutaminy, L-leucyny i L-seryny; przechowywać po 1 ml porcji każdego z nich w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>W dniu doświadczenia przygotować z tych podwielokrotności roztwory od 10-3 M do 10-7 M (w krokach rozcieńczania x10) używając zarówno wody kontrolnej, jak i wody morskiej o wysokiej zawartości CO2. 
	UWAGA: L-seryna (10-3 M) będzie stosowana jako kontrola pozytywna lub standard. Woda używana do uzupełniania rozcieńczeń bodźców i traktowana dokładnie w taki sam sposób jak bodźce, ale bez dodatku jakiegokolwiek środka zapachowego, będzie używana jako kontrola ujemna lub ślepa próba.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wody o wysokiej zawartości CO2

<ol>
	<li>Przygotuj wodę kontrolną, zbierając 1 l wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym.
	<ol>
		<li>Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 8,2. Jeśli nie, bąbelkuj powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia tego pH.</li>
		<li>Za pomocą titratora zasadowego zmierz zasadowość wody.</li>
		<li>Zmierz temperaturę i zasolenie wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wodę o wysokiej zawartości CO2 , filtrując 1 l wody morskiej, a następnie bąbelkuj CO2 aż do osiągnięcia pożądanego pH.
	<ol>
		<li>Za pomocą sondy pH sprawdź pH; powinno wynosić około 7,7.</li>
		<li>Za pomocą titratora do zasadowości zmierz zasadowość wody.</li>
		<li>Zmierz temperaturę i zasolenie wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ciśnienie CO2 zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości CO2 za pomocą oprogramowania przeznaczonego do obliczania parametrów CO2 w wodzie (np. Oprogramowanie CO2Calc13).
	<ol>
		<li>W oknie wprowadzania dodaj wartości pH wody, temperatury, zasolenia i całkowitej zasadowości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Wybierz stałe, jednostki i skale (zobacz zalecane wartości w Rysunek 2).</li>
		<li>Naciśnij przycisk proces, aby określić ciśnienie CO2. 
		UWAGA: Rysunek 3 pokazuje przykładowy arkusz wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie ryby
UWAGA: W tym protokole użyto dorady o masie 200−400 g.
<ol>
	<li>Znieczulić rybę przez zanurzenie w napowietrzonej naturalnej wodzie morskiej zawierającej MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu). Gdy reakcja na uszczypnięcie ogona ustaje, wstrzyknąć w mięsień boczny bloker nerwowo-mięśniowy trietiodek gallaminy (10 mg·kg-1 w soli fizjologicznej). 
	UWAGA: Stężenie stosowanego środka znieczulającego różni się w zależności od gatunku; w przypadku dorady o masie 200−400 g należy użyć 200 mg·L-1 buforowanych 400 mg·L-1 NaHCO3.</li>
	<li>Umieść znieczuloną rybę na wyściełanym podporze. Dokładny kształt i rozmiar zależą od gatunku modelu; w przypadku dorady (200−400 g) użyj wyściełanej podpory w kształcie litery V, wykonanej we własnym zakresie.</li>
	<li>Umieść silikonową rurkę (średnica = 10 mm) w ustach, podłącz rurkę do pompy głębinowej w zbiorniku zawierającej środek znieczulający, napowietrzoną wodę morską i pompuj wodę przez skrzela o temperaturze ~100 ml · min-1 · kg-1, 
	UWAGA: Rozmiar użytej rurki silikonowej będzie zależał od wielkości ryby.</li>
	<li>Włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz go do stopnia głównego amplifier).</li>
	<li>Przykryj rybę wilgotną szmatką (lub ręcznikiem papierowym) z odsłoniętą tylko głową, upewniając się, że pokrycie nie utrudnia wydostawania się wody ze skrzeli. 
	UWAGA: Oczy można przykryć kawałkami wilgotnego papieru/szmatki lub czarnego plastiku.</li>
	<li>Umieść rurkę systemu dostarczania bodźca, tj. szklaną rurkę podłączoną do źródła wody morskiej w tle, do nozdrza. 
	UWAGA: Można stosować rurki mikrohematokrytu (długość = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); Można je przeciągnąć do drobniejszego punktu na ściągaczu elektrod do użytku z mniejszymi rybami. Ważne jest, aby upewnić się, że nabłonek węchowy jest mokry podczas operacji (opisanej poniżej).</li>
	<li>Odsłoń nerwy węchowe, usuwając skórę i kość czaszki między oczami (nerwy węchowe zwykle biegną razem między oczami) za pomocą wiertła dentystycznego (najlepiej) lub hobbystycznego (np. Dremela) lub polerki jubilerskiej (z wiertłami dentystycznymi) pod mikroskopem preparacyjnym (wewnątrz klatki Faradaya).
	<ol>
		<li>U dorady usuń część czaszki bezpośrednio nad oczami za pomocą piły tarczowej, od przodu do oczu do tyłu. Następnie za pomocą wiertła usuń kość między oczami; Nerwy węchowe leżą między oczami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości usuń tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy za pomocą cienkich kleszczy; uważaj, aby nie uszkodzić nerwów ani nie przebić żadnych naczyń krwionośnych. 
	UWAGA: Doświadczenie pomoże udoskonalić sekcję; Im mniejsza rozwarstwienie, tym bardziej stabilny będzie preparat. Jednakże musi zostać oczyszczona wystarczająca ilość tkanki; Dla niedoświadczonych, gdy opuszki węchowe są tylko widoczne, wyczyść je nieco bardziej do przodu, aby odsłonić część nerwów, gdy łączą się z opuszkami, aby umożliwić prawidłowe ustawienie elektrod.</li>
	<li>Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna źródła prądu stałego 3 V (np. dwie baterie AA połączone szeregowo) i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej (lub wodzie morskiej rozcieńczonej 1:3 w słodkiej wodzie) na 20−30 s; z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych pęcherzyków.</li>
	<li>Po odsłonięciu nerwów węchowych należy umieścić elektrody rejestrujące (trzymane na mikromanipulatorach) w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec (np. 10-3 M L-serynę) i minimalną odpowiedź na ślepą próbę. Użyj elektrod wolframowych pokrytych parylenem (tabela materiałów) podłączonych do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennego (AC). 
