Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Korzystając z tego protokołu, każde laboratorium, które posiada standardowy mikroskop konfokalny wyposażony w laser o długości 405 nanometrów, może wykonywać ablacje laserowe progenitorów komórek rzęsatych i monitorować ich regenerację. W przeciwieństwie do elektroablacji, technika ta ogranicza uszkodzenia otaczających komórek i jest bardziej dostępna niż potężny impulsowy laser UV. Obrazowanie konfokalne można również wykonać bezpośrednio przed i po ablacji.

Technika ta pozwala nam lepiej zrozumieć zachowania regeneracyjne sensorycznych komórek progenitorowych, co może pomóc w opracowaniu terapii ubytku słuchu u ludzi. Do montażu, najpierw pipetuj trzy do czterech znieczulonych larw do małej kropelki roztworu tricainy E3 do środka 35-milimetrowej szalki, z 14-milimetrowym dnem szkiełka nakrywkowego o numerze 1,5. Usuń nadmiar roztworu, aby larwy pozostały w małej kropelce, wystarczająco dużej, aby je pomieścić.

I umieść czaszę na stoliku lornetkowego mikroskopu stereoskopowego. Manipuluj powiększeniem i ostrością tak, aby wszystkie larwy znalazły się w polu widzenia i użyj pipety transferowej, aby nałożyć cienką warstwę agroroztworu na szkiełko nakrywkowe. Usuń nadmiar agros, aż płyn wypełni studzienkę na dnie naczynia, uważając, aby nie zassać żadnych larw.

I użyj noża do włosów, aby szybko zorientować larwy w agroroztworze ze stroną rostralną skierowaną w lewo. Delikatnie dociśnij larwy do szkła, tak aby larwy leżały z profilu prawymi bokami skierowanymi w dół. Po około 60 sekundach agros zacznie krzepnąć, a larwy nie będą mogły zostać ponownie zorientowane.

Po pięciu minutach użyj pipety transferowej, aby napełnić naczynie do połowy E3 uzupełnionym 1X tricainą. Aby zlokalizować potencjalne cele, włącz zasilanie systemu skaningowej mikroskopii konfokalnej i zainicjuj laser za pomocą zintegrowanego oprogramowania do obrazowania. Wybierz obiektyw immersyjny 63X Plan-Apochromat z olejkiem i nałóż olejek immersyjny na soczewkę.

Zabezpiecz naczynie w okrągłej wkładce scenicznej tak, aby rostralny aspekt larw był skierowany w lewo. Korzystając z jasnego pola lub kontrastowego oświetlenia interferencyjnego, wybierz jedną z zamontowanych larw do obrazowania i użyj pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość skóry po stronie ryby znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego. Przełącz się na oświetlenie epifluorescencyjne w kanale GFP i zlokalizuj tylną linię boczną za pomocą ekspresji GFP wzdłuż poziomej przegrody mięśniowej.

Pierścienie komórek fluorescencyjnych wskazują na komórki płaszcza nerwianka, a wydłużone pasma komórek to komórki międzynerwowe. Począwszy od pierwszego migrującego neuromasztu zawiązkowego, użyj joysticka sterowania stopniem, aby wizualnie skanować doogonowo wzdłuż poziomej przegrody mięśniowej. Podążając za ciągiem komórek międzynerwowych, aż do osiągnięcia obszaru między trzecim a czwartym migrującym neuromastem zawiązkowym.

Jeśli ma zostać zobrazowanych kilka larw, wybierz pozycję, aby ustawić pozycję pierwszego stopnia. Po zidentyfikowaniu ciał komórkowych w regionie L3, L4 należy przejść w tryb akwizycji i użyć odpowiedniego lasera, aby aktywować ścieżkę obrazowania GFP. Aby dodać kanał światła przechodzącego do aktywowanej ścieżki laserowej, kliknij pole T-PMT w menu rozwijanym ustawień obrazowania.

Aby zobrazować larwy ET20, wybierz laser 488 nanometrów, ustaw moc lasera na 6%, rozmiar otworka na odpowiednik jednej jednostki powierzchni, a wzmocnienie cyfrowe na 750. Dostosuj wzmocnienia tak, aby ciała komórek były nasycone, aby uchwycić w przeciwnym razie słabe projekcje i filopodia. I ustaw rozmiar klatki na 1 024 na 1 024 pikseli, uśrednienie na dwa, a zoom cyfrowy na 0,7.

Zaznacz pole stosu Z, aby wyświetlić menu rozwijane Pozycja Z. Podczas szybkiego skanowania skup się, aż komórki międzynerwowe będą po prostu nieostre i ustaw pierwszy plasterek. Skoncentruj się na próbce, aż komórki międzynerwowe ponownie ulegną ostrości i ustaw ostatni plasterek.

