Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo
June 11th, 2020
Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.
Nasz protokół zapewnia skuteczne i powtarzalne podejście do oceny i ilościowego określania zdarzeń fagocytarnych w hemocytach. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy określić ilościowo zdarzenia fagocytarne w obrębie poszczególnych hemocytów, co pozwala nam wykryć różnice w procesach fagocytarnych między genotypami u poszczególnych muszek. Wykonywanie sekcji może być trudne, więc wykonując tę technikę po raz pierwszy, ćwicz sekcje tak często, jak to możliwe, przed przeprowadzeniem pełnej procedury.
Zacznij od przygotowania szklanych igieł do wstrzykiwań. Napełnij jednomilimetrową strzykawkę olejem mineralnym i przymocuj igłę podskórną o rozmiarze 30 dostarczonym z nano-wstrzykiwaczem. Włóż igłę o rozmiarze 30 do końca ciągniętej igły kapilarnej i napełnij ją olejem mineralnym.
Powoli wyjmij igłę o rozmiarze 30, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Zdejmij tuleję zaciskową i umieść uszczelniony O-ring wgłębieniem skierowanym do góry. Umieść większy O-ring na metalowym tłoku, a następnie ponownie zamocuj tuleję zaciskową bez dokręcania.
Włóż metalowy tłok do końca szklanej igły wypełnionej olejem i delikatnie dociśnij go w dół, wkładając go do większego O-ringu. Następnie dokręć tuleję zaciskową, aż będzie bezpieczna. Po napełnieniu igły cząstkami fluorowymi lub wrażliwymi na pH, wstrzyknąć muchy w płytkę mostkowo-opłucnową klatki piersiowej.
Wstrzyknięcie jest udane, jeśli zielony barwnik dostaje się do muchy. Umieścić wstrzyknięte muchy w nowej fiolce z pokarmem, zwracając uwagę na czas wstrzyknięcia pierwszej i ostatniej muchy. Położyć fiolkę na boku, aż wszystkie muchy wyzdrowieją, aby zapobiec utknięciu ich w jedzeniu.
Ustaw muchę brzuszną stroną do góry pod preparacyjnym mikroskopem stereoskopowym. Następnie włóż szpilkę do owadów w klatkę piersiową, a drugą przez najbardziej tylny koniec brzucha w pobliżu narządów płciowych. Gdy wszystkie muchy zostaną przypięte, użyj pipety transferowej, aby dodać wystarczającą ilość pożywki do preparacji, aby pokryć muchy.
Usuń głowę nożyczkami do skórek i wykonaj poziome nacięcie bezpośrednio nad tylną szpilką w jamie brzusznej, a następnie drugie na najbardziej wysuniętym końcu brzucha. Wykonaj pionowe nacięcie łączące dwa poziome nacięcia, które otworzą jamę brzuszną. Użyj kleszczy, aby usunąć narządy wewnętrzne i tkanki, upewniając się, że omijasz naczynie grzbietowe.
W razie potrzeby użyj dodatkowych szpilek, aby zabezpieczyć odcięte końce naskórka. Następnie usuń klatkę piersiową nożyczkami do skórek. Wyrzuć pożywkę preparacyjną i zastąp ją jednym mililitrem 4% PFA, chroniąc preparacje tak bardzo, jak to możliwe.
Utrwal sekcje na 15 minut w temperaturze pokojowej, kołysząc się z prędkością 20 obr./min. Następnie usuń utrwalacz i dodaj jeden mililitr 1X PBST. W razie potrzeby wybarwić sekcje przeciwciałami.
Po zamontowaniu skórek na szkiełku mikroskopowym użyj kleszczyków, aby ustawić je brzuszną stroną do góry i upewnij się, że naczynie grzbietowe jest widoczne. Młode i starsze muchy oceniano pod kątem specyficznej dla wieku zdolności do przeprowadzania fagocytozy poprzez obrazowanie fluorescencyjne hemocytów wzdłuż naczynia grzbietowego. Zastosowano przeciwciało przeciwko perikardynie, aby upewnić się, że policzone zostały tylko komórki wzdłuż naczynia grzbietowego.