	UWAGA: U dorady najsilniejsze reakcje na aminokwasy obserwuje się zwykle za pomocą elektrod umieszczonych po bocznej stronie nerwu, blisko miejsca, w którym łączy się z opuszką węchową. Może to dotyczyć innych gatunków, ponieważ organizacja kłębuszków nerkowych cebulki jest zasadniczo podobna wśród gatunków. Jednak doświadczenie jest zawsze najlepszym nauczycielem.</li>
</ol>
4. Zapis elektrofizjologiczny
UWAGA: Podobnie jak w przypadku większości elektrofizjologii, zapis wielu jednostek musi odbywać się w klatce Faradaya. Jednak nagrywanie zewnątrzkomórkowe zwykle nie wymaga stołu antywibracyjnego; Większość ruchu będzie pochodzić od ryby. Niemniej jednak wymagany jest mocny, stabilny stół z metalową powierzchnią do zabezpieczenia podstaw magnetycznych stojaków mikromanipulatorów.
<ol>
	<li>Skonfiguruj system dostarczania bodźców, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec, np. za pomocą zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem. Podłączyć wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej i umieścić jedną linię w zbiorniku wody morskiej, a drugą w roztworze testowym. 
	UWAGA: Gdy zawór jest przełączany (poprzez przepuszczanie prądu stałego), przepływ wody przełącza się z wody tła na wodę zawierającą nawaniacz. Bodziec powinien być podawany wystarczająco długo, aby zobaczyć wyraźny szczyt zintegrowanej odpowiedzi, po którym następuje okres akomodacji; Czas stosowany w obecnym protokole wynosi 4 s, ale w zależności od gatunku może być konieczne wydłużenie czasu.</li>
	<li>Podłącz sterownik zaworu do spustu przetwornika analogowo-cyfrowego (np. Digidata); gdy zawór zostanie przełączony z linii tła na linię zawierającą bodziec, rozpocznie to rejestrację danych. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwalania i kontynuowało przez określony czas (np. 10 s). 
	UWAGA: Dziesięć sekund powinno wystarczyć, ale można to skrócić lub wydłużyć, w zależności od pytania eksperymentalnego.</li>
	<li>Sprawdź stabilność preparatu, testując (rejestrując i mierząc amplitudę zintegrowanej odpowiedzi) wielokrotnie z wzorcem, w tym przypadku 10-3 M L-seryną, i pozwalając, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta. 
	UWAGA: W zależności od gatunku i substancji zapachowej, reakcje powinny mieć amplitudę w granicach 10% od siebie (z reguły) i powinny mieć szybki początek, wzrosnąć do maksymalnej aktywności i powrócić do stanu wyjściowego po braku bodźca (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej (od najniższego do najwyższego stężenia) i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła 1 minuta. 
	UWAGA: Możliwe, że w przypadku niektórych gatunków i/lub niektórych substancji zapachowych potrzeba więcej czasu. Ale w przypadku aminokwasów i dorady wystarczy 1 minuta.</li>
	<li>Zapisać reakcję na 10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej.</li>
	<li>Zmień wodę tła z kontrolnej wody morskiej na wodę morską o wysokiej zawartości CO2, umieszczając linię tła w butelce z wodą morską o wysokiej zawartości CO2. 
	UWAGA: Zaleca się włożenie innej rurki hematokrytu (lub odpowiednika) do końca bodźca i linii tła, aby uniknąć dotykania wody i upewnić się, że koniec rurki pozostaje w wodzie.</li>
	<li>Przed przetestowaniem odpowiedzi nerwu węchowego na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO2 należy kondycjonować nabłonek węchowy wodą o wysokiej zawartości CO2 , podążając za wodą o wysokim CO2 po nabłonku węchowym przez kilka minut. 
	UWAGA: Doświadczenie pokazuje, że w przypadku morlesza dorada wystarczy 5 minut.</li>
	<li>Rejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości CO2 (od najniższego do najwyższego stężenia).</li>
	<li>Zapisać reakcję na roztwór ślepej próby wodnej o wysokim stężeniu CO2 .</li>
	<li>Zapisać reakcję na 10-3 M serynę i kontrolny roztwór ślepej próby wodnej. 
	UWAGA: Surowy sygnał (aktywność nerwów) należy przefiltrować (dolnoprzepustowy około 2 000−5 000 Hz, górnoprzepustowy 50−300 Hz) i przekazany do przetwornika analogowo-cyfrowego (Tabela materiałów). W celu łatwiejszego ilościowego określenia aktywności nerwów, surowy sygnał można również zintegrować za pomocą nieszczelnego integratora (Tabela materiałów) i przekazać do przetwornika analogowo-cyfrowego, a stamtąd zarówno surowe, jak i zintegrowane sygnały do komputera z odpowiednim oprogramowaniem (np. Axoscope).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Odejmij amplitudę zintegrowanej odpowiedzi na ślepą próbę (w mV) od amplitudy zintegrowanych odpowiedzi na wszystkie bodźce.</li>
	<li>Normalizuj reakcje na bodźce, dzieląc amplitudę poprzedniej odpowiedzi na wzorzec (10-3 M seryny); zmniejsza to zmienność między rybami i wewnątrz nich.</li>
	<li>Oblicz progi wykrywania przez regresję liniową krzywych stężenie-odpowiedź (na wykresie półlogarytmicznym), zgodnie ze wzorem log(N + 1,5) = log C + B, gdzie C to stężenie molowe, N to znormalizowana amplituda odpowiedzi, a a i b są stałymi7,14. 
