Name: Echokardiografia ultradźwiękowa wysokiej częstotliwości w celu oceny czynności serca danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj nieinwazyjną echokardiografię wysokiej częstotliwości do oceny morfologii i funkcji serca dorosłych danio pręgowanego. Metoda umożliwia wizualizację parametrów kardiologicznych oraz badań chorób serca i przesiewowych badań leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fredowi Robertsowi za wsparcie techniczne i korektę manuskryptu.

Wszystkie procedury dotyczące danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez nasz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania i są zgodne z Ustawą USDA o Dobrostanie Zwierząt.
1. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Konfiguracja platformy do pozyskiwania obrazów
	<ol>
		<li>Za pomocą małych nożyczek lub skalpela wykonaj nacięcie na gąbce w pozycji godziny 12, aby przytrzymać rybę podczas skanowania. Umieść gąbkę w szklanym pojemniku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
		UWAGA: Położenie nacięcia powinno zapewniać wystarczająco dużo miejsca na przesunięcie przetwornika, a także na utrzymanie ryby poniżej linii wodnej, gdy platforma jest przechylona w celu skanowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Nacięcie może się różnić w zależności od wielkości ryby; Jednak w przypadku standardowego rozmiaru i wagi nacięcie powinno mieć wymiary około 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (odpowiednio długość, szerokość i głębokość). Szklany pojemnik powinien mieć co najmniej 6 cm głębokości, aby uniknąć wycieku wody podczas obrazowania ryby.</li>
		<li>Przymocuj szklane pudełko zawierające gąbkę do platformy ultradźwiękowej, na przykład za pomocą taśmy dwustronnej. Upewnij się, że szklane pudełko znajduje się na środku platformy i jest mocno przymocowane (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Przechyl platformę do przodu o około 30° za pomocą pokrętła po lewej stronie uchwytu platformy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Napełnij szklany kwadrat 200-250 ml wody z systemu rybnego zawierającej 0,2 mg/ml metanosulfonianu trikainy (MS222). 
		UWAGA: Trikaina może być przygotowana jako roztwór podstawowy o stężeniu 4 mg/ml w Tris 40 mM pH 7 i dalej rozcieńczana do pożądanego stężenia w wodzie z systemem rybnym; Stwierdzono, że 0,2 mg/ml jest najlepszym stężeniem<klasa sup="xref">16. Roztwór podstawowy trikainy o stężeniu 4 mg/ml może być przechowywany przez długi czas w temperaturze -20 °C lub w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc.</li>
		<li>Włóż przetwornik do uchwytu mikromanipulatora na roboczej stacji kolejowej, obracając wycięcie przetwornika w kierunku operatora. Utrzymuj tablicę równolegle do podłoża, stroną roboczą wzdłużnie w stosunku do stolika (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Pozostaw wystarczająco dużo miejsca (10 cm po obu stronach), aby teraz połączony system szyny przetwornika mógł poruszać się wzdłuż osi x i y.</li>
		<li>Zaloguj się do oprogramowania sterującego i wybierz Mysz (mała) Naczyniowa. Utwórz nowe badanie, a także nową serię dla każdego zwierzęcia uwzględnionego w badaniu. Znajdź przycisk nowego badania znajdujący się w lewym dolnym rogu ekranu na stronie przeglądarki (widok uruchamia się w trybie B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obchodzenie się z rybami
UWAGA: Danio pręgowany użyty w tym badaniu to dorosłe, 11-miesięczne samce dzikiego szczepu AB/Tuebingen (AB/TU). Danio pręgowany utrzymywano w samodzielnym systemie akwariowym przepływowym w temperaturze 28 °C w stałym cyklu świetlnym ustawionym na 14 godzin światła/10 godzin ciemności. Danio pręgowany karmiono dwa razy dziennie krewetkami solankowymi (Artemia nauplii) i suchymi płatkami pokarmowymi.
<ol>
	<li>Za pomocą siatki na ryby przenieś rybę do małego zbiornika zawierającego wodę systemową z 0,2 mg/ml trikainy. Poczekaj, aż ryba zostanie w pełni znieczulona (bez ruchu i bez reakcji na dotyk).</li>
	<li>Za pomocą plastikowej łyżeczki delikatnie i szybko przenieś rybę do szklanego pudełka zawierającego gąbkę do wcześniej wykonanego nacięcia brzuszną stroną ryby skierowaną do góry. 
	UWAGA: Upewnij się, że głowa ryby jest skierowana w stronę operatora (w tym samym kierunku co wycięcie przetwornika) i na nieco wyższym poziomie w porównaniu z resztą ciała, aby uzyskać lepszą wizualizację serca.</li>