Następnie kliknij stop i kliknij rozpocznij eksperyment, aby przechwycić stos Z przed ablacją. Jeśli pozycje stołu montażowego zostały dodane, wyłącz opcję pozycji, aby obraz wyświetlała tylko bieżąca pozycja i zapisz plik po jego przechwyceniu. W przypadku ablacji laserowej docelowych ciał komórek kliknij opcję pokaż wszystkie narzędzia w interfejsie akwizycji, a następnie w menu ustawień obrazowania wybierz opcję dodaj nową ścieżkę.

Kliknij barwnik i wybierz DAPI. W obszarze kanały wybierz 405 jako ustawienie lasera i zwiększ moc lasera do 75%Odznacz kanał DAPI, aby wyłączyć laser podczas skanowania w poszukiwaniu ciał komórek kandydujących do ablacji. Kliknij na żywo i z ciałem komórki międzynerwowej wyśrodkowanym w polu widzenia, powiększ ramkę skanowania do 20 do 22x.

Zatrzymaj skanowanie na żywo, gdy tylko ciało komórki wypełni pole widzenia. Sprawdź pole migawki laserowej 405 nm, aby aktywować ścieżkę i ustawić timer na 45 sekund. Następnie aktywuj ciągłe skanowanie i uruchom timer.

Natychmiastowe zatrzymanie skanowania po 45 sekundach. Aby zobrazować ciała komórkowe po ablacji, w menu kanałów odznacz ścieżkę DAPI, aby dezaktywować laser ablacyjny i otworzyć menu trybu akwizycji. Kliknij przycisk powiększenia i zmniejsz powiększenie do 0,7.

Aby ocenić powodzenie ablacji komórek, należy szybko zeskanować pole widzenia. Korzystając z tych samych ustawień, co w przypadku obrazowania przed ablacją, uchwyć i zapisz obraz po ablacji. Sprawdź obraz kanału fotopowielacza światła przechodzącego, aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenie komórki.

Uszkodzone komórki będą miały ziarnisty wygląd, a jądra często pęcznieją lub będą miały nieregularny kształt. Aby ocenić regenerację ciała komórki po ablacji, aktywuj zarówno pozycję stolika, jak i opcje czasu przechwytywania obrazu poklatkowego i ustaw parametry czasu na odpowiedni eksperymentalny punkt czasowy i 15-minutowe odstępy. Następnie rozpocznij eksperyment, aby uzyskać obrazy i zapisać wynikowy plik po zakończeniu.

W tym reprezentatywnym eksperymencie zidentyfikowano obszar linii bocznej znajdujący się między trzecim a czwartym migrującym neuromasztem zawiązkowym i wykonano obrazy sprzed ablacji. Skanowanie po ablacji potwierdziło, że w obszarze po ablacji nie pozostały żadne ciała komórkowe. Pozostawiając przerwę między wydłużonymi wypustkami sąsiednich komórek międzynerwowych.

Analiza kanału lampy fotopowielacza światła przechodzącego po ablacji ujawnia uszkodzone i umierające komórki. Charakteryzuje się spuchniętymi i nieregularnie ukształtowanymi jądrami oraz ziarnistym wyglądem. Można również zaobserwować rekrutację dużych komórek ameboidalnych, które prawdopodobnie są makrofagami.

W tym eksperymencie ablacja kilku komórek w podwójnie transgenicznych larwach stworzyła znaczne luki w sznurku komórek międzynerwowych, ale miała niewielki lub żaden wpływ na nerw linii bocznej. Po ablacji laserowej można zmierzyć rozmiary szczelin. Waha się od kilku mikronów do 100 mikronów, w zależności od szerokości poszczególnych komórek tucznych i liczby komórek wybranych do ablacji.

Po ablacji niektóre komórki międzynerwowe odzyskują sprawność w ciągu pierwszych kilku godzin od obrazowania. Przy czym prawdopodobieństwo zamknięcia szczeliny jest ujemnie skorelowane z wielkością szczeliny. Jednak nawet w komórkach międzynerwowych, które nie są w stanie się zregenerować, można zaobserwować tworzenie długich wypustek z sąsiednich komórek międzynerwowych, które mogą przypominać rozciągające się stożki wzrostu neuronów.

Ważne jest, aby dokładnie sprawdzić kanał T-PMT pod kątem uszkodzonych komórek wykazujących jądra o nieregularnym kształcie i ziarnistości, a także dać wystarczająco dużo czasu, aby te wskaźniki śmierci komórki stały się widoczne. Dalsza analiza uzyskanych danych z mikroskopii poklatkowej może potencjalnie ujawnić nowe zachowania komórkowe wywołane ablacją laserową i może pokierować rozwojem eksperymentów mających na celu identyfikację regulatorów regeneracji. Technika ta umożliwiła nam zbadanie molekularnych regulatorów regeneracji komórek międzynerwowych, zapewniając szybką i opłacalną metodę selektywnego uszkadzania tych komórek.