	UWAGA: Próg wykrywania jest wtedy wartością x, gdzie y = 0,1761 (tj. log 1,5; N = 0); Stężenie, powyżej którego będzie widoczna reakcja (tj. ryba może ją wyczuć). Niektóre substancje zapachowe wywołują sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź, gdy są wykreślane półlogarytmicznie (np. calcium15,16; w tym przypadku znormalizowane dane można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, który da maksymalną amplitudę odpowiedzi i EC50 (tj. [nawaniacz], który daje połowę maksymalnej odpowiedzi; również miarę czułości).</li>
	<li>Porównać progi wykrywalności i/lub maksymalną amplitudę odpowiedzi oraz EC50 bodźców badanych w wodzie kontrolnej i badanych w wodzie o wysokiej zawartości CO2 .</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu opisano zastosowanie wielojednostkowego (zewnątrzkomórkowego) zapisu z nerwu węchowego dorady (S. aurata), morskiego sparida o dużym znaczeniu w akwakulturze. Jednak to eksperymentalne podejście może być szeroko stosowane do innych ryb; Operacja i dokładne rozmieszczenie elektrod będzie wyraźnie zależało od anatomii układu węchowego, a wybór i stężenie środka znieczulającego może zależeć od badanego gatunku. Na przykład nerw węchowy złotej rybki (Carassius auratus) jest krótki; w takim przypadku rejestracja EEG z opuszki węchowej byłaby łatwiejsza. Wybór środka zapachowego może również w pewnym stopniu zależeć od gatunku. W obecnym badaniu wykorzystano aminokwasy. O ile wiadomo autorom, wszystkie badane do tej pory gatunki ryb mają wrażliwość węchowąna aminokwasy 1,18. Wrażliwość ta została związana z różnymi procesami, takimi jak lokalizacja żywności, komunikacja chemiczna i rozpoznawanie wód urodzeniowych 19,20,21,22,23. Jednak wrażliwość różnych gatunków jest, ogólnie rzecz biorąc, dość podobna i nie zależy od stylu życia ani siedliska. Są to również dobrze zdefiniowane cząsteczki, które są tanie i łatwo dostępne. Te powody sprawiają, że są one idealnymi bodźcami testowymi do badań nad węchem u ryb, zwłaszcza tych badających skutki zakłóceń antropogenicznych (np. zakwaszenie lub zanieczyszczenie), gdzie wyniki można łatwo porównać między gatunkami24.
W zależności od danego gatunku, przygotowania do rejestracji wielojednostkowej mogą pozostać stabilne przez kilka godzin; amplituda odpowiedzi na wzorzec wewnętrzny (10-3 M L-seryna w obecnym badaniu) nie powinna różnić się o więcej niż 10% pomiędzy kolejnymi testami. Jakiekolwiek znaczące odchylenie od tej zasady może być spowodowane: (i) ruchem ryby, a tym samym przemieszczeniem elektrod i/lub rurki nosowej; (ii) zanieczyszczenie wody, na przykład poprzez kontakt z rękami eksperymentatora (zwłaszcza jeśli niższe stężenia danego środka zapachowego dają większe reakcje niż wyższe stężenia); lub (iii) pogorszenie stanu zdrowia preparatu). W przypadku i) ryba powinna zostać sprawdzona pod kątem przemieszczenia; Jeśli tak, zmień jego położenie i dodaj więcej środka znieczulającego do wody i/lub podaj kolejną dawkę trietiodku galaminy. Odczekaj 5 minut i ponownie przetestuj standard. Jeśli odpowiedź jest nadal mniejsza, należy zmienić położenie elektrod i/lub rurki nosowej, aż zostanie zarejestrowana wystarczająco duża odpowiedź. W przypadku (ii) po prostu należy ponownie przygotować serię świeżych rozcieńczeń środka zapachowego, używając czystego szkła i wody. W przypadku (iii) należy sprawdzić, czy przepływ wody przez skrzela ryby jest odpowiedni, czy woda przepływa przez skrzela (tj. wypływa przez wieczko, a nie przez otwór gębowy) oraz czy woda jest dobrze napowietrzona. Różne gatunki ryb mają bardzo różne preferencje temperaturowe; zapewnić, aby laboratorium) (i temperatura wody mającej kontakt z rybami) była jak najbardziej zbliżona do temperatury, w której ryby są trzymane. Upewnij się również, że ryby nie są zestresowane i unikaj przenoszenia ich (nawet z jednego zbiornika do drugiego) przez co najmniej tydzień przed nagraniem. Szum elektryczny jest oczywiście zmorą życia elektrofizjologa; Jednak obecny artykuł nie jest odpowiednim medium do dyskusji o tym, jak to przezwyciężyć/zredukować. Niemniej jednak "The Axon Guide" (dostępny bezpłatnie w formacie PDF do pobrania ze strony producenta) jest źródłem praktycznych porad dotyczących minimalizacji hałasu. Gdy standardowa stymulacja wywoła dużą, stabilną odpowiedź, a szereg stężeń da zależny od stężenia wzrost amplitudy, przy minimalnej odpowiedzi na ślepą próbę, można rozpocząć rejestrowanie odpowiedzi na bodźce testowe. Niektórzy autorzy podają ten sam bodziec trzy razy i obliczają średnią arytmetyczną do późniejszej analizy danych. Są to jednak repliki techniczne, a takie podejście wydłuży czas sesji nagraniowej trzykrotnie. Obecni autorzy wolą testować dany środek zapachowy raz, ale zawsze w ramach krzywej stężenie-odpowiedź. Pozwala to nie tylko na obliczenie progu wykrywalności lub EC50 (zgodnie z opisem), ale także zapewnia badanie stężeń bliskich stężeniom, których ryby doświadczyłyby w swoim naturalnym środowisku (nie zawsze jest to znane). Co więcej, wszelkie reakcje odstające, na przykład spowodowane zanieczyszczeniem, są łatwiejsze do wykrycia; W razie potrzeby można je następnie powtórzyć przy użyciu świeżo pobranej próbki.