	<li>Delikatnie opuść przetwornik (zachowując jego pierwotną pozycję) za pomocą uchwytu na systemie szynowym, umieszczając go wzdłużnie i blisko brzusznej strony ryby, z wycięciem przetwornika skierowanym w stronę operatora. Pozostaw 2-3 mm (nie więcej niż 1 cm) odstępu od ryby. Dostosuj platformę względem przetwornika za pomocą mikromanipulatora we wszystkich 3 osiach, aż do wizualizacji serca ryby, a następnie rozpocznij akwizycję obrazu. Kąt przetwornika nie powinien być zmieniany podczas całej akwizycji obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Dopóki odległość jest wystarczająca (do 1 cm), woda na wierzchu ryby zapewni powierzchnię kontaktu poprzez napięcie powierzchniowe cieczy, które umożliwia przenoszenie fal ultradźwiękowych między sondą a rybą. Dlatego nie ma potrzeby dociskania przetwornika do ryby. Spróbuj wykonać ten krok i zakończyć skanowanie w czasie krótszym niż 3 minuty, aby zapobiec śmierci ryb lub spadkowi tętna podczas akwizycji obrazu. W razie potrzeby użyj timera. Serce znajduje się w górnej części ekranu w kierunku lewej strony oka, co można łatwo zwizualizować, przesuwając oś x maksymalnie w prawo. Jeśli nadal występują trudności ze znalezieniem serca w trybie B, przełącz się na kolorowy tryb Dopplera, który pozwoli śledzić przepływ krwi (kolor czerwony oznacza krew płynącą w kierunku operatora) i zlokalizować serce.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla systemu obrazowania i oprogramowania do analizy obrazu.
<ol>
	<li>Widok wzdłużny Tryb B
	<ol>
		<li>Po zlokalizowaniu serca wybierz lub pozostań w trybie B (znajdującym się w lewym dolnym rogu ekranu dotykowego po zainicjowaniu nowej serii) i zmniejsz pole, aby powiększyć i przyjrzeć się bliżej sercu w celu łatwiejszego śledzenia podczas analizy.</li>
		<li>Aby uzyskać bliższy i wyraźniejszy widok serca podczas akwizycji obrazu w trybie B-Mode, zmniejsz pole przez powiększenie. Użyj ekranu dotykowego, aby ręcznie zawęzić pole zarówno na osi x, jak i y.</li>
		<li>W razie potrzeby popraw jakość/kontrast obrazu, ustawiając zakres dynamiki na 45-50 dB. Przejdź do elementów sterujących trybu B w opcji Więcej elementów sterujących, a następnie zapisz zmianę w ustawieniach wstępnych trybu. Stuknij opcję Ustawienia wstępne trybu, aby wybrać zoptymalizowane ustawienie akwizycji obrazu za każdym razem przed rozpoczęciem obrazowania nowej serii.</li>
		<li>Zrób tyle zdjęć, ile chcesz, w płaszczyźnie osi długiej, wybierając opcję Zapisz obraz. 
		UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje i zasoby szkoleniowe dotyczące pozyskiwania obrazów można znaleźć na stronach <a href="https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab" target="_blank">https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab</a> i <a href="https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users" target="_blank">https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users</a></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Widok podłużny Fala pulsu
	<ol>
		<li>Przełącz się na Color Doppler, aby wykrywać przepływ krwi (wybierz przycisk Kolor) i akwizycję (znajduje się w lewym dolnym rogu ekranu dotykowego po zainicjowaniu nowej serii).</li>
		<li>Za pomocą ekranu dotykowego ustaw kwadrant na górze zastawki przedsionkowo-komorowej i zlokalizuj dopływ, który zostanie wyróżniony sygnałem koloru czerwonego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Zmniejsz obszar kwadrantu tak bardzo, jak to możliwe, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę. 
		UWAGA: Zmniejsz częstotliwość powtarzania impulsów kolorów (Color PRF) (zakres prędkości), aby upewnić się, że żółty kolor jest widoczny w profilu prędkości obrazu Color Doppler. Zwiększy to zakres prędkości, które można zobaczyć i pomoże stworzyć mozaikę kolorów, która pozwoli wyraźniej zobrazować prędkości szczytowe.</li>
		<li>Aktywuj falę tętna (wybierz PW) Tryb Dopplera, aby pobrać próbkę prędkości napływu krwi w komorach. Umieść bramkę objętości próbki na środku zastawki przedsionkowo-komorowej (gdzie sygnał koloru czerwonego staje się bardziej żółtawy), aby wykryć maksymalną prędkość przepływu. Dostosuj kąt PW na ekranie palcami, aby wyrównał się z kierunkiem napływu krwi. Naciśnij przycisk start lub aktualizuj, aby rozpocząć pobieranie próbek prędkości krwi wpływającej do komory. 
