Name: Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji białkowych in situ w linii zarodkowej C. elegans. Technika ta ujawnia przestrzenne i czasowe wzorce interakcji, dostarczając cennych informacji o regulacji rozwoju nicienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niektóre szczepy nicieni użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center finansowane przez NIH (P40OD010440). Mikroskopię konfokalną przeprowadzono w Laboratorium Badawczym BioSpektroskopii Uniwersytetu Montana, które działało przy wsparciu NIH Awards P20GM103546 i S10OD021806. Praca ta była częściowo wspierana przez grant NIH GM109053 dla E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 dla X.W. oraz nagrodę Montana Academy of Sciences dla X.W. Fundatorzy nie byli zaangażowani w projektowanie badania ani pisanie raportu. Dziękujemy panu Ellenbeckerowi za dyskusję.

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podczas badania IPP w linii zarodkowej C. elegans , wyższa rozdzielczość oferowana przez PLA w porównaniu z barwieniem koimmunologicznym umożliwia wizualizację i kwantyfikację miejsc, w których zachodzą interakcje w linii zarodkowej. Wcześniej informowano, że DLC-1 bezpośrednio oddziałuje z OMA-1 za pomocą testu ściągającego GST in vitro 26; Jednak ta interakcja nie została odzyskana przez ekstrakcję in vivo. Fluorescencyjne barwienie koimmunologiczne 3xFLAG::D LC-1; Linie zarodk...

Szacuje się, że ponad 80% białek wchodzi w interakcje z innymi cząsteczkami1, co podkreśla, jak ważne są IPP dla realizacji określonych funkcji biologicznych w komórce2. Niektóre białka funkcjonują jako węzły ułatwiające tworzenie większych kompleksów, które są niezbędne do przetrwania komórki1. Centra te pośredniczą w wielu IPP i pomagają organizować białka w sieć, która ułatwia określone funkcje w komórce3. Na tworzenie kompleksów białkowych ma również wpływ kontekst biologiczny, taki jak obecność lub brak określonych oddziałujących partnerów4, zdarzenia sygnalizacji komórkowej i etap rozwoju komórki.
C. elegans jest powszechnie używany jako organizm modelowy do różnych badań, w tym do rozwoju. Prosta anatomia tego zwierzęcia składa się z kilku narządów, w tym gonady, jelita i przezroczystego naskórka, co ułatwia analizę rozwoju robaków. Linia zarodkowa znajdująca się w gonadzie jest doskonałym narzędziem do badania, w jaki sposób komórki macierzyste linii zarodkowej dojrzewają do gamet5, które rozwijają się w zarodki, a ostatecznie w następne pokolenie potomstwa. Dystalny obszar wierzchołkowy linii zarodkowej zawiera pulę samoodnawiających się komórek macierzystych (ryc. 1). Gdy komórki macierzyste opuszczają niszę, przechodzą do pachytenu mejotycznego i ostatecznie przekształcają się w oocyty w stadium młodego dorosłego (ryc. 1). Ten program rozwoju w linii zarodkowej jest ściśle regulowany przez różne mechanizmy, w tym potranskrypcyjną sieć regulacyjną ułatwioną przez białka wiążące RNA (RBP)6. IPP są ważne dla tej działalności regulacyjnej, ponieważ RBP łączą się z innymi kofaktorami, aby pełnić swoje funkcje.
Istnieje kilka podejść, które mogą być wykorzystane do sondowania PPI w robaku, ale każde z nich ma unikalne ograniczenia. Immunoprecypitacja in vivo (IP) może być stosowana do izolowania kompleksów białkowo-białkowych z całych ekstraktów z robaków; Podejście to nie wskazuje jednak, gdzie w robaku występuje PPI. Ponadto kompleksy białkowe, które są przejściowe i tworzą się tylko na określonym etapie rozwoju lub w ograniczonej liczbie komórek, mogą być trudne do odzyskania przez koimmunoprecypitację. Wreszcie, eksperymenty z własnością intelektualną muszą rozwiązać problemy związane z reasortacją kompleksów białkowych po lizie i niespecyficznym zatrzymywaniem białek na matrycy powinowactwa.