Wielojednostkowy zapis z nerwu węchowego może być inwazyjny, ale jest bardziej czuły niż EOG, gdy jest rejestrowany w wodzie morskiej7, ponieważ jest niezależny od zewnętrznego zasolenia. Można go zatem wykorzystać do oceny wrażliwości węchowej na substancje zapachowe, takie jak wapń i sód, których zmiany stężeń również wpłynęłyby na przewodność, a w konsekwencji na zarejestrowane napięcia15. Jako oszacowanie liczby ORN reagujących na dany zapach (tj. potencjały czynnościowe przemieszczające się wzdłuż aksonów ORN od nabłonka węchowego do bańki), reprezentuje on surowy, nieprzetworzony sygnał (wstępne przetwarzanie bodźca węchowego rozpoczyna się w opuszkach). W związku z tym lepszym parametrem do oceny bezpośredniego wpływu zanieczyszczeń, takich jak metale ciężkie, oraz zmian środowiskowych, takich jak pH, na układ węchowy niż EOG czy EEG24,25. Na zapis z opuszki węchowej w wodzie morskiej o wysokim pHCO2 (a zatem o niskim pH) może mieć wpływ centralny wpływ pH na przetwarzanie nerwowe; "Teoriareceptora GABA A" zakwaszenia oceanów26, w której obniżenie pH wody powoduje redystrybucję jonów Cl- i HCO3- w płynie mózgowo-rdzeniowym, a w konsekwencji przesunięcie aktywacji GABA-ergicznej z hamującej (hiperpolaryzującej) na pobudzającą (depolaryzującą). Ponadto w takich badaniach ważne jest, aby ocenić skutki zakwaszenia lub zanieczyszczeń przy użyciu stężeń nawaniaczy podobnych do tych, z którymi ryby mogą się zetknąć w swoim naturalnym środowisku. W przypadku aminokwasów jest to zakres od nano do mikromolowych 27,28,29; blisko progu wykrywalności tych związków w rybach 1,18. Oszacowanie progu wykrywalności danego środka zapachowego może dać pewne wyobrażenie o znaczeniu i/lub biologicznej roli wrażliwości węchowej. Na przykład minóg morski (Petromyzon marinus) ma wysoką wrażliwość węchową na określone kwasy żółciowe uwalniane przez larwy do progu 10-13 M30; Ta czułość pozwala dorosłym osobnikom zlokalizować i zidentyfikować odpowiednie tarliska, a tym samym działać jako feromon wędrowny na duże odległości. Podobnie dojrzałe samice minoga morskiego mają wysoką wrażliwość węchową na sperminę (próg 10-14 M), poliaminę uwalnianą w mleczu przez samce, która następnie przyciąga je do gniazd plemników samców31. Inne ryby również wykazują wrażliwość węchową na poliaminy 32,33,34,35, ale nie z wystarczająco niskimi progami wykrywalności, aby wspierać podobną rolę feromonową; Zamiast tego sugeruje się unikanie rozkładających się ryb. Niemniej jednak, przy tak wysokiej wrażliwości węchowej, można sobie wyobrazić, że niewielkie zmniejszenie wrażliwości (tj. wzrost progu), nawet jeśli amplituda odpowiedzi nie jest dramatycznie zmniejszona, może spowodować poważne problemy dla ryb24.
Przy wykreślaniu półlogarytmicznym krzywe stężenie-odpowiedź na substancje zapachowe mogą być wykładnicze, liniowe lub sigmoidalne18. W przypadku aminokwasów takie półlogarytmiczne krzywe stężenie-odpowiedź są albo liniowe (tj. logarytmiczne), sigmoidalne lub funkcje potęgowe7. To, że nie obserwuje się nasycenia odpowiedzi (tj. brak plateau na krzywej stężenie-odpowiedź, nawet przy stężeniach ponadśrodowiskowych) jest prawdopodobnie spowodowane wiązaniem się kilku receptorów z poszczególnymi aminokwasami, w zależności od ich stężenia, a nie wiązaniem się każdego aminokwasu z określonym receptorem; Wraz ze wzrostem stężenia danego aminokwasu, więcej receptorów jest w stanie go związać i tym samym zareagować. Niemniej jednak ryby potrafią rozróżniać mieszaniny aminokwasów 36,37,38,39; Jest to prawdopodobnie spowodowane kombinatorycznymi wzorcami aktywności wywoływanymi w opuszkach węchowych 12,40; aksony wszystkich ORN wyrażających to samo białko receptorowe kończą się na tych samych kłębuszkach w opuszkach węchowych 41,42, a jeden aminokwas może aktywować więcej niż jeden kłębuszek nerkowy.