		UWAGA: Upewnij się, że linia pod odpowiednim kątem jest równoległa do przepływu krwi, aby zapewnić spójne i powtarzalne wyniki. Umieszczenie linii pod odpowiednim kątem, tak aby pasowała do kierunku przepływu krwi, zapewni dokładne uchwycenie prędkości.</li>
		<li>Powtórz krok 3.2.3, aby określić prędkość odpływu, umieszczając kolorowy kwadrant Dopplera na styku między komorą a bańką (zastawką opuszkowo-komorową) i zlokalizuj przepływ, który zostanie odróżniony przez sygnał koloru niebieskiego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B). Umieść bramkę objętości próbki tuż przed połączeniem komora-opuszka i wyreguluj linię korekcji kąta, aby dopasować ją do kierunku przepływu krwi. 
		UWAGA: Jak wspomniano wcześniej, aby uzyskać dokładne wartości prędkości, upewnij się, że kąt PW jest wyrównany z przepływem krwi.</li>
		<li>Dostosuj linię bazową (pasek), obniżając ją lub podnosząc w panelu prędkości przepływu, aby całkowicie wykryć i prześledzić piki sygnału (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C,D). Zidentyfikuj piki dopływu w górnym/dodatnim kwadrancie (sygnał idący w kierunku sondy) i piki odpływu w dolnym/ujemnym kwadrancie (sygnał oddalający się od sondy).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie ryb
<ol>
	<li>Jak tylko akwizycja obrazu zostanie zakończona, za pomocą łyżeczki przenieś rybę do zwykłej napowietrzonej wody wolnej od tricainy i pozwól rybie dojść do siebie (zwykle potrzeba 30 s do 2 minut, aby wznowić ruch skrzeli i pływanie).</li>
	<li>Aby wspomóc regenerację, kilkakrotnie spryskuj skrzela wodą za pomocą pipety transferowej, aby przyspieszyć napowietrzanie wody i transfer tlenu.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.</li>
	<li>Wybierz obraz i kliknij ikonę przetwarzania obrazu (Rysunek 4). Korzystając z dostępnej skali (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby umożliwić wyraźną wizualizację ścian komór lub wzorca przepływu krwi.</li>
	<li>Korzystając z obrazu w trybie B, otwórz listę rozwijaną z opcji PSLAX (długa oś przymostkowa) w pakiecie/pomiarach serca (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Wybierz ślad LV i prześledź wewnętrzną ścianę komory przy skurczu i rozkurczu, aby uzyskać obszar komory (VA) w skurczu (VA) i rozkurczu (VAd), końcową objętość rozkurczową (EDV) i końcową objętość skurczową (ESV) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A,B). 
	UWAGA: Wartości objętości są ekstrapolowane na podstawie obrysów obrazu 2D i mogą odbiegać od elementu 3D. W przypadku wszystkich pomiarów należy uśrednić co najmniej 3 reprezentatywne cykle pracy serca na zwierzę.</li>
	<li>Zwróć uwagę na objętość skokową i frakcję wyrzutową, które zostaną automatycznie obliczone i wyświetlone przez oprogramowanie. 
	UWAGA: Objętość wyrzutową i frakcję wyrzutową można również obliczyć ręcznie za pomocą wzorów 
	SV = EDV-ESV 
	EF = (EDV-ESV)/EDV 
	gdzie SV to objętość wyrzutowa, EDV to objętość końcowa rozkurczowa, ESV to końcowa objętość skurczowa, a EF to frakcja wyrzutowa</li>
	<li>Oblicz ułamkową zmianę obszaru za pomocą wzoru 
	FAC = (VAd - VAs)/ VAd 
	gdzie FAC to ułamkowa zmiana obszaru, VAd to obszar komorowy w rozkurczu, a VAs to obszar komorowy w skurczu.</li>
	<li>Oblicz rzut serca za pomocą wzoru 
	CO = HR x SV 
	gdzie CO to pojemność minutowa serca, HR to tętno, a SV to objętość wyrzutowa</li>
	<li>Korzystając z obrazu w trybie Dopplera fali pulsacyjnej, zmierz prędkość dopływu krwi, wybierając opcję MV Flow pod pakietem kardiologicznym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4). Wybierz E lub A odpowiednio dla wczesnego i późnego rozkurczu i określ prędkości szczytowe na wykresie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Zmierz prędkość odpływu krwi, wybierając Przepływ AoV i określ piki na śledzeniu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Zmierz tętno przy użyciu 2 różnych metodologii, aby uzyskać bardziej wiarygodną ocenę:
	<ol>
		<li>Gdy serce zostanie zobrazowane na ekranie podczas akwizycji obrazu, policz uderzenia w ciągu 10 sekund i pomnóż je przez 6.</li>
		<li>Korzystając z obrazu Dopplera fali tętna w oprogramowaniu Vevo LAB, wybierz przycisk tętna i śledź odstępy między 3 kolejnymi szczytami przepływu aorty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 6).</li>
