Name: Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół etykietowania TMT do analizy proteomicznej próbek tkanki mięśniowej myszy. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność etykietowania, powtarzalność i niezawodną akwizycję danych w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi proteomiki UF-ICBR za przetwarzanie naszych próbek. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health R01 HL136759-01A1 (CAP).

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania z Uniwersytetu Florydy zatwierdził wszystkie badania na zwierzętach.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do lizy CHAPS (150 mM KCl, 50 mM HEPES pH = 7,4, 0,1% CHAPS i 1 tabletka koktajlowa inhibitora proteazy na 50 ml buforu). Bufor bez inhibitorów proteazy może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy lub bufor z inhibitorem proteazy przechowywany w temperaturze -20 °C do 1 roku.</li>
	<li>Przygotuj 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB): Dodaj 500 μl 1 M TEAB do 4,5 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Przygotować 200 mM chlorowodorku fosfiny tris (2-karboksyetylo) fosfiny (TCEP): Dodać 70 μl 0,5 M TCEP, odczynnika denaturującego, do 70 μl ultraczystej wody. Następnie dodać 35 μl 1 M TEAB.</li>
	<li>Przygotuj 5% hydroksyloaminy: Dodaj 50 μl 50% hydroksyloaminy do 450 μl 100 mM TEAB.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Odizoluj mięsień czworogłowy uda od myszy poddanej eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Zamrażać i utrzymywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować zgodnie z protokołem do natychmiastowego użycia.</li>
	<li>Pokrój, aby wyizolować około 10 mg świeżej lub mrożonej tkanki mięśnia czworogłowego uda. Oddziel włókna za pomocą pęsety podczas pracy z mięśniami szkieletowymi. Alternatywnie, jeśli pracujesz z kulturami komórkowymi, ponownie zawieś ~3 x 106 komórek w 300 μl buforu do lizy CHAPS i przejdź do kroku 2.4.</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą rozdzielacza kulek przy użyciu probówek o pojemności 2 ml wypełnionych około 200 μl kulek cyrkonu/krzemionki o średnicy 1 mm i 500 μl buforu do lizy CHAPS. Odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć skalę (np. 5 mg tkanki w 250 μl buforu do lizy CHAPS).</li>
	<li>Wykonaj sonikację (10x po 10 s z 50% amplitudą i 30-sekundowymi odstępami na lodzie), aby uwolnić białko związane z DNA. Te same wyniki degradacji DNA można osiągnąć albo za pomocą lizy strzykawki, przepuszczając lizat 10x przez igłę 21 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml, albo przez inkubację benzonazy (44 U/ml) w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej.</li>
</ol>
3. Pomiar białka
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w supernatantze przy użyciu ustalonych protokołów (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Najlepiej jest używać próbek o stężeniu ≥2 μg/μl, ale można również stosować próbki o mniejszym stężeniu. Jeżeli stosuje się próbkę o mniejszym stężeniu, konieczne będzie odpowiednie dostosowanie objętości odczynników redukujących/alkilujących w kroku 5.1.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie krzywej wzorcowej BSA przy użyciu buforu do lizy CHAPS.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, a po 15 minutach odczytaj absorbancję przy 750 nm.</li>
</ol>
4. Redukcja/alkilowanie odczynników
<ol>
	<li>Przenieś 200 μg białka na warunek do nowej probówki wirówkowej i dostosuj do końcowej objętości 100 μl za pomocą buforu do lizy CHAPS. Możliwe jest skalowanie do 200 μL, gdy stężenie białka jest zbyt niskie, ale nie należy zapominać o odpowiednim dostosowaniu objętości odczynnika redukującego/alkilującego .</li>
	<li>Dodać 5 μl 200 mM TCEP i inkubować próbki w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 375 mM jodoacetamidu, rozpuszczając jedną probówkę jodoacetamidu (tj. 9 mg) w 132 μl 100 mM TEAB. Chroń to rozwiązanie przed światłem.</li>
	<li>Dodać 5 μl 375 mM jodoacetamidu do próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
5. Strącanie metanolu/chloroformu20
<ol>
	<li>Dodać 400 μl metanolu do każdych 100 μl białka i krótko zawirować próbki.</li>
	<li>Wirować przy 9 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej. Ma to na celu włączenie płynów osadzonych po bokach probówki z próbką.</li>
	<li>Do mieszaniny dodać 100 μl chloroformu i krótko wirować. Użyj 200 μl chloroformu, jeśli próbka ma wysokie stężenie fosfolipidów.</li>
	<li>Wirować przy 9 000 x g przez 10 s w temperaturze pokojowej. Ma to na celu włączenie płynów osadzonych po bokach probówki z próbką.</li>
	<li>Dodać 300 μl wody i energicznie mieszać. Ważne jest, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
	<li>Wirować przy 9 000 x g przez 1 minutę przy wilgotności względnej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć warstw podczas przenoszenia probówki do stojaka. 
