Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów
October 6th, 2020
Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.
Jest to najbardziej niezawodna i czuła metoda oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich, ponieważ rejestruje sygnał czysto sensoryczny przed jakimkolwiek przetwarzaniem przez OUN. Głównymi zaletami tej techniki jest jej czułość i to, że można ją łatwo przenieść na inny gatunek z innego środowiska, niezależnie od zewnętrznego zasolenia. Aby przygotować wodę kontrolną, zbierz jeden litr wody morskiej przefiltrowanej węglem drzewnym i użyj sondy pH, aby sprawdzić pH.
pH powinno wynosić około 8,2. Jeśli tak nie jest, bąbelkuj wodę morską powietrzem atmosferycznym, aż do osiągnięcia pH 8,2. Następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody, a następnie zmierz temperaturę i zasolenie wody.
Aby przygotować wodę o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, przefiltruj jeden litr wody morskiej przez filtry z węglem inaktywnym, a następnie bulgocząc dwutlenkiem węgla, aż do osiągnięcia pożądanego pH. Użyj sondy pH, aby sprawdzić pH, które powinno wynosić około 7,7, a następnie użyj titratora zasadowego, aby zmierzyć zasadowość wody oraz zmierzyć temperaturę i zasolenie wody. Aby określić ciśnienie dwutlenku węgla zarówno w wodzie kontrolnej, jak i o wysokiej zawartości dwutlenku węgla, otwórz program przeznaczony do obliczania parametrów dwutlenku węgla w wodzie i dodaj zasolenie wody, temperaturę, ciśnienie, całkowitą zasadowość i wartości pH do okna wejściowego.
Następnie wybierz stałe, skale i jednostki, a następnie kliknij przycisk proces, aby określić ciśnienie dwutlenku węgla. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez brak reakcji na uszczypnięcie ogona, umieść znieczuloną rybę na poduszce dostosowanej do modelu i umieść odpowiednią wielkości silikonową rurkę w pysku ryby. Rurka jest podłączona do pompy głębinowej i zbiornika środka znieczulającego zawierającego napowietrzoną wodę morską, a woda jest pompowana przez skrzela z szybkością około 100 mililitrów na minutę na kilogram.
Następnie włóż bolec uziemiający do mięśnia bocznego i podłącz pin do stopnia głowicy wzmacniacza. Przykryj rybę wilgotną szmatką tak, aby odsłonięta była tylko głowa i umieść rurkę z systemem dostarczania bodźców w nozdrzu. Aby odsłonić nerwy węchowe, użyj wiertła i mikroskopu preparacyjnego, aby usunąć skórę i kość czaszki między oczami.
Używając dorady, użyj piły tarczowej, aby usunąć część czaszki bezpośrednio nad oczami do tyłu oczu i użyj wiertła, aby usunąć kość między oczami. Po oczyszczeniu wystarczającej ilości kości użyj cienkich kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną pokrywającą nerwy węchowe, nie uszkadzając nerwów ani naczyń. Wyczyść elektrody przed użyciem, podłączając je do ujemnego bieguna trzywoltowego źródła prądu stałego i umieszczając końcówkę w soli fizjologicznej na 20 do 30 sekund.
Z końcówki powinien być widoczny stały strumień małych bąbelków. Podłącz elektrody wolframowe pokryte parylenem do stopnia głównego przedwzmacniacza prądu przemiennegoamplifier prądu przemiennego. Po odsłonięciu nerwów węchowych użyj mikromanipulatorów, aby wprowadzić elektrody do odpowiedniego nerwu węchowego w pozycji, która daje maksymalną odpowiedź na wzorzec i minimalną odpowiedź na ślepą próbę.
Pod warunkiem, że sekcja przebiegła bezproblemowo, krytycznym krokiem jest ustawienie elektrod we właściwej pozycji. Może to zająć trochę czasu i wiąże się z pewnym stopniem prób i błędów. Aby uzyskać odczyty elektrofizjologiczne, użyj zaworu trójdrogowego sterowanego elektromagnesem, aby ustawić system dostarczania bodźca, aby umożliwić szybkie przejście z czystej wody tła na wodę zawierającą bodziec i podłącz wspólny wylot do rurki doprowadzającej wodę do rozety węchowej.
Umieść jedną linię w tle wody morskiej, a drugą w roztworze testowym. Podłącz sterownik zaworu do wyzwalacza analogowego przetwornika cyfrowego i skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rozpoczynało nagrywanie w momencie wyzwolenia i trwało przez określony czas. Aby sprawdzić stabilność preparatu, należy wielokrotnie rejestrować i mierzyć amplitudę zintegrowanej odpowiedzi przy czym wzorzec pozostawia jedną minutę odstępu między kolejnymi bodźcami.
Następnie zapisz reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w kontrolnej wodzie morskiej i pozwól, aby między kolejnymi bodźcami upłynęła jedna minuta, a następnie zapisz odpowiedź na jeden razy 10 do ujemnej trzeciej molowej seryny w kontrolnym roztworze ślepej próby. Następnie zarejestruj reakcje nerwów węchowych na aminokwasy w wodzie morskiej o wysokiej zawartości dwutlenku węgla. Odpowiedź na ślepą próbę roztworu wody o wysokiej zawartości dwutlenku węgla i odpowiedź na 1 razy 10 na ujemną trzecią molową serynę w kontrolnym roztworze ślepej próby wodnej.