		<li>Aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego po prześledzeniu LV i szczytów przepływu krwi, kliknij raport | eksport | zapisz jako | excel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Verkerk, A. O., Remme, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+novel+research+tool+for+cardiac+%28patho%29electrophysiology+and+ion+channel+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders.</a> Frontiers in Physiology. 3, 255(2012).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>Poon, K. L., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+model+system+in+cardiovascular+research%3A+A+tiny+fish+with+mighty+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+and+Practise%22%5BJournal%5D)">The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects.</a> Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).</li>
<li>Jopling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+regeneration+occurs+by+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation.</a> Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+amyloid+light+chain+cardiotoxicity%3A+regeneration+versus+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).</li>
<li>Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cardiovascular+function+confirms+functional+orthology+of+myocardial+contractility+pathways+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologycal+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish.</a> Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amyloidogenic+light+chain+proteins+result+in+cardiac+dysfunction%2C+cell+death%2C+and+early+mortality+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish.</a> American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).</li>
<li>Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Coronary+Ultrasound+Imaging+to+Evaluate+Ventricular+Function+in+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish.</a> Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).</li>
<li>González-Rosa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Echocardiography+Reveals+Reestablishment+of+Ventricular+Pumping+Efficiency+and+Partial+Ventricular+Wall+Motion+Recovery+upon+Ventricular+Cryoinjury+in+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish.</a> PLoS One. 9 (12), (2014).</li>
<li>Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+tissue+Doppler+imaging+of+the+zebrafish+heart+during+its+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration.</a> Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+dual+mode+pulsed+wave+Doppler+imaging+for+monitoring+the+functional+regeneration+of+adult+zebrafish+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts.</a> Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+ventricular+function+in+a+zebrafish+model+of+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair.</a> Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).</li>
<li>Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Cardiac+Imaging+of+Adult+Zebrafish+Using+High+Frequency+Ultrasound+%2845-75+MHz%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz).</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Frequency+Echocardiography-+Transformative+Clinical+and+Research+Applications+in+Humans%2C+Mice%2C+and+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish.</a> Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).</li>
<li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63(2017).</li>
<li>Lee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Cardiac+Responses+of+Adult+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+to+Acute+and+Chronic+Temperature+Change+Using+High-Resolution+Echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0145163(2016).</li>
<li>Genge, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGenge%2C+CE+%22Reviews+of+Physiology%2C+Biochemistry+and+Pharmacology%22">Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology</a>. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano systematyczną metodę obrazowania echokardiograficznego i oceny funkcji serca u dorosłych ryb danio pręgowanego. Echokardiografia jest jedyną dostępną nieinwazyjną i najbardziej niezawodną metodą obrazowania serca i analizy funkcjonalnej żywych dorosłych ryb, która staje się coraz bardziej popularna w badaniach sercowo-naczyniowych danio pręgowanego. Ilość potrzebnego czasu jest krótka i pozwala na przeprowadzenie badań wysokoprzepustowych i podłużnych. Istnieją jednak znaczne różnice w stosowanej metodologii i an...

