Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Głównymi zaletami tego protokołu jest to, że obniża on koszty etykietowania, poprawia ekstrakcję białek i generuje wysokiej jakości dane. Głównymi zaletami naszego protokołu są wysoka skuteczność etykietowania dla różnych typów próbek, jego odtwarzalność i niezawodne pozyskiwanie danych. Po wyizolowaniu próbek tkanki mięśniowej mięśnia czworogłowego uda od myszy poddanej eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC, odważ 10 miligramów tkanki mięśniowej i użyj pęsety do oddzielenia włókien mięśniowych.

Aby wytworzyć lizat, przenieś oddzieloną próbkę tkanki do dwumililitrowej probówki zawierającej 200 mikrolitrów jednomilimetrowych kulek krzemionki cyrkonu i 500 mikrolitrów buforu do lizy CHAPS. Umieść próbki w rozdzielaczu perełkowym i wykonaj dwa sekwencyjne 45-sekundowe przebiegi. Po drugim cyklu, aby uwolnić białko związane z DNA, należy poddać próbkę sonikacji 10 razy przez 10 sekund na sonikację przy amplitudzie 50% w 30-sekundowych odstępach na lodzie.

Po ostatniej sonikacji odwirować lizat i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. W celu redukcji/alkilowania odczynników, przenieś 200 mikrogramów białka na stan do nowych probówek wirówkowych i użyj świeżego buforu do lizy CHAPS, aby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 100 mikrolitrów. Następnie dodaj pięć mikrolitrów TCEP do każdej probówki i inkubuj próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę.

Pod koniec inkubacji rozpuść dziewięć miligramów jodoacetamidu w 132 mikrolitrach 100-milimolowego TEAB i chroń otrzymany 375-milimolowy roztwór jodoacetamidu przed światłem. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jodoacetamidu do każdej próbki i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. W przypadku wytrącania metanolu/chloroformu dodać 400 mikrolitrów metanolu do każdych 100 mikrolitrów białka i krótko zawirować próbki.

Aby wprowadzić ciecze osadzone na bokach probówek z próbkami, należy krótko odwirować próbki i dodać 100 mikrolitrów chloroformu do każdej probówki. Po krótkim wirowaniu szybko ponownie odwiruj probówki, aby zebrać płyn po bokach probówek i dodaj 300 mikrolitrów wody do próbek. Energicznie wirować w celu uzyskania jednorodnych roztworów i odwirowywać próbki przez jedną minutę w tych samych warunkach wirowania.

Na końcu wirówki ostrożnie przenieść probówki na stojak, nie naruszając warstw i ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 300 mikrolitrów metanolu do pozostałych faz pośrednich i dolnych i ponownie energicznie wirować próbki. Odwirować próbki przez dwie minuty i ostrożnie odessać supernatanty.

Następnie delikatnie zassaj jak najwięcej płynu z każdej próbki pod strumieniem powietrza, aż granulki będą trochę wilgotne. Oceniaj nawodnienie co dwie minuty przez około 10 minut. W razie potrzeby granulki można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki.

Aby strawić białko, należy ponownie zawiesić wytrącony osad w 100 mikrolitrach buforu do lizy TEAB i dodać 100 mikrolitrów roztworu do przechowywania trypsyny na dnie szklanej fiolki z trypsyną o pojemności 100 mikrogramów. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej dodać 2,5 mikrolitra świeżo przygotowanego roztworu trypsyny na 100 mikrogramów białka do każdej próbki i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. W przypadku znakowania peptydowego rozpuść każdą fiolkę z 0,8 miligrama znacznika TMT w 41 mikrolitrach bezwodnego acetonitrylu na znacznik i inkubuj odczynniki przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym wirowaniem, chroniąc etykiety przed światłem.

Pod koniec inkubacji krótko odwirować fiolki i ostrożnie dodać 41 mikrolitrów odczynnika do etykiety TMT do każdej próbki o pojemności 100 mikrolitrów na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcje z dodatkiem ośmiu mikrolitrów 5% hydroksyloaminy przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie podziel próbki na równe porcje w nowych probówkach wirówkowych do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W tym reprezentatywnym pozyskiwaniu danych przeanalizowano 39 653 peptydy ogółem, z których 4 457 miały równe lub większe niż dwa unikalne peptydy, a 3 829 zawierało jony reporterowe dla wszystkich kanałów. Do określenia względnej dystrybucji białek z komórek chorych w porównaniu ze zdrowymi zastosowano odcięcie zmiany krotności, przy czym zaobserwowano 296 białek o znacznie mniejszej liczebności i 108 białkach o znacznie wyższej obfitości. Analiza PANTHER wykazała skategoryzowaną listę białek opartą na znacznie niższej lub wyższej liczebności chorych komórek w oparciu o ich funkcję molekularną.

Analiza ciągów białek o znacznie niższej lub wyższej liczebności pozwoliła na zidentyfikowanie wielu interakcji i silnych powiązań między białkami. Można zastosować dodatkowe metody w celu identyfikacji interakcji białko-białko, klasyfikacji interakcji według grup oraz identyfikacji interakcji w różnych szlakach. Techniki proteomiczne są potężnymi narzędziami w dziedzinach badań biomedycznych, które pozwalają zrozumieć mechanizmy rozwoju chorób poprzez dostarczanie szczegółowych informacji o obfitości białek.