Ponieważ znakowane fluorescencyjnie cząstki E. coli mają długość jednego mikrometra, a hemocyty mają średnicę 10 mikrometrów, policzono tylko zdarzenia fluorescencyjne o średnicy 10 mikrometrów wyśrodkowane na jądrze DAPI-dodatnim. Oprogramowanie ImageJ zostało następnie wykorzystane do ilościowego określenia zdarzeń. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wyobrazić sobie, że mucha została faktycznie wstrzyknięta i pamiętać, że czas ma kluczowe znaczenie.
Terminowe wykonywanie iniekcji i sekcji pomoże zminimalizować błąd eksperymentalny i możliwe zmiany szybkości fagocytarów. Technika ta pozwoli naukowcom na zbadanie różnych tematów badawczych, w tym pytań dotyczących odporności komórkowej, różnych populacji komórek krwi lub odróżnienia fagocytozy od produkcji AMP podczas udanej odpowiedzi immunologicznej.
Przegląd
Ten protokół opisuje in vivo ocenę fagocytozy w celu oceny zdolności młodych i starych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii. Metoda ta pozwala na ilościową ocenę zdarzeń fagocytarnych w pojedynczych hemocytach, ujawniając różnice między genotypami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Fagocytoza jest krytyczną odpowiedzią immunologiczną u organizmów.
- Drosophila melanogaster służy jako organizm modelowy do badania procesów immunologicznych.
- Zrozumienie różnic związanych z wiekiem w fagocytozie może dać wgląd w odporność.
- Ten protokół ma na celu standaryzację oceny aktywności fagocytarnej hemocytów.
Cel badania
- Ocenić zdolność fagocytarną hemocytów o różnym wieku.
- Ilościowo ocenić zdarzenia fagocytarne w pojedynczych komórkach.
- Zbadać różnice w odpowiedzi immunologicznej między genotypami.
Stosowane metody
- Przygotowanie szklanych igieł do wstrzyknięcia.
- Wstrzyknięcie fluorescencyjnie oznakowanej cząsteczki do Drosophila.
- Sekcja much, aby uzyskać dostęp do hemocytów.
- Fluorescencyjne obrazowanie i ilościowa analiza za pomocą oprogramowania ImageJ.
Główne wyniki
- Ustalono skuteczne techniki wstrzyknięcia i sekcji.
- Zaobserwowano różnice w fagocytozie związane z wiekiem.
- Analiza ilościowa ujawniła różnice w odpowiedzi immunologicznej.
- Metoda wykazała się niezawodnością dla przyszłych badań.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę oceny fagocytozy.
- Pozwalla badaczom na zbadanie odporności komórkowej u Drosophila.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zbadać mechanizmy odporności.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative in vivo phagocytosis assays in adult Drosophila melanogaster hemocytes enable precise evaluation of innate immune function across age groups and genotypes. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for immunosenescence and cellular immunity pathways. The approach provides a standardized, scalable platform for comparative immune function studies relevant to early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of innate immune pathway function and genetic modifiers in a conserved model system.
- Supports biological de-risking by quantifying phagocytic capacity at the single-cell level across genotypes and ages.
- Facilitates predictive confidence in target selection for immune modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of hemocyte phagocytosis for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and measurement criteria for reproducibility across experiments and teams.
- Enables reliable evaluation of compound or genetic perturbation effects on cellular immune function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of immunosenescence and innate immune decline.
- Supports continuity from discovery-stage findings to preclinical model validation of immune interventions.
- Offers a platform for biomarker development and mechanistic studies of immune cell function.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo phagocytosis assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, target validation, and translational research on immune function.
- Discovery Biology: Quantifies phagocytic events to clarify pathway activity and genetic contributions to immune decline.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for evaluating interventions or genetic variants.
- Analytics: Employs standardized imaging and software-based quantification for robust statistical comparisons.
- Translational Research: Bridges findings from model systems to mammalian immune aging and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay platform for diverse immune function studies beyond aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of immune function assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, microinjection, and dissection techniques.
- Needs access to fluorescence imaging and quantitative analysis software (e.g., ImageJ).
- Demands cross-team standardization of injection, dissection, and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for cell size and marker selection.
- Timing and technical proficiency are critical to minimize experimental error and variability.