	UWAGA: Probówka powinna teraz zawierać trzy fazy: 1) Górna warstwa (tj. supernatant), mieszanina wody i metanolu; 2) Warstwa środkowa (tj. interfaza), białe wytrącone białko; oraz 3) Dolna warstwa (tj. faza dolna), chloroform.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 300 μl metanolu do pozostałej fazy międzyfazowej i dolnej. Wiruj energicznie.</li>
	<li>Wirować przy 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naruszyć warstw podczas przenoszenia probówki do stojaka.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zassać jak najwięcej płynu pod strumieniem powietrza (np. za pomocą koncentratora próżniowego) przy temperaturze pokojowej, aż granulat będzie lekko wilgotny (~10 min). Ponieważ niezbędny czas może być różny dla każdej próbki, należy sprawdzać ją co 2 minuty w celu oceny. Przechowywać granulat w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
6. Trawienie białek
<ol>
	<li>Zawiesić wytrącony osad białkowy w 100 μl buforu do lizy TEAB. 
	UWAGA: Pomiar stężenia białka na tym etapie jest opcjonalny.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 1 μg/μl trypsyny, dodając 100 μl roztworu do przechowywania trypsyny (50 mM kwasu octowego) na dno fiolki ze szklaną trypsyną 100 μg i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Pozostały odczynnik należy przechowywać w dawkach jednorazowego użytku w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl trypsyny na 100 μg białka. Próbkę trawić przez noc w temperaturze 37 °C. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla całkowitego rozpuszczenia białka; Nie modyfikuj tych warunków. Po trawieniu opcjonalnie można zmierzyć stężenie białka za pomocą standardowych testów białkowych.</li>
</ol>
7. Etykietowanie peptydów
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy zrównoważyć odczynniki z zestawu etykiet TMT do RT.</li>
	<li>Rozpuścić każdą z fiolek ze znacznikiem 0,8 mg TMT przez dodanie 41 μl bezwodnego acetonitrylu do każdej probówki. Inkubować odczynnik przez 5 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym wirowaniem. Krótko odwirować probówki. 
	UWAGA: Stężenie 0,8 mg znacznika TMT zwykle wystarcza do oznaczenia dwóch zestawów. Inni badacze wykazali jednak, że stężenie to można jeszcze bardziej zmniejszyć i nadal dostarczać wiarygodnych danych15.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 41 μl odczynnika do etykiety TMT do każdej próbki o objętości 100 μl.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 8 μl 5% hydroksyloaminy do próbki i inkubować przez 15 minut w celu wygaszenia reakcji.</li>
	<li>Podzielić próbki na równe ilości w nowej probówce wirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie próbki są stabilne i mogą być przekazane do spektroskopii mas. Pomiar stężenia w tym momencie jest opcjonalny przy użyciu standardowych testów białkowych.</li>
</ol>
8. Spektroskopia mas
<ol>
	<li>Prześlij próbki do ośrodka proteomicznego (w tym badaniu wykorzystano obiekt UF ICBR Proteomics Core), gdzie wszystkie próbki są łączone i oczyszczane za pomocą kolumn wirowych C18. 
	UWAGA: Przedyskutuj z główną placówką, w jaki sposób przesłać próbki przed ich przygotowaniem, aby potwierdzić dokładne kroki, które preferują przy składaniu próbek.</li>
	<li>Poproś o następujące procedury dla połączonej próbki multipleksowej: ekstrakcja do fazy stałej, HPLC (SCX, SE), końcówka zip i LC-MS/MS (2-godzinny gradient dla identyfikacji białka, jeśli >10QE Plus).</li>
	<li>Po zebraniu danych główny zakład będzie przetwarzał pliki RAW za pomocą dostarczonego przez dostawcę oprogramowania do identyfikacji białek.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Dane są zazwyczaj dostarczane z rdzenia z powrotem do użytkownika w formacie 7z, który może wymagać około 16 GB miejsca na dysku na każdy zestaw danych (w tym przypadku 11 próbek). Do przetwarzania danych upewnij się, że dostępny jest komputer o częstotliwości co najmniej 3,4 GHz.</li>
	<li>Wyodrębnij pliki za pomocą Menedżera plików 7-Zip. Te wyodrębnione pliki zawierają dane RAW, plik w formacie pdStudy i plik w formacie pdResultView. Zapisz wszystkie pliki do dalszych analiz.</li>
	<li>Otwórz plik za pomocą oprogramowania Proteome Discovery 2.2. 
