Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów
6 października 2020
Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.
Jest to najbardziej niezawodna i czuła metoda oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich, ponieważ rejestruje sygnał czysto sensoryczny przed jakimkolwiek przetwarzaniem przez OUN. Głównymi zaletami tej techniki jest jej czułość i to, że można ją łatwo przenieść na inny gatunek z innego środowiska, niezależnie od zewnętrznego zasolenia. Aby przygotować wodę kontrolną, zbierz jeden litr wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym i użyj sondy pH, aby sprawdzić pH.
pH powinno wynosić około 8,2. Jeśli tak nie jest, bąbelkuj wodę morską powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia pH 8,2. Następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody, a następnie zmierz temperaturę i zasolenie wody.
Aby przygotować wodę o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, przefiltruj jeden litr wody morskiej przez filtry z węglem inaktywnym, a następnie bulgocząc dwutlenkiem węgla, aż do osiągnięcia pożądanego pH. Użyj sondy pH, aby sprawdzić pH, które powinno wynosić około 7,7, a następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody oraz zmierzyć temperaturę i zasolenie wody. Aby określić ciśnienie dwutlenku węgla zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, otwórz program przeznaczony do obliczania parametrów dwutlenku węgla w wodzie i dodaj zasolenie wody, temperaturę, ciśnienie, całkowitą zasadowość i wartości pH do okna wejściowego.
Następnie wybierz stałe, skale i jednostki, a następnie kliknij przycisk proces, aby określić ciśnienie dwutlenku węgla. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez brak reakcji na uszczypnięcie ogona, umieść znieczuloną rybę na poduszce dostosowanej do modelu i umieść odpowiednią wielkości silikonową rurkę w pysku ryby. Rurka jest podłączona do pompy głębinowej i zbiornika środka znieczulającego zawierającego napowietrzoną wodę morską, a woda jest pompowana przez skrzela z szybkością około 100 mililitrów na minutę na kilogram.
Następnie włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz pin do stopnia głowicy wzmacniacza. Przykryj rybę wilgotną szmatką tak, aby odsłonięta była tylko głowa i umieść rurkę z systemem dostarczania bodźców w nozdrzu. Aby odsłonić nerwy węchowe, użyj wiertła i mikroskopu preparacyjnego, aby usunąć skórę i kość czaszki między oczami.
Używając dorady, użyj piły tarczowej, aby usunąć część czaszki bezpośrednio nad oczami do tyłu oczu i użyj wiertła, aby usunąć kość między oczami. Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości użyj cienkich kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy węchowe, nie uszkadzając nerwów ani naczyń. Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna trzywoltowego źródła prądu stałego i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej na 20 do 30 sekund.
Z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych bąbelków. Podłącz elektrody wolframowe pokryte parylenem do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennegoamplifier prądu przemiennego. Po odsłonięciu nerwów węchowych użyj mikromanipulatorów, aby wprowadzić elektrody do odpowiedniego nerwu węchowego w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec i minimalną odpowiedź na ślepą próbę.
Pod warunkiem, że sekcja przebiegła bezproblemowo, krytycznym krokiem jest ustawienie elektrod we właściwej pozycji. Może to zająć trochę czasu i wiąże się z pewnym stopniem prób i błędów. Aby uzyskać odczyty elektrofizjologiczne, użyj zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem, aby ustawić system dostarczania bodźca, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec i podłącz wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej.
Umieść jedną linię w tle wody morskiej, a drugą w roztworze testowym. Podłącz sterownik zaworu do wyzwalacza analogowego przetwornika cyfrowego i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwolenia i trwało przez określony czas. Aby sprawdzić stabilność preparatu, należy wielokrotnie rejestrować i mierzyć amplitudę zintegrowanej odpowiedzi przy czym wzorzec pozostawia jedną minutę odstępu między kolejnymi bodźcami.
Następnie zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła jedna minuta, a następnie zapisz odpowiedź na jeden razy 10 do ujemnej trzeciej molowej seryny w kontrolnym roztworze ślepej próby. Następnie zarejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości dwutlenku węgla. Odpowiedź na ślepą próbę roztworu wody o wysokiej zawartości dwutlenku węgla i odpowiedź na 1 razy 10 na ujemną trzecią molową serynę w kontrolnym roztworze ślepej próby wodnej.
Przedstawiono tu typowe reakcje na bodźce kontroli pozytywnej i negatywnej rejestrowane z nerwu węchowego dorady. W ciągu około jednej sekundy od zastosowania bodźca można zaobserwować szybki wzrost aktywności, po którym następuje okres akomodacji, gdy bodziec jest nadal obecny, i powrót do podstawowej aktywności po zakończeniu bodźca. W przeciwieństwie do tego, pusty bodziec wywołuje niewielką lub żadną reakcję.
W tej typowej krzywej stężenie-odpowiedź można zaobserwować, że rosnące stężenia nawaniacza mogą wywoływać coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym amplitudy zintegrowanych reakcji. Wykreślenie znormalizowanych danych i odpowiadającej im regresji liniowej pozwala na oszacowanie progu wykrywania dla reakcji stężeniowych każdego zwierzęcia lub grupy zwierząt. Krzywe odpowiedzi na stężenie sigmoidalne można wykreślić półlogarytmicznie, co pozwala na obliczenie stężenia nawaniacza, które wywołuje przy 50% maksymalnej odpowiedzi.