Jednak wysoce specyficzne substancje zapachowe, takie jak feromony, mogą wywoływać sigmoidalne lub quasi-sigmoidalne krzywe stężenie-odpowiedź43,44. Wniosek, choć nie przetestowany empirycznie, jest taki, że te reakcje węchowe są spowodowane wysoce specyficznymi receptorami, które wiążą cząsteczkę feromonu i niewiele więcej. W związku z tym powyżej danego stężenia wszystkie receptory są zajęte, a dalsze wzrosty nie będą wywoływać dalszych odpowiedzi w innych ORN. W związku z tym dane te można dopasować do trzyparametrowego wykresu Hilla, a maksymalną odpowiedź, EC50 i współczynnik Hilla można obliczyć 15,45,46. Może to dostarczyć cennych informacji, takich jak pozorne powinowactwo i pozorna liczba receptorów, których nie mogą dostarczyć liniowe lub wykładnicze krzywe stężenie-odpowiedź.

Ryby polegają głównie na węchu w wielu aspektach swojego życia, w tym między innymi w poszukiwaniu pożywienia, unikaniu drapieżników, ocenie potencjalnych partnerów i migracji1,2,3. Dlatego ocena wrażliwości węchowej ryb (Co one pachną? Jak bardzo są wrażliwe na te związki?) jest niezbędne do pełnego zrozumienia tych procesów. Co więcej, antropogeniczne skutki dla środowiska, takie jak zakwaszenie i zanieczyszczenie oceanów, mogą mieć głęboki wpływ na układ węchowy, nawet na poziomach subletalnych, ponieważ jest on koniecznie w bliskim kontakcie z otaczającą wodą4. Elektrofizjologia in vivo jest eksperymentalnym podejściem z wyboru do oceny wrażliwości węchowej ryb. Dostępne są trzy główne techniki: elektroolfaktogram (EOG), elektroencefalogram (EEG) rejestrowany z opuszki węchowej oraz zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego 5.
EOG jest najczęściej używanym z tych trzech6. Jest to potencjał pola prądu stałego (DC) zarejestrowany powyżej nabłonka węchowego i uważa się, że są to zsumowane potencjały generatora neuronów receptorów węchowych (ORN) reagujących na dany środek zapachowy. Ponieważ jednak amplituda odpowiedzi jest rejestrowana w wodzie, a nie wewnątrz ryby, zależy nie tylko od sygnału generowanego przez rybę, ale także od przewodności otaczającej wody; Im wyższa przewodność (lub im niższa rezystancja), tym niższa będzie amplituda. Może to oznaczać, że EOG jest mniej czułą metodą w wodzie morskiej niż słodkowodne7.
EEG rejestrowane z opuszki węchowej jest również szeroko stosowane w badaniach węchu u ryb. Jednak opuszka węchowa jest centrum przetwarzania pierwszego rzędu dla węchowych danych sensorycznych8; Jest on wysoce zorganizowany w kłębuszki nerkowe, w związku z czym zarejestrowana odpowiedź zależy w dużym stopniu od położenia elektrod rejestrujących. Na przykład dane wejściowe z ORN wykrywające aminokwasy są przetwarzane przez kłębuszki nerkowe w bocznej części opuszki węchowej, podczas gdy te z substancji chemicznych pochodzących z tego samego gatunku są kierowane do regionu przyśrodkowego9,10,11,12. Bodźce feromonalne mogą być kierowane do silnie zlokalizowanych kłębuszków nerkowych w obrębie opuszki węchowej. W zależności również od anatomii danego gatunku, idealna pozycja zapisu dla danego środka zapachowego może nie być łatwo dostępna.
Wielopunktowy zapis z nerwu węchowego pozwala obejść główne problemy z EOG i EEG opisane powyżej. Ponieważ rejestruje potencjały czynnościowe przechodzące w dół aksonów ORN z nabłonka do bańki, jest to pierwotny sygnał sensoryczny. A ponieważ jest to rejestrowane wewnątrz ryby, amplituda odpowiedzi jest niezależna od zewnętrznego zasolenia. Niemniej jednak ma to oczywiście pewne wady. Po pierwsze, w zależności od anatomii gatunku, w celu odsłonięcia nerwu węchowego wymagana jest bardziej rozległa operacja niż w przypadku EOG. Po drugie, ponieważ sygnał jest mniejszy niż EOG, wymaga nieco bardziej wyrafinowanego, a co za tym idzie drogiego sprzętu. Ogólny opis innych podejść eksperymentalnych jest podany przez Johna Caprio5. Celem tego artykułu jest nakreślenie, w jaki sposób rejestrować zewnątrzkomórkowe wielojednostkowe odpowiedzi nerwu węchowego dorady (Sparus aurata) in vivo na aminokwasowe substancje zapachowe jako przykład tej techniki oraz jak zidentyfikować i przezwyciężyć niektóre z najczęstszych problemów napotykanych w takim eksperymencie.