	UWAGA: Format pliku to "Nazwa pliku.pdStudy". Jeśli otwarty jest plik "Nazwa pliku.pdResultView", nie jest możliwe wybranie próbki kontrolnej.</li>
	<li>Wybierz próbki kontrolne w panelu "Próbki".</li>
	<li>Otwórz Wynik, wybierając ID w panelu "Wyniki analizy".</li>
	<li>Eksport do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Zapisz surowe dane (wszystkie zidentyfikowane białka).</li>
	<li>Otwórz plik z oprogramowaniem arkusza kalkulacyjnego. Będzie on zawierał wszystkie zidentyfikowane białka.</li>
	<li>W pliku oprogramowania arkusza kalkulacyjnego użyj funkcji "Filtr", aby przefiltrować "Pewność białka FDR: Łączona" na wysoką (kolumna B), "#Unique peptydy" wyższą niż 2 (kolumna K) i jedną z "Współczynnika obfitości" wyłącznie pustą (kolumna S do W).</li>
	<li>Wstaw kolumnę do obliczenia "wartości p" za pomocą funkcji 
	=TEST.Test(grupa kontrolna;grupa eksperymentalna;ogony;typ)</li>
	<li>Wstaw kolumnę "Istotność statystyczna" z funkcją 
	=JEŻELI(wartość-p<0,05;"Istotność";"NS")</li>
	<li>Użyj funkcji "Filtruj", aby wyświetlić "Istotność statystyczna" pokazującą "Istotność". Uzyskany wynik przedstawia analizowane białka o istotności statystycznej w grupie kontrolnej i grupie eksperymentalnej.</li>
	<li>Określ znacznie wyższą lub niższą obfitość ekspresji białka w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą kontrolną, wstaw kolumnę "Regulacja" z funkcją 
	=JEŻELI(ŚREDNIA(grupa kontrolna)>ŚREDNIA(grupa eksperymentalna);"Regulacja w górę";"Obniżona")</li>
</ol>
10. Metody oceny znaczących trafień
<ol>
	<li>Aby zidentyfikować interakcje białko-białko między istotnymi trafieniami zidentyfikowanymi w badaniach TMT, użyj narzędzia Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) wersja 11.021: <a href="https://string-db.org/" target="_blank">https://string-db.org/</a></li>
	<li>Aby sklasyfikować według grup (tj. funkcji molekularnych, procesów biologicznych i klas białek), użyj oprogramowania do klasyfikacji ontologii Analizy Białek za pomocą Relacji Ewolucyjnych (PANTHER)22: <a href="http://www.pantherdb.org/" target="_blank">http://www.pantherdb.org/</a></li>
	<li>Aby zidentyfikować interakcje białek w różnych szlakach, użyj oprogramowania do analizy ścieżek23.</li>
</ol>
11. Przesyłanie danych proteomicznych do banku repozytorium
<ol>
	<li>Aby przesłać dane proteomiczne do bazy danych Proteomics IDEntificantions Database (PRIDE) lub interaktywnego środowiska wirtualnego spektrometrii mas (MassIVE), należy dołączyć następujące informacje: pliki z listą pików (przetworzone pliki widma masowego w standardowym formacie, takim jak mzXML, mzML lub MGF), pliki wyników (identyfikacje widma w standardowym formacie, takim jak mzIdentML lub mzTab) oraz surowe pliki widma (surowe pliki widma masowego w formacie niestandardowym lub specyficznym dla instrumentu, takim jak . Pliki RAW lub . WIFF).</li>
	<li>Aby przesłać zgłoszenie, utwórz konto i dołącz informacje, takie jak przynależność i szczegóły projektu. Następnie wybierz pliki wymienione w kroku 11.1 i prześlij je.</li>
	<li>Aby utworzyć oficjalny zestaw danych, uruchom przepływ pracy przesyłania dla tych przesłanych plików. 