Danio rerio (Danio rerio) to sprawdzony model kręgowców do badań nad procesami rozwojowymi i chorobami ludzkimi1. Danio pręgowany ma wysokie podobieństwo genetyczne do ludzi (70%), podatność genetyczną, wysoką płodność i przezroczystość optyczną podczas rozwoju embrionalnego, co umożliwia bezpośrednią analizę wzrokową narządów i tkanek, w tym serca. Pomimo posiadania tylko jednego przedsionka i jednej komory, serce danio pręgowanego (ryc. 1) jest fizjologicznie podobne do czterokomorowych serc ssaków. Co ważne, tętno danio pręgowanego, morfologia elektrokardiogramu i kształt potencjału czynnościowego bardziej przypominają ludzkie niż mysie2. Te cechy sprawiły, że danio pręgowany stał się doskonałym modelem do badań sercowo-naczyniowych i dostarczył ważnych informacji na temat rozwoju serca3,4, regeneration5 i stany patologiczne1,3,4, w tym miażdżyca, kardiomiopatie, zaburzenia rytmu serca, wrodzone choroby serca i amyloidowy łańcuch lekki Kardiotoksyczność1,4,6. Ocena czynności serca była możliwa w fazie embrionalnej (1 dzień po zapłodnieniu) dzięki bezpośredniej analizie wideo przy użyciu szybkiej wideomikroskopii7,8. Jednak danio pręgowany traci przezroczystość poza stadium embrionalnym, co ogranicza ocenę funkcjonalną normalnych dojrzałych serc i późnych chorób serca. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, echokardiografia została z powodzeniem zastosowana jako nieinwazyjna alternatywa obrazowania w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji serca dorosłego danio pręgowanego9,10,11,12,13,14,15.
U danio pręgowanego serce znajduje się brzusznie w jamie piersiowej bezpośrednio za skrzelami, a przedsionek znajduje się grzbietowo do komory. Przedsionek zbiera krew żylną z zatoki żylnej i przenosi ją do komory, gdzie jest dalej pompowana do opuszki tętniczej (ryc. 1). W tym miejscu opisujemy fizjologiczny, podwodny protokół oceny czynności serca u dorosłych danio pręgowanego za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii przy użyciu liniowej sondy ultradźwiękowej o częstotliwości środkowej 50 MHz do obrazowania w trybie B z rozdzielczością 30 μm. Ponieważ fale ultradźwiękowe mogą łatwo przemieszczać się w wodzie, utrzymywanie bliskiej odległości między rybą a sondą skanującą pod wodą zapewnia wystarczającą powierzchnię kontaktu do wykrywania serca bez potrzeby stosowania żelu ultradźwiękowego i jest ogólnie mniej stresujące dla ryb. Chociaż kilku autorów zgłosiło alternatywne systemy echokardiografii danio pręgowanego9,12,13, tutaj przedstawiamy ogólną i najczęściej używaną konfigurację, która ma zastosowanie do ultradźwięków o wysokiej częstotliwości u zwierząt.
Metoda pozwala na obrazowanie serca dorosłego danio pręgowanego w wysokiej rozdzielczości, śledzenie struktur serca i kwantyfikację prędkości szczytowych na podstawie dopplerowskich pomiarów przepływu krwi. Pokazujemy wiarygodną kwantyfikację in vivo ważnych parametrów skurczowych i rozkurczowych, takich jak frakcja wyrzutowa (EF), frakcyjna zmiana obszaru (FAC), komorowy napływ i odpływ krwi, tętno (HR) i rzut serca (CO). Przyczyniamy się do ustalenia wiarygodnego zakresu normalnych, zdrowych, dorosłych dorosłych ryb danio pręgowanych, parametrów czynnościowych i wymiarowych, aby umożliwić bardziej precyzyjną ocenę stanów patologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, zapewniamy solidną metodę oceny funkcji serca u danio pręgowanego, która okazała się niezwykle przydatna w tworzeniu i walidacji modeli chorób serca danio pręgowanego6,16, uraz serca i rekonwalescencja10,13 i regeneration11,12, i może być dalej wykorzystywany do oceny potencjalnych leków.