Przedstawiono tu typowe reakcje na bodźce kontroli pozytywnej i negatywnej rejestrowane z nerwu węchowego dorady. W ciągu około jednej sekundy od zastosowania bodźca można zaobserwować szybki wzrost aktywności, po którym następuje okres akomodacji, gdy bodziec jest nadal obecny, i powrót do podstawowej aktywności po zakończeniu bodźca. W przeciwieństwie do tego, pusty bodziec wywołuje niewielką lub żadną reakcję.
W tej typowej krzywej stężenie-odpowiedź można zaobserwować, że rosnące stężenia nawaniacza mogą wywoływać coraz większe wzrosty aktywności, a tym samym amplitudy zintegrowanych reakcji. Wykreślenie znormalizowanych danych i odpowiadającej im regresji liniowej pozwala na oszacowanie progu wykrywania dla reakcji stężeniowych każdego zwierzęcia lub grupy zwierząt. Krzywe odpowiedzi na stężenie sigmoidalne można wykreślić półlogarytmicznie, co pozwala na obliczenie stężenia nawaniacza, które wywołuje przy 50% maksymalnej odpowiedzi.
Ważne jest, aby ryby były tak zdrowe, jak to tylko możliwe. Na przykład upewnij się, że skrzela są odpowiednio nawodnione, a nabłonek węchowy jest mokry podczas nagrywania. Jednym z naszych celów jest prześledzenie ścieżek neuronowych w mózgu do miejsca, w którym przekazywane są informacje sensoryczne.
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje solidną metodę oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich za pomocą rejestracji wielokomórkowej zewnątrzkomórkowej nerwu węchowego. Technika ta rejestruje podstawowe dane wejściowe sensoryczne i jest niezależna od zewnętrznego zasolenia, co czyni ją wszechstronną w odniesieniu do różnych gatunków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia morska
- Elektrofizjologia
Wprowadzenie
- Wrażliwość węchowa jest kluczowa dla zachowania i ekologii ryb.
- Tradycyjne metody mogą nie dokładnie oceniać danych wejściowych sensorycznych.
- Zrozumienie mechanizmów węchowych może pomóc w badaniach ekologicznych i ewolucyjnych.
- Ta metoda pozwala na precyzyjny pomiar reakcji sensorycznych.
Cel badania
- Opracowanie czułej metody pomiaru reakcji węchowych u ryb morskich.
- Ocena wpływu czynników środowiskowych na wrażliwość węchową.
- Udzielenie dostępnej i odtwarzalnej techniki dla przyszłych badań w biologii sensorycznej.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie wody morskiej kontrolnej i o podwyższonym stężeniu dwutlenku węgla.
- Wprowadzenie elektrod do odsłoniętych nerwów węchowych.
- Wykorzystanie systemu dostarczania bodźców do testów węchowych.
- Rejestracja i analiza elektrofizjologicznych reakcji na zapachy.
Główne wyniki
- Wykazano szybkie reakcje węchowe u ryb morskich na bodźce.
- Ustanowiono zależności stężenia-reakcji dla zapachów.
- Zidentyfikowano różnice w reakcjach w zmieniających się warunkach środowiskowych.
- Dostarczono metodę szacowania progów wykrywalności zapachów.
Wnioski
- Metoda jest skuteczna w ocenie wrażliwości węchowej u ryb morskich.
- Można ją dostosować do różnych gatunków i środowisk.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do badania ścieżek neuralnych w przetwarzaniu węchowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Extracellular multi-unit recording from the olfactory nerve provides a direct, quantitative measure of primary sensory input in marine fish, enabling robust assessment of olfactory sensitivity before central processing. This method is highly relevant for early discovery and target validation in sensory neuroscience, supporting predictive confidence in environmental and mechanistic studies. Its reproducibility and independence from external salinity make it a valuable platform for cross-species and cross-condition R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of sensory pathway function prior to CNS integration.
- Supports mechanistic de-risking by isolating primary olfactory nerve responses.
- Facilitates quantitative threshold determination for target validation.
- Provides robust, reproducible data for hypothesis-driven research.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for olfactory sensitivity assays.
- Standardizes measurement of concentration-response relationships across conditions.
- Enables reproducible detection threshold calculations for assay development.
- Supports platform scalability across species and environmental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sensory input measurements with disease-relevant or environmental models.
- Ensures continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of sensory function.
- Reduces translational risk by providing direct, quantitative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model validation, supporting workflows from hypothesis testing to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Provides direct measurement of olfactory nerve activity for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Enables standardized, reproducible, and quantitative olfactory sensitivity assays.
- Analytics: Supports statistical analysis of concentration-response and detection thresholds for comparative studies.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models of sensory function under environmental stressors.
- Enterprise Reuse: Offers a transferable, robust platform for multi-species and multi-condition sensory research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sensory pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable electrophysiological measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage risk in sensory target portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of sensory function programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and surgical preparation of model organisms.
- Needs specialized instrumentation for multi-unit recording and stimulus delivery.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptable across teleost species and environmental conditions with protocol adjustments.
- Invasiveness and animal health maintenance are critical practical considerations.