	UWAGA: Po przesłaniu zestaw danych będzie prywatny w banku repozytorium. W przypadku opcji prywatnej dane są dostępne tylko dla uprawnionych użytkowników. Istnieją dwie dodatkowe opcje: 1) Współdzielony zestaw danych, który daje dostęp do recenzentów czasopisma i współpracowników; lub 2) Publiczny zbiór danych, który pojawi się w wyszukiwaniach w publicznych zbiorach danych. Kolejną ważną cechą tych repozytoriów jest możliwość aktualizacji wgranych danych i powiązania kolejnych publikacji z istniejącym zbiorem danych.</li>
</ol>

<ol><li>Graves, P. R., Haystead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biologist%27s+guide+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular biologist's guide to proteomics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).</li>
<li>Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Relative+Quantitation+of+Proteins+Using+Tandem+Mass+Tags+%28TMT%29+and+Mass+Spectrometry+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS).</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).</li>
<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Rabilloud, T., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial.</a> Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Anderson, N. G., Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+of+two-dimensional+electrophoresis%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future.</a> Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).</li>
<li>Haynes, P. A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+profiling-pitfalls+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Proteome profiling-pitfalls and progress.</a> Yeast. 17 (2), 81-87 (2000).</li>
<li>Bunai, K., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+limitation+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+in+bacterial+membrane+protein+proteomics+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).</li>
<li>Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILAC+fly+allows+for+accurate+protein+quantification+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).</li>
<li>Zhang, G., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29+for+phosphotyrosine+protein+identification+and+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation.</a> Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC-based+quantitative+MS+approach+for+real-time+recording+protein-mediated+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8441(2018).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tags%3A+A+Novel+Quantification+Strategy+for+Comparative+Analysis+of+Complex+Protein+Mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li>
<li>Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Labeling+Using+Isobaric+Tagging+Reagents+for+Quantitative+Phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).</li>
<li>Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+Tandem+Mass+Tag+%28SL-TMT%29+Protocol%3A+An+Efficient+Strategy+for+Quantitative+%28Phospho%29proteome+Profiling+Using+Tandem+Mass+Tag-Synchronous+Precursor+Selection-MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3.</a> Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+Labeling+for+the+Masses%3A+A+Robust+and+Cost-efficient%2C+In-solution+Labeling+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+Design+of+New+Isobaric+Labeling+Reagents+for+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics.</a> Molecules. 24 (4), E701(2019).</li>
<li>Suzuki-Hatano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9-TAZ+Gene+Replacement+Ameliorates+Cardiac+TMT+Proteomic+Profiles+in+a+Mouse+Model+of+Barth+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).</li>
<li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1954(2010).</li>
<li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass-spectrometry-based+Proteomics+Analysis+of+Ocular+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59140(2019).</li>
<li>Wessel, D., Flügge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).</li>
<li>Jensen, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING+8--a+global+view+on+proteins+and+their+functional+interactions+in+630+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms.</a> Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).</li>
<li>Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Pathway-Based+Analysis+Tools+That+Visualize+Genetic+Variants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants.</a> Frontiers in Genetics. 8, 174(2017).</li>
<li>Plaxton, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+Proteolysis+during+the+Extraction+and+Purification+of+Active+Plant+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes.</a> Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).</li>
<li>Ryan, B. J., Henehan, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyan%2C+BJ+%22Protein+Chromatography%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Chromatography: Methods and Protocols</a>. Walls, D., Loughran, S. T. , Springer. New York. 53-69 (2017).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby skutecznie przygotować próbki do analizy proteomicznej przy użyciu metodologii znakowania izobarycznych stabilnych izotopów opartych na TMT, kluczowe znaczenie ma bardzo ostrożne przeprowadzanie ekstrakcji białek w temperaturze 4 °C i stosowanie buforu do lizy, który zawiera koktajl inhibitorów proteazy 24,25. Koktajl inhibitorów proteazy jest kluczowym odczynnikiem pozwalającym uniknąć nieoczekiwanej degradacji białka podczas trawienia białka. Jedną z kluczowych różnic między naszym protokołem a obecnym protokołem dostarczonym przez dostawcę jest to, że zdecydowanie zalecamy stosowanie buforu do lizy CHAPS w oparciu o nasze doświadczenie z komórkami i tkankami ssaków. Sugerujemy również stosowanie podejścia do wytrącania białek metanolu/chloroformu zarówno w przypadku granulek komórkowych, jak i tkanek.