<table><tbody><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td>dwustronna</tr><tr><td>Siatka</td><td></td><td></td><td></td>na ryby</tr><tr><td>Szklany pojemnik - 100-calowy</td> przetwornik wysokiej <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>częstotliwości</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td>MX700</td><td>Szerokość pasma 29-71 MHz, transmisja środkowa 50 MHz, rozdzielczość osiowa 30 i mikro; m</td></tr><tr><td>Plastikowa łyżeczka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel lub nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe akwaria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gąbka (gąbka kuchenna)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe (z podziałką 3 ml)</td><td>Samco Scientific</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 3100 System obrazowania i stacja obrazowania</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo LAB sofware v 1.7.1</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

echokardiografia ultradźwiękowa wysokiej częstotliwości w celu oceny czynności serca danio pręgowanego

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) stał się bardzo popularnym organizmem modelowym w badaniach sercowo-naczyniowych, w tym nad chorobami serca u ludzi, głównie ze względu na jego embrionalną przezroczystość, podatność genetyczną i łatwość w szybkich, wysokoprzepustowych badaniach. Jednak utrata przezroczystości ogranicza analizę funkcji serca w wieku dorosłym, co komplikuje modelowanie chorób serca związanych z wiekiem. Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, ultrasonografia ultrasonograficzna o wysokiej częstotliwości u danio pręgowanego staje się realną opcją. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół oceny czynności serca u dorosłych danio pręgowanego za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii z wykorzystaniem ultradźwięków o wysokiej częstotliwości. Metoda umożliwia wizualizację i analizę wymiaru serca danio pręgowanego oraz ilościowe określenie ważnych parametrów funkcjonalnych, w tym częstości akcji serca, objętości wyrzutowej, pojemności minutowej serca i frakcji wyrzutowej. W tej metodzie ryby są znieczulane i trzymane pod wodą, a po zabiegu można je odzyskać. Chociaż ultradźwięki o wysokiej częstotliwości są kosztowną technologią, ta sama platforma obrazowania może być stosowana dla różnych gatunków (np. myszy i danio pręgowanego) poprzez dostosowanie różnych przetworników. Echokardiografia danio pręgowanego jest solidną metodą fenotypowania serca, przydatną w walidacji i charakterystyce modeli chorób, szczególnie chorób o późnym początku; badania przesiewowe na obecność narkotyków; oraz badania nad uszkodzeniem serca, rekonwalescencją i zdolnościami regeneracyjnymi.

Opisany protokół umożliwia pomiar istotnych parametrów wymiarowych i funkcjonalnych serca, analogicznie do techniki stosowanej w echokardiografii u ludzi i zwierząt. Obrazy w trybie B-mode pozwalają na odrysowanie wewnętrznej ściany komory w skurczu i rozkurczu (Rycina 5) oraz uzyskanie danych wymiarowych, takich jak wymiary jam i ścian, oraz danych funkcjonalnych, takich jak częstość akcji serca, objętość wyrzutowa i rzut serca, a także parametrów funkcji sk...

Opisujemy protokół oceny morfologii i funkcji serca u dorosłych ryb pręgowanych za pomocą echokardiografii o wysokiej częstotliwości. Metoda umożliwia wizualizację pracy serca i późniejsze ilościowe określenie parametrów funkcjonalnych, takich jak tętno (HR), pojemność minutowa serca (CO), ułamkowa zmiana obszaru (FAC), frakcja wyrzutowa (EF) oraz prędkości napływu i odpływu krwi.

Echokardiografia ultradźwiękowa wysokiej częstotliwości w celu oceny czynności serca danio pręgowanego