<table><tbody><tr><td>Przedwzmacniacz prądu przemiennego</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)</td><td>NL104</td><td>Przedwzmacniacz Neurolog specjalnie zaprojektowany do tego typu nagrań.</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)</td><td>1440A</td><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy.</td></tr><tr><td>EMG Integrator</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)</td><td>NL703</td><td>Nieszczelny integrator elektryczny do integracji surowej aktywności nerwu.</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Wykonana we własnym zakresie</td><td></td><td>W celu zmniejszenia hałasu elektrycznego.</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, Wielka Brytania)</td><td>NL125/6</td><td>Moduł filtrujący do zapisu elektrofizjologicznego.</td></tr><tr><td>Trietiodek galaminy</td><td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td><td>G8134</td><td>Bloker nerwowo-mięśniowy</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td><td>G3126</td><td>Aminokwas stosowany jako środek zapachowy</td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td><td>L80000</td><td>Aminokwas stosowany jako środek zapachowy</td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td><td>S4500</td><td>Aminokwas stosowany jako środek zapachowy</td></tr><tr><td>Metaliczny płyta bazowa</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Stanowi podstawę dla mikromanipulatorów.</td></tr><tr><td>Rurki mikrohematokrytu</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Do umiejscowienia dopływu wody do nabłonka węchowego</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Narishige International Ltd (Londyn, Wielka Brytania)</td> <td>M-152</td><td>Elektrody pozycyjne</td></tr><tr><td>MS222 (sól metanosulfonianu etylo-3-aminobenzoesanu)</td> <td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td> <td>E10505</td><td>Anestezjologiczna</td></tr><tr><td>sonda pH</td><td>Instrumenty Hanna (P&oacute; voa de Varzim, Portugalia)</td><td>HI12302</td><td>Sonda do pomiaru pH wody.</td></tr><tr><td>Refraktometr</td><td>Hanna instrumenty (P&oacute; voa de Varzim, Portugalia)</td><td>HI96822</td><td>Refraktometr do pomiaru zasolenia wody</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich (Portugalia)</td><td>746398</td><td>Do roztworu soli</td></tr><tr><td>Zawory elektromagnetyczne</td><td>The Lee Co. (Essex, CT, USA)</td><td>LFAA1201618H</td><td>Do przełączania między wodą tła a roztworami stymulacyjnymi (już niedostępnymi)</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss, Leica, Olympus</td><td>Każdy odpowiedni model.</td><td>Do preparowania i umieszczania elektrod.</td></tr><tr><td>Titrator</td><td>Hanna (P&oacute; voa de Varzim, Portugalia)</td><td>HI84531</td><td>Titrator do pomiaru zasadowości wody, pH i temperatury.</td></tr><tr><td>Mikroelektrody wolframowe 0,1 M&Omega;</td><td>World Precision Instruments (Hitchin, Wielka Brytania)</td><td>TM31A10</td><td>Elektrody zewnątrzkomórkowe.</td></tr><tr><td>Sterownik zaworu</td><td>Wykonane we własnym</td><td></td><td>źródle 12 V DC do obsługi zaworów elektromagnetycznych.</td></tr><tr><td>Pompa wodna (zatapialna)</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Do dostarczania wody zawierającej środek znieczulający do skrzeli ryb.</td></tr></tbody></table>

zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts

Ostatnie badania wykazały, że zakwaszenie oceanów wpływa na zachowania węchowe ryb. Może to być częściowo spowodowane zmniejszeniem wrażliwości węchowej w wodzie o wysokim pH PCO 2 / niskim pH. Aby ocenić skutki zakwaszenia oceanów lub ogólnie wrażliwości węchowej u ryb morskich, proponujemy, aby metodą z wyboru był zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego. Chociaż jest inwazyjny, jest czuły, wytrzymały, powtarzalny i niezależny od zewnętrznego zasolenia (w przeciwieństwie na przykład do elektroolfaktogramu [EOG]). Co więcej, rejestruje pierwotne dane sensoryczne do OUN, przed jakimkolwiek centralnym przetwarzaniem. Pokazujemy, że ta metoda może wykazać zmniejszenie wrażliwości węchowej, która jest zarówno tymczasowa, jak i zależna od zapachu, wykorzystując szereg aminokwasów do konstruowania krzywych stężenie-odpowiedź i obliczania progów wykrywania.

Na Rysunku 4 przedstawiono typową odpowiedź na kontrolę pozytywną (10-3 M L-seryny; Rysunek 4A) oraz kontrolę negatywną (próba ślepa; Rysunek 4B) zarejestrowaną z nerwu węchowego leszcza morskiego. W obecności bodźca (czarny poziomy pasek; w jamie węchowej, w kontakcie z nabłonkiem węchowym) zauważalny jest szybki wzrost aktywności (odzwierciedlony w wychyleniu sygnału zintegrowanego w górę) do szczytu w ciągu około jednej sekundy od rozpoczęcia bodźca, po którym następuje okres akomodacji (podczas gdy bodziec jest nadal obecny) i powrót do aktywności bazowej po zakończeniu bodźca. Bezwzględna amplituda odpowiedzi jest silnie zależna od położenia elektrody; jeśli zarejestrowana amplituda odpowiedzi jest niska, należy spróbować zmienić położenie elektrod. Wolniejszy wzrost do szczytowej aktywności może wynikać z faktu, że rurka doprowadzająca wodę z bodźcem do nabłonka węchowego została umieszczona zbyt daleko od nabłonka; należy spróbować przesunąć rurkę nosową bliżej nabłonka (ale bez dotykania go). Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do tego, próba ślepa wywołuje niewielką odpowiedź lub nie wywołuje jej wcale. Znacząca odpowiedź pozytywna (tj. wzrost aktywności) na próbę ślepą może wskazywać na zanieczyszczenie wody użytej do przygotowania rozcieńczeń bodźców; przygotowanie świeżych rozcieńczeń w czystej wodzie (i czystym szkle laboratoryjnym) powinno rozwiązać ten problem. Jeśli nie, konieczne może być dokładniejsze oczyszczenie systemu wodnego (w tym filtrów z węglem aktywnym). Odpowiedź negatywna (tj. spadek aktywności) może wskazywać na niewielką zmianę natężenia przepływu podczas przełączania zaworu, spowodowaną np. zablokowaniem zaworu.