Idealnie byłoby, gdyby ekstrakcja białka, pomiar, odczynniki redukcyjne/alkilujące oraz wytrącanie metanolu/chloroformu były wykonywane tego samego dnia. Stosowanie się do tego zalecenia zaowocuje dokładniejszymi stężeniami białka do późniejszego znakowania. Etap wytrącania białek jest ważny dla usunięcia odczynników, które będą zakłócać tandemową spektrometrię mas. Uwzględnienie etapu opadów znacznie zwiększa rozdzielczość TMT26. Podsumowując, głównymi zaletami naszego protokołu TMT są wysoka skuteczność etykietowania dla różnych typów próbek, jego odtwarzalność i wiarygodne uzyskane dane.
Wraz z rozwojem multipleksowego charakteru tej strategii proteomicznej TMT, która będzie stopniowo zwiększać zdolność badaczy z wielu różnych dziedzin do dokonywania nowych odkryć. Szczególnie w dziedzinie biomedycyny, my i inni stwierdziliśmy, że ta technologia jest coraz bardziej pouczająca w badaniach badających nowe mechanizmy działania w chorobie i względne skutki różnych terapii. Z tych wszystkich powodów ta potężna technologia uzupełnia repertuar innych podejść OMICZNYCH stosowanych w nowoczesnych badaniach naukowych i dostarcza kluczowych informacji, które mogą ukierunkować dalszy rozwój terapii.

Termin "proteomika" został po raz pierwszy zdefiniowany jako wielkoskalowa charakterystyka całego dopełniacza białkowego komórki, tkanki lub organizmu1. Analizy proteomiczne umożliwiają badanie mechanizmów i procesów komórkowych zaangażowanych w rozwój choroby, szlaków terapeutycznych i zdrowych systemów przy użyciu technik przeprowadzania względnej kwantyfikacji poziomów ekspresji białek2. Wstępne opisy takich badań zostały opublikowane w 1975 roku i wykazały zastosowanie w tym celu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (2D-PAGE)1,3. Metoda 2D rozdziela białka na podstawie ładunku (ogniskowanie izoelektryczne, IEF) i masy cząsteczkowej (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu lub SDS-PAGE)4. Przez lata połączenie 2D-PAGE i późniejszej tandemowej spektrometrii mas wykonywanej na każdym składniku żelu było najpowszechniejszą techniką przeprowadzanej analizy ekspresji białek bez ukierunkowanej metody i identyfikowało wiele nieznanych wcześniej profili ekspresji białek5,6. Ogólne wady podejścia 2D-PAGE polegają na tym, że jest ono czasochłonne, nie działa dobrze w przypadku białek hydrofobowych oraz że istnieje ograniczenie w całkowitej liczbie ocenianych białek ze względu na niską czułość7,8.
Metoda znakowania stabilnych izotopów za pomocą metody SILAC (aminokwasy w hodowli komórkowej) stała się kolejnym popularnym podejściem do identyfikacji i ilościowego określania obfitości białek w próbkach9. Polega na znakowaniu metabolicznym komórek, które są inkubowane w pożywce pozbawionej standardowego aminokwasu egzogennego i uzupełnione znakowaną izotopowo wersją tego konkretnego aminokwasu10. Zaletą tej techniki jest jej skuteczność i precyzyjne etykietowanie9. Głównym ograniczeniem podejścia SILAC jest przede wszystkim zmniejszone tempo wzrostu komórek spowodowane włączeniem znacznika izotopowego, co może być szczególnie trudne w przypadku stosunkowo wrażliwych linii komórkowych modelujących choroby ludzkie11.
W 2003 roku wprowadzono nowatorską i solidną technikę proteomiczną wykorzystującą tandemowe znaczniki masy (TMT) izobaryczne etykiety12. Znakowanie TMT jest potężną metodą ze względu na zwiększoną czułość wykrywania względnych poziomów ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych13. Od tej daty publikacji opracowano zestawy TMT, które mogą jednocześnie oznaczać 6, 10, 11 lub 16 próbek. W rezultacie, możliwe jest mierzenie obfitości peptydów w wielu warunkach z replikami biologicznymi w tym samym czasie14,15,16. Niedawno użyliśmy TMT do scharakteryzowania profilu proteomicznego serca mysiego modelu zespołu Bartha (BTHS)17. W ten sposób byliśmy w stanie wykazać powszechną poprawę profili sercowych myszy z BTHS leczonych terapią genową i zidentyfikować nowe białka, na które wpływa BTHS, które ujawniły nowe szlaki terapeutyczne zaangażowane w kardiomiopatie.