Alternatywnymi metodami wykrywania in situ IPP są koimmunostaining, transfer energii rezonansu Förstera (FRET) i dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencyjna (BiFC). Koimmunologiczne barwienie polega na jednoczesnym wykryciu dwóch interesujących białek w utrwalonej tkance robaka i pomiarze stopnia kolokalizacji sygnału. Zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej, która oferuje większą szczegółowość niż standardowa mikroskopia7, pomaga bardziej rygorystycznie testować kolokalizację białek poza ograniczoną dyfrakcją barierą 200-300 nm8. Jednak współbarwienie immunologiczne przy użyciu zarówno mikroskopii konwencjonalnej, jak i superrozdzielczej działa najlepiej w przypadku białek o dobrze zdefiniowanych wzorcach lokalizacji. W przeciwieństwie do tego, staje się znacznie mniej pouczający dla rozproszonych partnerów wchodzących w interakcje. Pomiar kolokalizacji sygnałów na podstawie nakładania się nie dostarcza dokładnych informacji o tym, czy białka są ze sobą złożone9,10.
Ponadto, koimmunoprecypitacja i ko-barwienie immunologiczne kompleksów białko-białko nie są ilościowe, co utrudnia określenie, czy takie interakcje są znaczące. FRET i BiFC są technikami opartymi na fluorescencji. FRET polega na znakowaniu interesujących białek białkami fluorescencyjnymi (FP), które mają zakładkę spektralną, przy której energia z jednego FP (donora) jest przekazywana do innego FP (akceptora)11. Ten nieradiacyjny transfer energii powoduje fluorescencję akceptora FP, którą można wykryć na odpowiedniej długości fali emisji. BiFC opiera się na rekonstytucji białka fluorescencyjnego in vivo. Polega to na rozszczepieniu GFP na dwa komplementarne fragmenty, takie jak helisy 1-10 i helisa 1112, które są następnie łączone z dwoma interesującymi białkami. Jeśli te dwa białka wchodzą w interakcje, komplementarne fragmenty GFP zbliżają się do siebie na tyle, aby się fałdować i składać, ponownie tworząc fluorofor GFP. Odtworzona GFP jest następnie bezpośrednio obserwowana jako fluorescencja i wskazuje, gdzie wystąpił PPI.
W związku z tym, zarówno FRET jak i BiFC zależą od dużych znaczników fluorescencyjnych, które mogą zakłócać funkcję oznaczonego białka. Ponadto FRET i BiFC wymagają obfitej i porównywalnej ekspresji znakowanych białek w celu uzyskania dokładnych danych. FRET może nie być odpowiedni do eksperymentów, w których jeden partner przewyższa drugiego, co może prowadzić do wysokiego tła13. Należy również unikać nadekspresji w eksperymentach BiFC, ponieważ może to wywołać niespecyficzne assembly14, co skutkuje zwiększonym tłem. Obie techniki wymagają optymalizacji warunków ekspresji i obrazowania znakowanych białek, co może wydłużyć czas potrzebny do zakończenia eksperymentów.
Test ligacji zbliżeniowej (PLA) jest alternatywnym podejściem, które może rozwiązać problemy z ograniczeniami wyżej wymienionych technik. PLA wykorzystuje przeciwciała pierwotne, które rozpoznają interesujące białka (lub ich znaczniki). Te pierwszorzędowe przeciwciała są następnie wiązane przez przeciwciała drugorzędowe zawierające sondy oligonukleotydowe, które mogą hybrydyzować ze sobą, gdy znajdują się w odległości 40 nm (lub krótszej)15. Powstałe zhybrydyzowane DNA jest amplifikowane w reakcji PCR, która jest wykrywana przez sondy uzupełniające DNA. W ten sposób powstają ogniska, które są wizualizowane przez mikroskop. Technologia ta może wykrywać IPP in situ w złożonych tkankach (tj. gonadzie robaka), która jest zorganizowana jako linia montażowa zawierająca komórki na różnych etapach rozwoju i różnicowania. Dzięki PLA IPP mogą być bezpośrednio wizualizowane w stałej gonadzie robaka, co jest korzystne dla zbadania, czy IPP występują na określonym etapie rozwoju. PLA oferuje większą rozdzielczość IPP w przeciwieństwie do testów opartych na kolokalizacji, które są idealne do wykonywania precyzyjnych pomiarów. Jeśli zostanie zastosowana, mikroskopia superrozdzielcza może potencjalnie dostarczyć dokładniejszych szczegółów na temat lokalizacji ognisk PLA w komórce. Kolejną zaletą jest to, że ogniska powstające w reakcjach PLA mogą być zliczane przez proces analizy oparty na ImageJ, co czyni tę technikę ilościową.
Rodzina lekkich łańcuchów dyneinowych LC8 została najpierw opisana jako podjednostka kompleksu motorycznego dynein16 i przypuszczalnie służyła jako adapter ładunkowy. Od czasu pierwszego odkrycia, LC8 został znaleziony w wielu kompleksach białkowych oprócz kompleksu motorycznego dyneiny17,18,19,20. Skanowanie w poszukiwaniu sekwencji białek, które zawierają motyw interakcji LC819 sugeruje, że LC8 może mieć wiele interakcji z szeroką gamą różnych białek17,18,19,20,21,22. W rezultacie, białka z rodziny LC8 są obecnie uważane za węzły, które pomagają promować tworzenie większych kompleksów białkowych19,22, takich jak zespoły wewnętrznie nieuporządkowanych białek21.
Jedno białko z rodziny LC8 C. elegans, łańcuch lekki dyneiny-1 (DLC-1), ulega szerokiej ekspresji w wielu tkankach i nie jest wzbogacone w specyficzne struktury subkomórkowe23,24. W związku z tym identyfikacja biologicznie istotnych partnerów in vivo DLC-1 w C. elegans jest trudna z kilku powodów: 1) koimmunoprecypitacja nie wskazuje źródła tkanki, w której zachodzi interakcja; 2) ograniczona ekspresja poszczególnych partnerów lub przejściowe interakcje mogą utrudniać zdolność do wykrycia interakcji za pomocą koimmunoprecypitacji; oraz 3) rozproszona dystrybucja DLC-1 prowadzi do niespecyficznego nakładania się na potencjalne białka partnerskie przez koimmunobarwienie. Opierając się na tych wyzwaniach, PLA jest idealnym podejściem do testowania interakcji in vivo z DLC-1.
Wcześniej doniesiono, że DLC-1 bezpośrednio oddziałuje i służy jako kofaktor dla białek wiążących RNA (RBP) FBF-223 i GLD-125. Nasza praca potwierdza model DLC-1 służącego jako białko piasty i sugeruje, że DLC-1 ułatwia sieć interakcji, która wykracza poza dynein19,22. Korzystając z testu GST pulldown, zidentyfikowano nowy RBP wchodzący w interakcję z DLC-1 o nazwie OMA-126. OMA-1 jest ważny dla wzrostu oocytów i dojrzewania mejotycznego27 i działa w połączeniu z wieloma represorami i aktywatorami translacyjnymi28. Podczas gdy FBF-2 i GLD-1 ulegają ekspresji odpowiednio w komórkach macierzystych i mejotycznych regionach pachytenu, OMA-1 ulega dyfuzyjnej ekspresji w linii zarodkowej od pachytenu mejotycznego przez oocyty27 (Figura 1). Sugeruje to, że DLC-1 tworzy kompleksy z RBP w różnych regionach gonady. Stwierdzono również, że bezpośrednia interakcja między DLC-1 i OMA-1 obserwowana in vitro nie jest odzyskiwana przez IP in vivo. PLA został z powodzeniem wykorzystany jako alternatywne podejście do dalszych badań nad tą interakcją w linii zarodkowej C. elegans, a wyniki sugerują, że PLA może być wykorzystany do badania wielu innych IPP w robaku.

<table><tbody><tr><td>16% roztwór paraformaldehydu</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td>używany do wytwarzania 4% roztworu roboczego</td></tr><tr><td>1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Przygotuj zapas roboczy 1M</td></tr><tr><td>1x M9</td><td>różne</td><td></td><td>różne przygotowane jako 10x zapas używany przy 1x; patrz wormbook.org dla protokołu</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>różne</td><td>różne</td><td>zobacz wormbook.org do protokołu</td></tr><tr><td>26.5 Igła o rozmiarze 26.5</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>Igły używane do preparacji</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Lampire</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>05-529C</td><td>50ml Dębowa rurka wirówkowa grzbietowa używana do synchronizacji</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>PolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe do zamrażania próbek</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm, nr 1</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe do uszczelniania szkiełek</td><td>Globe</td><td>Scientific 1404-15</td><td>22x22mm, nr 1.5</td></tr><tr><td>DAPI Podłoże montażowe do immunofluorescencji</td><td>wektor</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>DUO82029 Duolink 1x Ligase, Wchodzi w skład zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony DUO92008</td></tr><tr><td>Czerwony bufor wzmacniający</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Jest częścią odczynników do wykrywania in situ Duolink Czerwony zestaw buforu</td></tr><tr><td>ligacyjnego</td><td>DUO92008 Aldrich DUO82009</td><td></td><td>Duolink 5x bufor ligacyjny, jest częścią zestawu odczynników do wykrywania in situ Duolink Red DUO92008</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Rozcieńczalnik przeciwciał Duolink, w zestawie z DUO92004 i DUO92002, Uwaga: 1x roztwór PBS / 1% BSA może być również użyty jako substytut do rozcieńczenia przeciwciała.</td></tr><tr><td>Rozwiązanie blokujące</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>rozwiązanie blokujące Duolink, w zestawie DUO92004 i DUO92002</td></tr><tr><td>medium montażowe do PLA Medium montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>Duolink In Situ z sondą DAPI</td></tr><tr><td>MINUS</td> Sonda <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situ Anti-Mouse Sonda MINUS</td></tr><tr><td>PLUS</td><td>Sonda Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situ Anti-Rabbit PLUS</td></tr><tr><td>Bufor do płukania A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink In Situ wash Buffer A</td></tr><tr><td>Wash Buffer B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B</td></tr><tr><td>Polimeraza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink Polymerase, Wchodzi w skład odczynników do wykrywania Duolink In Situ Czerwony zestaw DUO92008</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G kamera, mikroskop DM5500B</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>Użyj w 1:500</td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>Użyj w 1:200</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>ACROS Organics</td><td>187870100</td><td>Przygotuj zapas roboczy o pojemności 250 mM</td></tr><tr><td>Metanol Fisher</td><td>Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Stosować w skali 1:1000 do immunofluorescencji i PLA, zalecany wstępny blok z normalną kozią surowicą Lakier</td></tr> do <tr><td>paznokci</td><td>L.A. kolory</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)</td> <td>różne</td><td></td><td>Zobacz wormbook.org dla protokół</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowa pipeta Pasteura</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>Przygotowany jako 0,1% roztwór podstawowy w wodzie, przechowywany w temperaturze -20C i rozcieńczony w stosunku 1:100 w wodzie do powlekania szkiełek</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>średnica 60 mm</td></tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>Stosować w skali 1:200 dla immunofluorescencji, 1:4000 dla prowadnic PLA</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>Trzykwadratowe autoklawowalne prowadnice 14x14mm z prętami są zamawiane na zamówienie przez Fisher Scientific. Poli-L-lizyna dodawana do szkiełek w laboratorium</td></tr><tr><td>Roztwór podchlorynu sodu</td> Chusteczki zadaniowe <td>Fisher Scientific</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>Chusteczki robocze 4,4x8,4 cala</td></tr><tr><td>Tace (242x241x20mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>240845</td><td>Służy do produkcji komory wilgotnej</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Ultraczysta woda uzyskana z Milli-Q Integral Water Purification System</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa Szczep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy nicieni użyte w tym badaniu (oba dostępne na życzenie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; UNC-119(ED3) III; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Kod źródłowy 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td>UMT 422</td><td></td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Odniesienie: to badanie</td></tr></tbody></table>

wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej c. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Zrozumienie, kiedy i gdzie zachodzą interakcje białko-białko (PPI), jest kluczowe dla zrozumienia funkcji białek w komórce i tego, jak wpływają one na szersze procesy, takie jak rozwój. Linia zarodkowa Caenorhabditis elegans jest doskonałym systemem modelowym do badania IPP, które są związane z regulacją komórek macierzystych, mejozą i rozwojem. Istnieje wiele dobrze opracowanych technik, które pozwalają na znakowanie interesujących białek w celu rozpoznania przez standardowe przeciwciała, co sprawia, że system ten jest korzystny dla reakcji ligacji zbliżeniowej (PLA). W rezultacie, PLA jest w stanie pokazać, gdzie IPP występują w sposób przestrzenny i czasowy w liniach zarodkowych skuteczniej niż alternatywne podejścia. Opisano tutaj protokół zastosowania i kwantyfikacji tej technologii do badania IPP w linii zarodkowej C. elegans.

Podwójne barwienie immunocytochemiczne linii zarodkowych 3xFLAG::DLC-1; GFP oraz 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko FLAG i GFP ujawniło wzorce ich ekspresji w linii zarodkowej (Rycina 3Aii-iii,3Bii-iii). Podczas gdy GFP ulegało ekspresji w całej linii zarodkowej (Rycina 3Aiii), ekspresja OMA-1::GFP była ograniczona do późnego pachytenu i oocytów (<strong class="xfig"...

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Test ligacji zbliżeniowej pozwala użytkownikom wykrywać interakcje białko-białko in situ, ujawniając przestrzenne i czasowe wzorce interakcji. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące regulacji rozwoju C.elegans. Technika ta oferuje porównywalną czułość wykrywania interakcji białko-białko bez złożoności innych technik, takich jak FRET i BiFC.Osoby, które nigdy nie przeprowadzały sekcji robaków w celu uwolnienia gonad, mogą zmagać się z tym krokiem. Poćwicz preparowanie robaków i użyj ich do immunofluorescencji, aby udoskonalić techniki obsługi i sekcji, zanim przejdziesz do PLA. Na początek zbierz od 30 do 40 młodych dorosłych robaków do szklanego naczynia zawierającego 500 mikrolitrów 1x M9 i lewamizolu.Po zebraniu robaków ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami. Dodaj świeże 500 mikrolitrów 1x M9 i lewamizolu, a następnie za pomocą pipety delikatnie nabierz i dozuj pożywkę do wypłukania robaków. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć większość nośników.Powtórz pranie dwa do trzech razy. Po umyciu pozostaw robaki w około 100 mikrolitrach podłoża na nie dłużej niż osiem minut. Za pomocą szklanej lub polietylenowej pipety przenieś robaki do szkiełka mikroskopowego o wymiarach 25 milimetrów na 75 milimetrów pokrytego 001% poli-L-lizyną.Usuń nadmiar podłoża tak, aby na szkiełku pozostało około 15 mikrolitrów podłoża. Usunięcie nadmiaru bufora ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wypreparowane robaki i gonady będą przylegać do szkiełka. Pod mikroskopem preparacyjnym, z dwiema igłami o rozmiarze 26 1/2, umieść jedną igłę na drugiej, tak aby końce utworzyły nożyczki.Używając igieł zorientowanych w ten sposób, odetnij robaki za gardłem, aby uwolnić linie zarodkowe. Wytnij wszystkie robaki w ciągu pięciu minut. Po wypreparowaniu wszystkich robaków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 40 milimetrów na szkiełku tak, aby było prostopadłe do szkiełka.Końce szkiełka nakrywkowego powinny zwisać ze szkiełka. Zamrozić szkiełka na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym utrzymywanym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Delikatnie umieść schłodzony ołówek na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec poluzowaniu się szkiełka nakrywkowego z powodu rozszerzania się lodu.Gdy będzie gotowy do utrwalenia, strzepnij szkiełka nakrywkowe ołówkiem i natychmiast zanurz szkiełko w słoiku zawierającym świeży, lodowaty metanol na jedną minutę. Następnie delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka otaczającego próbkę i nałóż 150 mikrolitrów utrwalacza formaldehydu w temperaturze pokojowej, aby utrwalić przez pięć minut. Przyłóż szkiełko do ręcznika papierowego pod prostopadłym kątem 90 stopni, aby utrwalacz spłynął ze szkiełka i wchłonął się w ręcznik papierowy.Zablokuj szkiełka dwukrotnie na 15 minut w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin z 50 mililitrami PBT/BSA. Następnie zablokuj szkiełka roztworem PBT/BSA zawierającym 10% normalnej surowicy koziej. Delikatnie przetrzyj krawędzie otaczające szkiełko i nałóż 100 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko.I delikatnie porusz szkiełkiem, aby pomóc rozprowadzić roztwór. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby roztwór spłynął z szkiełka, i delikatnie przetrzyj krawędzie.Aby zablokować szkiełka, nałóż jedną kroplę odczynnika blokującego na przestrzeń o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Umieść szkiełka na ręczniku papierowym, aby odczynnik blokujący spłynął ze szkiełka, i delikatnie wytrzyj krawędzie.Użyj rozcieńczalnika przeciwciał, aby rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Nałóż 40 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na przestrzeń 14 na 14 milimetrów na szkiełka. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Rano umyj szkiełka dwa razy przez pięć minut, każdy z 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Umieść szkiełka na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie.Przygotuj 40-mikrolitrowy roztwór zawierający sondy plus i minus. Dodaj roztwór do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Umyj szkiełka dwa razy przez pięć minut, każde z 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Rozcieńczyć bufor do podwiązania od jednego do pięciu ultraczystą wodą.Użyj tego buforu, aby rozcieńczyć ligazę w stosunku 1 do 40, aby przygotować zapas roboczy roztworu do ligacji. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął po bokach i delikatnie wytrzyj krawędzie. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu do podwiązania do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów.Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu i wysuszeniu szkiełek zgodnie z wcześniejszym opisem, do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wzmacniającego, chronionego przed światłem. Inkubuj szkiełka w wilgotnej, ciemnej komorze przez godzinę i 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Umyć szkiełka dwa razy przez 10 minut każdy 50 mililitrami 1x buforu do płukania B i umyć szkiełka jeden raz przez jedną minutę 50 mililitrami 01x buforu do płukania B. Po wysuszeniu pokrytego żywicą epoksydową obwodu szkiełka, dodaj 10 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej próbki i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu, co pozwala na rozprowadzenie się medium montażowego. Pomaluj krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i szkiełko. Unikaj przesuwania szkiełka nakrywkowego.Pozwól lakierowi do paznokci stwardnieć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Jednoczesne barwienie linii zarodkowych przeciwciałami FLAG i GFP ujawniło ich wzorzec ekspresji w linii zarodkowej. Podczas gdy GFP ulegał ekspresji w całej linii zarodkowej, ekspresja OMA-1:GFP była ograniczona do późnego pachytenu i oocytów.Barwienie immunologiczne FLAG pokazuje, że 3xFLAG:DLC-1 ulegał ekspresji w całej linii zarodkowej w obu szczepach. Obszar zainteresowania do oznaczania ilościowego PLA w linii zarodkowej obejmował późny pachyten przez oocyty we wszystkich liniach zarodkowych. Jest to obszar ekspresji OMA-1.Linie zarodkowe 3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP wydawały się mieć większą ilość ognisk PLA w tym regionie w porównaniu do linii zarodkowych 3xFLAG:DLC-1, GFP. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość wody, aby podnieść wilgotność w komorze. Upewnij się również, że szkiełka są wypoziomowane wewnątrz komory, aby zapobiec spływaniu odczynników.Po teście ligacji zbliżeniowej, wytłaczane gonady można zobrazować pod mikroskopem konfokalnym i określić ilościowo za pomocą przepływu pracy Fiji, ImageJ. Ta kwantyfikacja może pomóc w ustaleniu, czy interakcja jest statystycznie istotna. PLA pozwolił nam ocenić interakcje in situ między krytycznymi regulatorami rozwoju linii zarodkowej nicieni.

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji białkowych in situ w linii zarodkowej C. elegans. Technika ta ujawnia przestrzenne i czasowe wzorce interakcji, dostarczając cennych informacji o regulacji rozwoju nicienia.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Przeglądaj więcej filmów