Ważne jest, aby ryby były tak zdrowe, jak to tylko możliwe. Na przykład upewnij się, że skrzela są odpowiednio nawodnione, a nabłonek węchowy jest mokry podczas nagrywania. Jednym z naszych celów jest prześledzenie ścieżek neuronowych w mózgu do miejsca, w którym przekazywane są informacje sensoryczne.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich poprzez pozakomórkowy rejestr wielkojednostkowy z nerwu węchowego. Technika ta pozwala na rejestrację pierwotnych sygnałów sensorycznych i jest niezależna od zewnętrznego zasolenia, co czyni ją wszechstronną w zastosowaniach dla różnych gatunków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia morska
- Elektrofizjologia
Wprowadzenie
- Czułość węchowa jest kluczowa dla zachowania i ekologii ryb.
- Tradycyjne metody mogą nie pozwalać na dokładną ocenę bodźców sensorycznych.
- Zrozumienie mechanizmów węchowych może dostarczyć cennych informacji dla badań ekologicznych i ewolucyjnych.
- Niniejsza metoda umożliwia precyzyjny pomiar reakcji sensorycznych.
Cel badania
- Opracowanie czułej metody pomiaru odpowiedzi węchowych u ryb morskich.
- Ocena wpływu czynników środowiskowych na wrażliwość węchową.
- Zapewnienie powtarzalnej techniki do przyszłych badań w dziedzinie biologii sensorycznej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wody morskiej kontrolnej oraz wody morskiej o wysokiej zawartości dwutlenku węgla.
- Wprowadzenie elektrod do odsłoniętych nerwów węchowych.
- Wykorzystanie systemu podawania bodźców do testów węchowych.
- Rejestracja i analiza odpowiedzi elektrofizjologicznych na substancje zapachowe.
Główne wyniki
- Wykazano szybkie reakcje węchowe ryb morskich na bodźce.
- Ustalono zależności między stężeniem a odpowiedzią dla substancji zapachowych.
- Zidentyfikowano różnice w reakcjach w zmiennych warunkach środowiskowych.
- Przedstawiono metodę szacowania progów detekcji substancji zapachowych.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w ocenie wrażliwości węchowej u ryb morskich.
- Może ona zostać dostosowana do różnych gatunków i środowisk.
- W przyszłych badaniach technikę tę można wykorzystać do analizy ścieżek neuronalnych w procesach przetwarzania węchowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pozakomórkowe rejestrowanie wielojednostkowe z nerwu węchowego zapewnia bezpośredni, ilościowy pomiar pierwotnego sygnału sensorycznego u ryb morskich, umożliwiając rzetelną ocenę czułości węchowej przed procesami przetwarzania w ośrodkowym układzie nerwowym. Metoda ta jest niezwykle istotna dla wczesnego etapu odkryć i walidacji celów w neuronauce sensorycznej, wspierając pewność predykcyjną w badaniach środowiskowych i mechanistycznych. Jej powtarzalność oraz niezależność od zewnętrznego zasolenia sprawiają, że stanowi ona wartościową platformę dla międzygatunkowych i międzywarunkowych procesów badawczo-rozwojowych (R&D).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji drogi sensorycznej przed integracją w OUN.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację odpowiedzi głównego nerwu węchowego.
- Ułatwia ilościowe wyznaczanie progu w celu walidacji celu.
- Zapewnia wiarygodne i powtarzalne dane dla badań opartych na hipotezach.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe wyniki dla testów czułości węchowej.
- Standaryzuje pomiar zależności między stężeniem a odpowiedzią w różnych warunkach.
- Umożliwia powtarzalne obliczanie progów detekcji w celu opracowywania testów.
- Wspiera skalowalność platformy dla różnych gatunków i zmiennych środowiskowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzespaja pomiary bodźców sensorycznych z modelami chorobowymi lub środowiskowymi.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej walidacji funkcji sensorycznych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez dostarczenie bezpośrednich, ilościowych punktów końcowych.
Integracja potoku i procesu roboczego
Metoda ta integruje procesy na styku wczesnego etapu odkrywania i walidacji modeli przedklinicznych, wspierając przepływy pracy od testowania hipotez po opracowywanie ilościowych analiz.
- Biologia odkrywcza: umożliwia bezpośredni pomiar aktywności nerwu węchowego w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych i biologicznej minimalizacji ryzyka.
- Przesiewy: pozwalają na przeprowadzanie zestandaryzowanych, powtarzalnych i ilościowych testów wrażliwości węchowej.
- Analityka: wspiera analizę statystyczną zależności stężenie-odpowiedź oraz progów detekcji w badaniach porównawczych.
- Badania translacyjne: łączą odkrycia mechanistyczne z modelami przedklinicznymi funkcji sensorycznych pod wpływem stresorów środowiskowych.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: oferują przenośną, solidną platformę do badań sensorycznych z udziałem wielu gatunków i w wielu różnych warunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach szlaków sensorycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne pomiary elektrofizjologiczne.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko na późnych etapach w portfelach celów sensorycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów funkcji sensorycznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii oraz chirurgicznego przygotowania organizmów modelowych.
- Wymagane jest specjalistyczne oprzyrządowanie do rejestracji wielojednostkowej i dostarczania bodźców.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji u różnych gatunków ryb kostnoszkieletowych oraz w różnych warunkach środowiskowych poprzez dostosowanie protokołu.
- Kluczowymi kwestiami praktycznymi są inwazyjność procedury oraz utrzymanie dobrostanu zwierząt.