Tutaj opisujemy szczegółową metodę przeprowadzania multipleksowych ilościowych analiz proteomicznych TMT przy użyciu próbek tkanek lub granulek komórkowych. Korzystne może być przygotowanie i etykietowanie próbki przed przesłaniem do rdzenia, ponieważ znakowane peptydy tryptyczne są bardziej stabilne niż surowe zamrożone próbki, nie wszystkie rdzenie mają doświadczenie w obsłudze wszystkich rodzajów próbek, a przygotowanie próbek w laboratorium może zaoszczędzić czas na rdzenie, które często mają długie zaległości. Szczegółowe opisy części tego procesu przeznaczonej dla spektroskopii mas można znaleźć w Kirshenbaum et al. i Perumal et al.18,19.
Protokół przygotowania próbki składa się z następujących głównych etapów: ekstrakcja, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie i etykietowanie. Głównymi zaletami tego zoptymalizowanego protokołu jest to, że zmniejsza on koszty etykietowania, poprawia ekstrakcję białek i konsekwentnie generuje dane wysokiej jakości. Ponadto opisujemy, jak analizować dane TMT w celu przesiewania tysięcy białek w krótkim czasie. Mamy nadzieję, że ten protokół zachęci inne grupy badawcze do rozważenia włączenia tej potężnej metodologii do swoich badań.

<table><tbody><tr><td>1 M wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 50 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>90114</td><td>Odczynnik do znakowania białek</td></tr><tr><td>50% hydroksyloaminy, 5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>90115</td><td>Odczynnik do znakowania białek</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>Odczynnik do trawienia białek</td></tr><tr><td>Bezwodny acetonitryl, LC-MS Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>51101</td><td>Odczynnik do znakowania białek</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Ścinanie DNA</td></tr><tr><td>Bond-Breaker TCEP roztwór, 5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>Odczynnik do znakowania białek</td></tr><tr><td>BSA standard</td><td>Thermo</td><td>23209</td><td>Odczynnik do pomiaru białka</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Thermo Fisher</td><td>28300</td><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td>Odczynnik do wytrącania białek</td></tr><tr><td>cKompletny, wolny od EDTA Inhibitor proteazy w tabletce</td><td>koktajlowej Roche</td><td>4693132001</td><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Test białkowy DC</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td>Odczynnik do pomiaru białka</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR analogowy</td><td>12621-104</td><td>Sprzęt do inkubacji trawienia białek</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RDD002</td><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>Fisher A452-4</td><td>Odczynnik do wytrącania białek</td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>90058</td><td>Odczynnik do trawienia białek</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>46436</td><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Sigma Plot 14.0</td><td>Sigma Plot 14.0</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td>Ścinanie DNA</td></tr><tr><td>Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>Czytnik płytek do pomiaru białek</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>23275</td><td>Odczynnik do białka pomiar</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Ilościowy test peptydów fluorescencyjnych</td><td>Thermo Fisher</td><td>23290</td><td>Odczynnik do pomiaru białek</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Proteome Discoverer Software</td><td>Thermo Fisher</td><td>OPTON-30945</td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0,8 mg, odczynniki wystarczające na jeden eksperyment izobaryczny 10plex</td><td>Thermo Fisher</td><td>90110</td><td>Odczynnik do znakowanie białek</td></tr><tr><td>TMT11-131C Etykieta Odczynnik 5 mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>A34807</td><td>Odczynnik do znakowania białek</td></tr><tr><td>Woda, LC-MS Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>51140</td><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki tmt do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Technologie proteomiczne to potężne metodologie, które mogą pomóc nam zrozumieć mechanizmy działania w systemach biologicznych, dostarczając globalnego spojrzenia na wpływ choroby, leczenia lub innego stanu na proteom jako całość. Raport ten zawiera szczegółowy protokół ekstrakcji, kwantyfikacji, wytrącania, trawienia, etykietowania i późniejszej analizy danych próbek białek. Nasz zoptymalizowany protokół etykietowania TMT wymaga niższego stężenia etykiety i zapewnia niezmiennie wiarygodne dane. Wykorzystaliśmy ten protokół do oceny profili ekspresji białek w różnych tkankach myszy (tj. sercu, mięśniach szkieletowych i mózgu), a także w komórkach hodowanych in vitro. Ponadto pokazujemy, jak ocenić tysiące białek z wynikowego zestawu danych.