Typowa krzywa koncentracja-odpowiedź (przedstawiona w skali półlogarytmicznej), w tym przypadku dla L-leucyny (od 10-7 M do 10-3 M), jest pokazana na Rysunku 5A. Należy zauważyć, że zwiększające się stężenia substancji zapachowej wywołują coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym wzrost amplitudy odpowiedzi zintegrowanych. Wykres znormalizowanych danych oraz odpowiadająca im regresja liniowa są przedstawione na Rysunku 5B. Szacowany próg detekcji można obliczyć z wartości x, gdy y = 0,1761 (tj. log1,5; gdzie N = 0). W tym przypadku wartość ta wynosi -7,48; oznacza to, że obliczony próg dla L-leucyny u tej ryby wynosi 10-7.48 M. Wykładnik α można w podobny sposób oszacować z regresji liniowej znormalizowanych danych na wykresie log-log; logN = αlog[substancja zapachowa] + stała. Współczynnik γ określa zatem wzrost stężenia substancji zapachowej wymagany do zwiększenia amplitudy odpowiedzi o jedną jednostkę logarytmiczną; jest to zatem szacunek nachylenia krzywej koncentracja-odpowiedź17. W tym przykładzie α = 0,277 i γ = 3,61; zatem, aby dziesięciokrotnie zwiększyć amplitudę odpowiedzi (tj. o jedną jednostkę logarytmiczną; log10 = 1), stężenie bodźca musi zostać zwiększone 103.61 razy (4074-krotnie).
Typową sigmoidalną krzywą zależności odpowiedzi od stężenia (Rysunek 6A) przedstawioną w skali półlogarytmicznej, w tym przypadku dla L-glutaminy, pokazano na Rysunku 6B>. Widoczny jest podobny zależny od stężenia wzrost amplitudy odpowiedzi; jednak przy wyższych stężeniach wzrost ten słabnie, aż amplituda odpowiedzi osiągnie wartość maksymalną (Nmax). Pozwala to na dopasowanie danych do trójparametrowego równania Hilla: 
<img alt="Równanie krzywej wiązania ligandu; N/Nmax=[odorant]^n/(EC50n+[odorant]^n); schemat wzoru." src="/files/ftp_upload/60962/60962eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
W ten sposób można obliczyć EC50 (stężenie substancji zapachowej, przy którym wywołuje się 50% maksymalnej odpowiedzi) oraz współczynnik Hilla (miara nachylenia stoku liniowej części krzywej sigmoidalnej).
<img alt="Interfejs CO2Calc, pola ręcznego wprowadzania danych do obliczeń systemu węglanowego, w tym wartości pH i TA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania danych z programu CO2Calc. Wyróżnione (czerwone ramki) są pola wymagane do obliczenia parametrów węglanowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs preferencji obliczeń CO2 z parametrami: stała, skala pH, bor, strumień powietrze-morze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wprowadzania odpowiednich stałych, jednostek i skal. Przedstawione wartości są zalecane dla warunków, w których przeprowadzono opisane eksperymenty; mogą one ulec zmianie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela wejść i wyjść chemii oceanicznej; zasolenie, poziomy węglanów, strumień CO2, analiza temperatury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zrzut ekranu oprogramowania przedstawiający okno wyników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy sygnału nerwowego: zintegrowana odpowiedź na 10^-3 M L-serynę w porównaniu z kontrolą pustą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Typowe odpowiedzi wielkojednostkowe zarejestrowane zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego dorady in vivo w odpowiedzi na 10-3 M L-serynę (A) oraz próbę pustą (B). Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady przedstawiają surowy sygnał (nerwowy). Bodźce aplikowano do nabłonka węchowego (paski poziome). Zauważalny jest gwałtowny wzrost aktywności podczas 1 s ekspozycji, szczyt aktywności, a następnie okres akomodacji (podczas gdy substancja zapachowa była nadal dostarczana do nabłonka) i powrót do poziomu bazowego po ustaniu dostarczania substancji zapachowej. Mały lub żaden wzrost aktywności jest widoczny po stymulacji wodą traktowaną w ten sam sposób co rozcieńczenia substancji zapachowej, z wyjątkiem dodania jakiejkolwiek substancji zapachowej (próba pusta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Odpowiedź nerwu na stężenia L-leucyny; zawiera wykresy sygnałów nerwowych (A) i analizę logarytmiczną (B)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Typowa krzywa zależności odpowiedzi od stężenia L-leucyny zarejestrowana zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-leucyny aplikowanej do nabłonka węchowego (poziome paski) od 10-7 M do 10-3 M, obserwuje się towarzyszący wzrost aktywności nerwu. Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady surowy sygnał (nerwowy). (B) Regresja liniowa (R2 = 0,97) znormalizowanych danych przedstawionych w skali półlogarytmicznej w celu obliczenia progu detekcji jako wartości dla log[L-leucyna], gdy log(N + 1,5) = 0,1761 (tj. gdzie N = 0). W tym przykładzie wartość ta wynosi -7,48; szacowany próg detekcji dla L-leucyny u tej ryby wynosi zatem 10-7,48 M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zależność dawka-odpowiedź dla L-glutaminy; sygnał nerwowy względem stężenia; sygnał zintegrowany, EC₅₀, analiza wykresu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60962/60962fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Typowa krzywa zależności odpowiedź-stężenie dla L-glutaminy zarejestrowana zewnątrzkomórkowo z nerwu węchowego in vivo. (A) Wraz ze wzrostem stężenia L-glutaminy aplikowanej do nabłonka węchowego (poziome paski) od 10-7 M do 10-3 M, obserwuje się towarzyszący wzrost aktywności nerwu. Górne ślady przedstawiają odpowiedzi zintegrowane, a dolne ślady przedstawiają surowy sygnał (nerwowy). (B) Wykres półlogarytmiczny znormalizowanych danych dopasowany do trójparametrowego równania Hilla (R2 = 0,99). W tym przykładzie obliczone EC50 = 3,11 µM, a współczynnik Hilla = 0,565). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60962/60962fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Recent studies have shown that ocean acidification affects olfactory-driven behavior in fish. This may be due in part to a reduction in olfactory ...