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Protokół umożliwia nieinwazyjną i wysokorozdzielczą reprezentację i analizę funkcji serca dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta może być stosowana do walidacji modeli chorób serca u dorosłych i potencjalnych badań przesiewowych leków. Technika ta umożliwia szybkie pozycjonowanie ryb w celu prawidłowego obrazowania, zapewniając dokładne i powtarzalne wyniki.Jest nieinwazyjny i wykonywany pod wodą, co pozwala na szybką regenerację ryb. Aby ustawić platformę do akwizycji obrazu, użyj małych nożyczek lub skalpela, aby wykonać nacięcie na gąbce w pozycji godziny 12. Umieść gąbkę w szklanym pojemniku.Za pomocą taśmy dwustronnej przymocuj szklany pojemnik zawierający gąbkę do platformy ultradźwiękowej. Upewnij się, że szklany pojemnik znajduje się na środku platformy i jest mocno przymocowany. Przechyl platformę do przodu o około 30 stopni za pomocą pokrętła po lewej stronie uchwytu platformy.Napełnij szklany pojemnik około 200 mililitrami wody z systemu rybnego zawierającej 0,2 miligrama na mililitr metanosulfonianu trikainy. Włóż przetwornik do uchwytu mikromanipulatora na roboczej stacji kolejowej, obracając wycięcie przetwornika w kierunku operatora. Utrzymuj tablicę równolegle do podłoża, tak aby strona robocza była wzdłużna w stosunku do stolika.Pozostaw wystarczająco dużo miejsca około 10 centymetrów po obu stronach, aby teraz połączony system szyn przetwornika mógł poruszać się wzdłuż osi x i y. Zaloguj się do oprogramowania sterującego i wybierz mysz mała naczyniowa. Utwórz nowe badanie, a także nową serię dla każdego zwierzęcia indukowanego w badaniu.Naciśnij przycisk nowego badania znajdujący się w lewym dolnym rogu ekranu na stronie przeglądarki. Widok rozpoczyna się w trybie B. Za pomocą siatki na ryby przenieś rybę do małego zbiornika zawierającego wodę systemową z 0,2 miligrama na mililitr tricainy.Poczekaj, aż ryba zostanie w pełni znieczulona, bez ruchu lub bez reakcji na dotyk. Delikatnie i szybko przenieś rybę do szklanego pojemnika z gąbką do wcześniej wykonanego nacięcia brzuszną stroną ryby skierowaną do góry. Delikatnie opuść przetwornik za pomocą uchwytu na systemie szynowym, umieszczając go wzdłużnie i zamknij brzuszną stronę ryby wycięciem przetwornika skierowanym w stronę operatora.Pozostaw od dwóch do trzech milimetrów odstępu od ryby. Wyreguluj platformę względem przetwornika za pomocą mikromanipulatora we wszystkich trzech osiach, aż do wizualizacji serca ryby. Natychmiast po zlokalizowaniu serca wybierz lub pozostań w trybie B i zmniejsz pole, przybliżając, aby uzyskać bliższe przyjrzenie się sercu.W razie potrzeby popraw jakość lub kontrast obrazu, ustawiając zakres dynamiczny na 45 do 50 decybeli. Przejdź do elementów sterujących trybu B w opcji więcej elementów sterujących, a następnie zapisz zmianę ustawień wstępnych trybu. Dotknij ustawień wstępnych trybu, aby wybrać zoptymalizowane ustawienie akwizycji obrazu za każdym razem przed rozpoczęciem obrazowania nowej serii.Wykonaj tyle zdjęć, ile chcesz, w płaszczyźnie osi długiej. Następnie przełącz się na kolorowy Doppler do wykrywania i akwizycji przepływu krwi. Za pomocą ekranu dotykowego umieść kwadrant na górze zastawki przedsionkowo-komorowej i zlokalizuj dopływ, który jest wyróżniony sygnałem koloru czerwonego.Zmniejsz obszar kwadrantu tak bardzo, jak to możliwe, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę. Aktywuj ruch dopplerowski fali tętna, aby pobrać próbkę prędkości przepływu krwi w komorze. Umieść bramkę objętości próbki na środku zastawki przedsionkowo-komorowej, aby wykryć maksymalną prędkość przepływu.Sygnał koloru czerwonego staje się bardziej żółtawy. Dostosuj kąt fali tętna na ekranie za pomocą palców, aby wyrównał się z kierunkiem napływu krwi. Naciśnij start lub aktualizuj, aby rozpocząć pobieranie próbek prędkości krwi wpływającej do komory.Określ prędkość odpływu, umieszczając kolorowy kwadrant Dopplera na styku komory i bańki i zlokalizuj przepływ. Wyróżnia się to sygnałem w kolorze niebieskim. Umieść bramkę objętości próbki tuż przed złączem opuszki komory i dostosuj linię korekcji kąta, aby dopasować ją do kierunku przepływu krwi.Dostosuj linię bazową, podnosząc ją w panelu prędkości przepływu, aby w pełni wykryć i śledzić piki sygnału. Jak tylko akwizycja obrazu zostanie zakończona, użyj łyżeczki i przenieś rybę do zwykłej wody napowietrzonej bez tricainy i pozwól rybie dojść do siebie. Aby wspomóc regenerację, kilkakrotnie spryskuj skrzela wodą za pomocą pipety transferowej, aby przyspieszyć napowietrzanie wody i transfer tlenu.Wznowienie ruchu skrzeli i pływania zajmuje zwykle od 30 sekund do dwóch minut. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Wybierz obraz i kliknij ikonę przetwarzania obrazu.Dostosuj jasność i kontrast obrazu, aby umożliwić wyraźną wizualizację ścian komór lub wzorca przepływu krwi. Korzystając z obrazu w trybie B, otwórz listę rozwijaną z opcji przymostkowej osi długiej w pomiarach pakietu sercowego. Wybierz ślad LV i prześledź wewnętrzną ścianę komory przy skurczu i rozkurczu, aby uzyskać obszar komory w skurczu i rozkurczu oraz objętości rozkurczowej i końcowej objętości skurczowej.W tym badaniu obrazy w trybie B pozwoliły na prześledzenie wewnętrznej ściany komory w skurczu i rozkurczu oraz uzyskanie danych wymiarowych, takich jak wymiary komory i ściany. Uzyskano również dane funkcjonalne, takie jak częstość akcji serca, objętość wyrzutowa i pojemność minutowa serca, a także parametry funkcji skurczowej komór, w tym zmiana obszaru frakcyjnego i frakcja wyrzutowa. Pomiary na poziomie zastawki przedsionkowo-komorowej za pomocą kolorowych obrazów w trybie Dopplera dostarczyły również prędkości dopływu i odpływu krwi w komorach.Na podstawie obrazu dopplerowskiego fali tętna wygenerowano wartość tętna, śledząc trzy kolejne szczyty przepływu w aorcie. Najważniejszą rzeczą jest prawidłowe ustawienie platformy ultradźwiękowej i ryb w celu dokładnego obrazowania i zminimalizowania narażenia ryb na trikainę. Dodatkowe metody wspomagające tę procedurę obejmują elektrokardiogram ryb do szybkiego wykrywania dysfunkcji serca, takich jak zaburzenia rytmu serca, lub metody histologiczne do oceny struktury tkanki serca lub śmierci komórki.Techniki te umożliwiają ocenę funkcji serca danio pręgowanego i ustalenie fenotypu serca w modelach chorób serca danio pręgowanego. Pozwala również na testowanie nowych leków, badanie uszkodzeń serca i zdolności regeneracyjnych. Tricaine MS-222 działa drażniąco na skórę, oczy i drogi oddechowe.Podczas przygotowywania roztworu tricainy sprzęt ochronny powinien obejmować maskę przeciwpyłową, osłonę oczu i rękawice.