Zdrowe i chore komórki poddano lizie w buforze CHAPS, przygotowanym zgodnie z opisem w naszej metodzie znakowania TMT, a następnie przekazano je do jednostki Proteomics Core w University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (UF-ICBR) w celu przeprowadzenia chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas. Po pozyskaniu i dostarczeniu danych z jednostki badawczej, zestaw danych otwarto w oprogramowaniu dostarczonym przez producenta i zastosowano następujące filtry odcięcia: ≥2 unikalne peptydy, jony reporterowe dla każdej próbki białek obecne we wszystkich kanałach oraz uwzględnienie wyłącznie białek o istotnych zmianach (p ≤ 0,05). Tabela 1 podsumowuje dane: 39 653 peptydów łącznie, z czego 7 211 posiada dwa lub więcej unikalnych peptydów, a 3 829 zawiera jony reporterowe dla wszystkich kanałów. Wartości p dla tych 3 829 peptydów obliczono za pomocą testu t Studenta, przyjmując p ≤ 0,05 za wartość istotną. Dodatkowo zastosowano próg zmiany krotności (fold-change) w celu określenia względnego rozkładu białek z komórek chorych w porównaniu do zdrowych: białka o obniżonej ekspresji (kolor niebieski) lub podwyższonej ekspresji (kolor czerwony) (Rysunek 1).
Listę istotnie rozregulowanej ekspresji białek oceniono przy użyciu systemu klasyfikacji ontologii PANTHER oraz analiz STRING. Analizy Panther wykazały skategoryzowaną listę białek na podstawie istotnie niższego (Rysunek 2A) lub wyższego poziomu ich występowania w komórkach chorych w zależności od funkcji molekularnej (Rysunek 2B). Analizy String białek o istotnie niższym (Rysunek 2C) i wyższym (Rysunek 2D) poziomie występowania zidentyfikowały liczne interakcje i silne powiązania między białkami.
<img alt="Wykres wulkaniczny; analiza ekspresji genów; krotność zmiany vs. wartość P; wyniki różnicowej ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wykres wulkaniczny przedstawiający białka, których poziom nie uległ istotnej zmianie (czarne), uległ istotnemu obniżeniu (niebieskie) lub istotnemu zwiększeniu (czerwone) w komórkach chorych w porównaniu z komórkami zdrowej grupy kontrolnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład funkcji białek; wykresy kołowe (A, B) i diagramy sieciowe (C, D), analiza aktywności molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60970/60970fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne oceny istotnie rozregulowanych hitów zidentyfikowanych przez PANTHER (A, B) i String (C, D) w odniesieniu do białek o istotnie niższej lub wyższej obfitości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60970/60970fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Całkowita zawartość peptydów</td>
			<td>Łączna liczba zidentyfikowanych</td>
			<td>≥ 2 unikalnych peptydów</td>
			<td>Ilościowo oznaczone białka</td>
			<td colspan="2">Istotnie zmienione białka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Niski</td>
			<td>Wysoki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39653</td>
			<td>7211</td>
			<td>4457</td>
			<td>3829</td>
			<td>296</td>
			<td>108</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Reprezentatywna tabela ilościowo określonych białek dla analizy każdego zestawu danych.

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Głównymi zaletami tego protokołu jest to, że obniża on koszty etykietowania, poprawia ekstrakcję białek i generuje wysokiej jakości dane. Głównymi zaletami naszego protokołu są wysoka skuteczność etykietowania dla różnych typów próbek, jego odtwarzalność i niezawodne pozyskiwanie danych. Po wyizolowaniu próbek tkanki mięśniowej mięśnia czworogłowego uda od myszy poddanej eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC, odważ 10 miligramów tkanki mięśniowej i użyj pęsety do oddzielenia włókien mięśniowych.Aby wytworzyć lizat, przenieś oddzieloną próbkę tkanki do dwumililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów jednomilimetrowych kulek krzemionki cyrkonu i 500 mikrolitrów buforu do lizy CHAPS. Umieść próbki w rozdzielaczu perełkowym i wykonaj dwa sekwencyjne 45-sekundowe przebiegi. Po drugim cyklu, aby uwolnić białko związane z DNA, należy poddać próbkę sonikacji 10 razy przez 10 sekund na sonikację przy amplitudzie 50% w 30-sekundowych odstępach na lodzie.Po ostatniej sonikacji odwirować lizat i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. W celu redukcji/alkilowania odczynników, przenieś 200 mikrogramów białka na stan do nowych probówek wirówkowych i użyj świeżego buforu do lizy CHAPS, aby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 100 mikrolitrów. Następnie dodaj pięć mikrolitrów TCEP do każdej probówki i inkubuj próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę.Pod koniec inkubacji rozpuść dziewięć miligramów jodoacetamidu w 132 mikrolitrach 100-milimolowego TEAB i chroń otrzymany 375-milimolowy roztwór jodoacetamidu przed światłem. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jodoacetamidu do każdej próbki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. W przypadku wytrącania metanolu/chloroformu dodać 400 mikrolitrów metanolu do każdych 100 mikrolitrów białka i krótko zawirować próbki.Aby wprowadzić ciecze osadzone na bokach probówek z próbkami, należy krótko odwirować próbki i dodać 100 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki. Po krótkim wirowaniu szybko ponownie odwiruj probówki, aby zebrać płyn po bokach probówek i dodaj 300 mikrolitrów wody do próbek. Energicznie wirować w celu uzyskania jednorodnych roztworów i odwirowywać próbki przez jedną minutę w tych samych warunkach wirowania.Na końcu wirówki ostrożnie przenieść probówki na stojak, nie naruszając warstw i ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 300 mikrolitrów metanolu do pozostałych faz pośrednich i dolnych i ponownie energicznie wirować próbki. Odwirować próbki przez dwie minuty i ostrożnie odessać supernatanty.Następnie delikatnie zassaj jak najwięcej płynu z każdej próbki pod strumieniem powietrza, aż granulki będą trochę wilgotne. Oceniaj nawodnienie co dwie minuty przez około 10 minut. W razie potrzeby granulki można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki.Aby strawić białko, należy ponownie zawiesić wytrącony osad w 100 mikrolitrach buforu do lizy TEAB i dodać 100 mikrolitrów roztworu do przechowywania trypsyny na dnie szklanej fiolki z trypsyną o pojemności 100 mikrogramów. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej dodać 2,5 mikrolitra świeżo przygotowanego roztworu trypsyny na 100 mikrogramów białka do każdej próbki i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku znakowania peptydowego rozpuść każdą fiolkę z 0,8 miligrama znacznika TMT w 41 mikrolitrach bezwodnego acetonitrylu na znacznik i inkubuj odczynniki przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym wirowaniem, chroniąc etykiety przed światłem.Pod koniec inkubacji krótko odwirować fiolki i ostrożnie dodać 41 mikrolitrów odczynnika do etykiety TMT do każdej próbki o pojemności 100 mikrolitrów na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcje z dodatkiem ośmiu mikrolitrów 5% hydroksyloaminy przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie podziel próbki na równe porcje w nowych probówkach wirówkowych do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W tym reprezentatywnym pozyskiwaniu danych przeanalizowano 39 653 peptydy ogółem, z których 4 457 miały równe lub większe niż dwa unikalne peptydy, a 3 829 zawierało jony reporterowe dla wszystkich kanałów. Do określenia względnej dystrybucji białek z komórek chorych w porównaniu ze zdrowymi zastosowano odcięcie zmiany krotności, przy czym zaobserwowano 296 białek o znacznie mniejszej liczebności i 108 białkach o znacznie wyższej obfitości. Analiza PANTHER wykazała skategoryzowaną listę białek opartą na znacznie niższej lub wyższej liczebności chorych komórek w oparciu o ich funkcję molekularną.Analiza ciągów białek o znacznie niższej lub wyższej liczebności pozwoliła na zidentyfikowanie wielu interakcji i silnych powiązań między białkami. Można zastosować dodatkowe metody w celu identyfikacji interakcji białko-białko, klasyfikacji interakcji według grup oraz identyfikacji interakcji w różnych szlakach. Techniki proteomiczne są potężnymi narzędziami w dziedzinach badań biomedycznych, które pozwalają zrozumieć mechanizmy rozwoju chorób poprzez dostarczanie szczegółowych informacji o obfitości białek.

tmt-sample-preparation-for-proteomics-facility-submission-subsequent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Poznaj zoptymalizowany protokół etykietowania TMT do analizy proteomicznej próbek tkanki mięśniowej myszy. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność etykietowania, powtarzalność i niezawodną akwizycję danych w badaniach biomedycznych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Przeglądaj więcej filmów