Jest to najbardziej niezawodna i czuła metoda oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich, ponieważ rejestruje sygnał czysto sensoryczny przed jakimkolwiek przetwarzaniem przez OUN. Głównymi zaletami tej techniki jest jej czułość i to, że można ją łatwo przenieść na inny gatunek z innego środowiska, niezależnie od zewnętrznego zasolenia. Aby przygotować wodę kontrolną, zbierz jeden litr wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym i użyj sondy pH, aby sprawdzić pH.pH powinno wynosić około 8,2. Jeśli tak nie jest, bąbelkuj wodę morską powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia pH 8,2. Następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody, a następnie zmierz temperaturę i zasolenie wody.Aby przygotować wodę o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, przefiltruj jeden litr wody morskiej przez filtry z węglem inaktywnym, a następnie bulgocząc dwutlenkiem węgla, aż do osiągnięcia pożądanego pH. Użyj sondy pH, aby sprawdzić pH, które powinno wynosić około 7,7, a następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody oraz zmierzyć temperaturę i zasolenie wody. Aby określić ciśnienie dwutlenku węgla zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, otwórz program przeznaczony do obliczania parametrów dwutlenku węgla w wodzie i dodaj zasolenie wody, temperaturę, ciśnienie, całkowitą zasadowość i wartości pH do okna wejściowego.Następnie wybierz stałe, skale i jednostki, a następnie kliknij przycisk proces, aby określić ciśnienie dwutlenku węgla. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez brak reakcji na uszczypnięcie ogona, umieść znieczuloną rybę na poduszce dostosowanej do modelu i umieść odpowiednią wielkości silikonową rurkę w pysku ryby. Rurka jest podłączona do pompy głębinowej i zbiornika środka znieczulającego zawierającego napowietrzoną wodę morską, a woda jest pompowana przez skrzela z szybkością około 100 mililitrów na minutę na kilogram.Następnie włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz pin do stopnia głowicy wzmacniacza. Przykryj rybę wilgotną szmatką tak, aby odsłonięta była tylko głowa i umieść rurkę z systemem dostarczania bodźców w nozdrzu. Aby odsłonić nerwy węchowe, użyj wiertła i mikroskopu preparacyjnego, aby usunąć skórę i kość czaszki między oczami.Używając dorady, użyj piły tarczowej, aby usunąć część czaszki bezpośrednio nad oczami do tyłu oczu i użyj wiertła, aby usunąć kość między oczami. Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości użyj cienkich kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy węchowe, nie uszkadzając nerwów ani naczyń. Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna trzywoltowego źródła prądu stałego i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej na 20 do 30 sekund.Z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych bąbelków. Podłącz elektrody wolframowe pokryte parylenem do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennegoamplifier prądu przemiennego. Po odsłonięciu nerwów węchowych użyj mikromanipulatorów, aby wprowadzić elektrody do odpowiedniego nerwu węchowego w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec i minimalną odpowiedź na ślepą próbę.Pod warunkiem, że sekcja przebiegła bezproblemowo, krytycznym krokiem jest ustawienie elektrod we właściwej pozycji. Może to zająć trochę czasu i wiąże się z pewnym stopniem prób i błędów. Aby uzyskać odczyty elektrofizjologiczne, użyj zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem, aby ustawić system dostarczania bodźca, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec i podłącz wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej.Umieść jedną linię w tle wody morskiej, a drugą w roztworze testowym. Podłącz sterownik zaworu do wyzwalacza analogowego przetwornika cyfrowego i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwolenia i trwało przez określony czas. Aby sprawdzić stabilność preparatu, należy wielokrotnie rejestrować i mierzyć amplitudę zintegrowanej odpowiedzi przy czym wzorzec pozostawia jedną minutę odstępu między kolejnymi bodźcami.Następnie zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła jedna minuta, a następnie zapisz odpowiedź na jeden razy 10 do ujemnej trzeciej molowej seryny w kontrolnym roztworze ślepej próby. Następnie zarejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości dwutlenku węgla. Odpowiedź na ślepą próbę roztworu wody o wysokiej zawartości dwutlenku węgla i odpowiedź na 1 razy 10 na ujemną trzecią molową serynę w kontrolnym roztworze ślepej próby wodnej.Przedstawiono tu typowe reakcje na bodźce kontroli pozytywnej i negatywnej rejestrowane z nerwu węchowego dorady. W ciągu około jednej sekundy od zastosowania bodźca można zaobserwować szybki wzrost aktywności, po którym następuje okres akomodacji, gdy bodziec jest nadal obecny, i powrót do podstawowej aktywności po zakończeniu bodźca. W przeciwieństwie do tego, pusty bodziec wywołuje niewielką lub żadną reakcję.W tej typowej krzywej stężenie-odpowiedź można zaobserwować, że rosnące stężenia nawaniacza mogą wywoływać coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym amplitudy zintegrowanych reakcji. Wykreślenie znormalizowanych danych i odpowiadającej im regresji liniowej pozwala na oszacowanie progu wykrywania dla reakcji stężeniowych każdego zwierzęcia lub grupy zwierząt. Krzywe odpowiedzi na stężenie sigmoidalne można wykreślić półlogarytmicznie, co pozwala na obliczenie stężenia nawaniacza, które wywołuje przy 50% maksymalnej odpowiedzi.Ważne jest, aby ryby były tak zdrowe, jak to tylko możliwe. Na przykład upewnij się, że skrzela są odpowiednio nawodnione, a nabłonek węchowy jest mokry podczas nagrywania. Jednym z naszych celów jest prześledzenie ścieżek neuronowych w mózgu do miejsca, w którym przekazywane są informacje sensoryczne.

extracellular-multi-unit-recording-from-olfactory-nerve

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Poznaj metodę zewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego z nerwu węchowego ryb morskich. Technika ta umożliwia precyzyjną ocenę wrażliwości węchowej niezależnie od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Przeglądaj więcej filmów