high-frequency-ultrasound-echocardiography-to-assess-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film pokazuje, jak wykonać pomiary elektrokardiografii (EKG lub EKG), testu, który mierzy aktywność elektryczną serca, u danio pręgowanego.

Elektrokardiografia danio pręgowanego (EKG): minimalnie inwazyjny test do oceny czynności serca

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Wykorzystanie danio pręgowanego do badań sercowo-naczyniowych rozszerza się w kierunku badań nad dorosłymi sercami. W przypadku tych zastosowań szybka i prosta izolacja tkanek serca ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zmian pośmiertnych i uzyskania odpowiedniej liczby próbek. Tutaj opisujemy szybką i powtarzalną metodę preparowania serc dorosłych danio pręgowanego.

Odzyskiwanie serc dorosłych ryb danio pręgowanego do zastosowań o wysokiej przepustowości

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy niezawodną, minimalnie inwazyjną i opłacalną metodę rejestrowania i interpretacji elektrokardiogramów u żywych, znieczulonych dorosłych ryb pręgowanych.

Elektrokardiografia powierzchniowa in vivo u dorosłych danio pręgowanych

Celem tego protokołu jest szczegółowe opracowanie nowatorskiej metody oceny segmentalnej funkcji serca u embrionalnych ryb danio pręgowanych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.

Analiza przemieszczenia mechanicznej deformacji mięśnia sercowego (DIAMOND) ujawnia segmentalną heterogeniczność funkcji serca u embrionalnego danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje obrazowanie za pomocą arkusza świetlnego do badania funkcji skurczu serca u larw danio pręgowanego i uzyskania wglądu w mechanikę serca poprzez śledzenie komórek i interaktywną analizę.

Obrazowanie 4D Light-sheet skurczu serca danio pręgowanego

Celem badania jest opracowanie technologii do pomiaru tętna bez znieczulenia u ruszających się rybek zebrafish. Nasze podejście łączy obrazowanie w podczerwieni krótkofalowej z opartym na maszynowym uczeniu śledzeniem tętna. Jest to technika nieinwazyjna, bez oznaczeń i przyjazna dla użytkownika, która nadaje się do szerokiej gamy badań na modelu rybki zebrafish.

Bezanestezjologiczne pomiary tętna u swobodnie poruszających się danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj nieinwazyjną echokardiografię wysokiej częstotliwości do oceny morfologii i funkcji serca dorosłych danio pręgowanego. Metoda umożliwia wizualizację parametrów kardiologicznych oraz badań chorób serca i przesiewowych badań leków.

Echokardiografia ultradźwiękowa wysokiej częstotliwości w celu oceny czynności serca danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów