Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Test ligacji zbliżeniowej pozwala użytkownikom wykrywać interakcje białko-białko in situ, ujawniając przestrzenne i czasowe wzorce interakcji. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące regulacji rozwoju C.elegans. Technika ta oferuje porównywalną czułość wykrywania interakcji białko-białko bez złożoności innych technik, takich jak FRET i BiFC.

Osoby, które nigdy nie przeprowadzały sekcji robaków w celu uwolnienia gonad, mogą zmagać się z tym krokiem. Poćwicz preparowanie robaków i użyj ich do immunofluorescencji, aby udoskonalić techniki obsługi i sekcji, zanim przejdziesz do PLA. Na początek zbierz od 30 do 40 młodych dorosłych robaków do szklanego naczynia zawierającego 500 mikrolitrów 1x M9 i lewamizolu.

Po zebraniu robaków ostrożnie usuń i wyrzuć większość pożywki, aby usunąć bakterie, które są przenoszone wraz z robakami. Dodaj świeże 500 mikrolitrów 1x M9 i lewamizolu, a następnie za pomocą pipety delikatnie nabierz i dozuj pożywkę do wypłukania robaków. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć większość nośników.

Powtórz pranie dwa do trzech razy. Po umyciu pozostaw robaki w około 100 mikrolitrach podłoża na nie dłużej niż osiem minut. Za pomocą szklanej lub polietylenowej pipety przenieś robaki do szkiełka mikroskopowego o wymiarach 25 milimetrów na 75 milimetrów pokrytego 001% poli-L-lizyną.

Usuń nadmiar podłoża tak, aby na szkiełku pozostało około 15 mikrolitrów podłoża. Usunięcie nadmiaru bufora ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wypreparowane robaki i gonady będą przylegać do szkiełka. Pod mikroskopem preparacyjnym, z dwiema igłami o rozmiarze 26 1/2, umieść jedną igłę na drugiej, tak aby końce utworzyły nożyczki.

Używając igieł zorientowanych w ten sposób, odetnij robaki za gardłem, aby uwolnić linie zarodkowe. Wytnij wszystkie robaki w ciągu pięciu minut. Po wypreparowaniu wszystkich robaków delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 milimetry na 40 milimetrów na szkiełku tak, aby było prostopadłe do szkiełka.

Końce szkiełka nakrywkowego powinny zwisać ze szkiełka. Zamrozić szkiełka na wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym utrzymywanym na suchym lodzie przez co najmniej 20 minut. Delikatnie umieść schłodzony ołówek na szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec poluzowaniu się szkiełka nakrywkowego z powodu rozszerzania się lodu.

Gdy będzie gotowy do utrwalenia, strzepnij szkiełka nakrywkowe ołówkiem i natychmiast zanurz szkiełko w słoiku zawierającym świeży, lodowaty metanol na jedną minutę. Następnie delikatnie przetrzyj krawędzie szkiełka otaczającego próbkę i nałóż 150 mikrolitrów utrwalacza formaldehydu w temperaturze pokojowej, aby utrwalić przez pięć minut. Przyłóż szkiełko do ręcznika papierowego pod prostopadłym kątem 90 stopni, aby utrwalacz spłynął ze szkiełka i wchłonął się w ręcznik papierowy.

Zablokuj szkiełka dwukrotnie na 15 minut w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin z 50 mililitrami PBT/BSA. Następnie zablokuj szkiełka roztworem PBT/BSA zawierającym 10% normalnej surowicy koziej. Delikatnie przetrzyj krawędzie otaczające szkiełko i nałóż 100 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko.

I delikatnie porusz szkiełkiem, aby pomóc rozprowadzić roztwór. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby roztwór spłynął z szkiełka, i delikatnie przetrzyj krawędzie.

Aby zablokować szkiełka, nałóż jedną kroplę odczynnika blokującego na przestrzeń o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze. Umieść szkiełka na ręczniku papierowym, aby odczynnik blokujący spłynął ze szkiełka, i delikatnie wytrzyj krawędzie.

Użyj rozcieńczalnika przeciwciał, aby rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Nałóż 40 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na przestrzeń 14 na 14 milimetrów na szkiełka. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Rano umyj szkiełka dwa razy przez pięć minut, każdy z 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Umieść szkiełka na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął ze szkiełka i delikatnie wytrzyj krawędzie.

Przygotuj 40-mikrolitrowy roztwór zawierający sondy plus i minus. Dodaj roztwór do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umyj szkiełka dwa razy przez pięć minut, każde z 50 mililitrami 1x buforu do mycia A w temperaturze pokojowej w słoiku Coplin. Ustaw słoik Coplin na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 60 obr./min. Rozcieńczyć bufor do podwiązania od jednego do pięciu ultraczystą wodą.

Użyj tego buforu, aby rozcieńczyć ligazę w stosunku 1 do 40, aby przygotować zapas roboczy roztworu do ligacji. Umieść szkiełko na ręczniku papierowym, aby bufor do mycia spłynął po bokach i delikatnie wytrzyj krawędzie. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu do podwiązania do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów.

Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu i wysuszeniu szkiełek zgodnie z wcześniejszym opisem, do każdej przestrzeni o wymiarach 14 na 14 milimetrów dodać 40 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu wzmacniającego, chronionego przed światłem. Inkubuj szkiełka w wilgotnej, ciemnej komorze przez godzinę i 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umyć szkiełka dwa razy przez 10 minut każdy 50 mililitrami 1x buforu do płukania B i umyć szkiełka jeden raz przez jedną minutę 50 mililitrami 01x buforu do płukania B. Po wysuszeniu pokrytego żywicą epoksydową obwodu szkiełka, dodaj 10 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej próbki i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu, co pozwala na rozprowadzenie się medium montażowego. Pomaluj krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i szkiełko. Unikaj przesuwania szkiełka nakrywkowego.

Pozwól lakierowi do paznokci stwardnieć przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Jednoczesne barwienie linii zarodkowych przeciwciałami FLAG i GFP ujawniło ich wzorzec ekspresji w linii zarodkowej. Podczas gdy GFP ulegał ekspresji w całej linii zarodkowej, ekspresja OMA-1:GFP była ograniczona do późnego pachytenu i oocytów.

Barwienie immunologiczne FLAG pokazuje, że 3xFLAG:DLC-1 ulegał ekspresji w całej linii zarodkowej w obu szczepach. Obszar zainteresowania do oznaczania ilościowego PLA w linii zarodkowej obejmował późny pachyten przez oocyty we wszystkich liniach zarodkowych. Jest to obszar ekspresji OMA-1.

Linie zarodkowe 3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP wydawały się mieć większą ilość ognisk PLA w tym regionie w porównaniu do linii zarodkowych 3xFLAG:DLC-1, GFP. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość wody, aby podnieść wilgotność w komorze. Upewnij się również, że szkiełka są wypoziomowane wewnątrz komory, aby zapobiec spływaniu odczynników.

Po teście ligacji zbliżeniowej, wytłaczane gonady można zobrazować pod mikroskopem konfokalnym i określić ilościowo za pomocą przepływu pracy Fiji, ImageJ. Ta kwantyfikacja może pomóc w ustaleniu, czy interakcja jest statystycznie istotna. PLA pozwolił nam ocenić interakcje in situ między krytycznymi regulatorami rozwoju linii zarodkowej nicieni.