Name: Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności inhibitorów chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma gondii przy użyciu testu opartego na lucyferazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Sibleyowi i Carruthersowi za udostępnienie plazmidu pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT oraz przeciwciał anty-TgCPL i TgActin. Praca ta była wspierana przez Clemson Startup Fund (do Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (do Z.D.), pilotażowy grant NIH COBRE grant P20GM109094 (do Z.D.) oraz NIH R01AI143707 (do Z.D.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii%3A+15+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li>
<li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li>
<li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li>
<li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li>
<li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li>
<li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery%3A+Design%2C+synthesis+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711(2019).</li>
<li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+toxoplasmosis+II%3A+clinical+features%2C+pathology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li>
<li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li>
<li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li>
<li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li>
<li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation%3A+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678(2018).</li>
<li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+%28PfCRT%29+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775(2019).</li>
<li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li>
<li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14(2014).</li>
<li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096(2017).</li>
<li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo%2Fexocytic+system+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li>
<li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li>
<li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450(2014).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14(2014).</li>
<li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li>
<li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812(2014).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

++Protokół ten opisuje protokół oparty na lucyferazie do oceny wewnątrzkomórkowego wzrostu Toxoplasmy i oceny skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wzrostowi pasożytów. W porównaniu z istniejącymi dostępnymi strategiami pomiaru wewnątrzkomórkowego wzrostu Toxoplasmy , metoda ta wykazuje wysoką czułość i swoistość. Podczas monitorowania wzrostu pasożyta zaleca się przeprowadzenie próbnego testu na przezroczystej 96-dołkowej mikropłytce w celu potwierdzenia, że badany szczep nie ulega prze...

Toxoplasma gondii to bardzo skuteczny pasożyt wewnątrzkomórkowy, który infekuje około jednej trzeciej populacji ludzkiej. Wysoki wskaźnik transmisji wynika głównie z różnych dróg przenoszenia, w tym spożywania niedogotowanego mięsa, narażenia na rezerwuary ssaków i wrodzonej transmisji podczas porodu. T. gondii powoduje głównie infekcje oportunistyczne, które mogą prowadzić do ciężkiej zachorowalności i śmiertelności u osób z obniżoną odpornością1,2,3,4,5,6. Antybiotyki stosowane obecnie w leczeniu ostrej toksoplazmozy są szczególnie nieskuteczne w leczeniu infekcji wrodzonych i utajonych i powodują ciężkie reakcje u niektórych osób3,7,8. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych środków terapeutycznych. Zrozumienie różnic w procesach subkomórkowych w obrębie Toxoplasmy i jej gospodarza pomoże zidentyfikować potencjalne cele leków. Dlatego potrzebne są skuteczne i wygodne techniki manipulacji genomem do badania roli poszczególnych genów w Toxoplasma. Ponadto Toxoplasma należy do gromady Apicomplexa, która obejmuje kilka innych ważnych patogenów ludzkich, takich jak Plasmodium spp. i Cryptosporidium spp. W związku z tym Toxoplasma może być wykorzystana jako organizm modelowy, aby pomóc w badaniu podstawowej biologii innych pasożytów apikompleksów.
Aby zidentyfikować nowe antybiotyki przeciwko patogenom mikrobiologicznym, początkowo przeprowadza się wysokoprzepustowe badania przesiewowe biblioteki związków chemicznych w celu określenia ich skuteczności w hamowaniu rozwoju drobnoustrojów. Do tej pory opracowano kilka testów wzrostu opartych na mikropłytkach do pomiaru wewnątrzkomórkowego wzrostu T. gondii (tj. radioaktywna kwantyfikacja oparta na inkorporacji 3H-uracylu < klasa sup = "xref">9, ilościowe wykrywanie pasożytów na podstawie testu ELISA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla T. gondii 10,11, pomiar oparty na białku reporterowym przy użyciu szczepów Toxoplasma eksprymujących β-galaktozydazę lub YFP12,13, oraz niedawno opracowany test obrazowania o wysokiej zawartości14).
Te indywidualne strategie mają unikalne zalety, jednak pewne ograniczenia również ograniczają ich zastosowanie. Na przykład, ponieważ Toxoplasma może replikować się tylko w jądrzastych komórkach zwierzęcych, autofluorescencja i niespecyficzne wiązanie przeciwciał anty-T. gondii z komórkami gospodarza powodują zakłócenia w pomiarach opartych na fluorescencji. Ponadto stosowanie izotopów promieniotwórczych wymaga szczególnej zgodności z przepisami bezpieczeństwa i potencjalnych problemów związanych z bezpieczeństwem. Niektóre z tych testów są bardziej odpowiednie do oceny wzrostu w jednym punkcie czasowym niż do ciągłego monitorowania wzrostu.
Prezentowany tutaj jest protokół oparty na lucyferazie do ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowego wzrostu Toxoplasmy. W poprzednim badaniu gen lucyferazy NanoLuc został sklonowany pod promotorem tubuliny Toxoplasma, a ten konstrukt ekspresji lucyferazy został transfekowany do pasożytów typu dzikiego (szczep RHΔku80Δhxg) w celu wytworzenia szczepu RHΔku80Δhxg::NLuc (określanego dalej jako RHΔku80::NLuc)15. Szczep ten służył jako szczep rodzicielski do określania wzrostu wewnątrzkomórkowego i delecji genów w tym badaniu. Używając szczepu RHΔku80::NLuc, monitorowano wzrost pasożyta w ludzkich fibroblastach napletka (HFF) przez 96 godzin po zakażeniu, aby obliczyć czas podwojenia pasożyta.
Ponadto, skuteczność hamowania LHVS przeciwko wzrostowi pasożytów można określić poprzez wykreślenie tempa wzrostu Toxoplasmy w stosunku do seryjnych stężeń LHVS, aby zidentyfikować wartość IC50. Wcześniejsza literatura donosiła, że TgCPL jest głównym celem LHVS u pasożytów i że leczenie LHVS zmniejsza rozwój ostrych i przewlekłych zakażeń Toxoplasma16,17,18,19. Dodatkowo, RHΔku80::NLuc został użyty jako szczep rodzicielski do modyfikacji genomu w celu wygenerowania szczepu z niedoborem TgCPL (RHΔku80Δcpl::NLuc), a hamowanie LHVS mierzono w stosunku do tego mutanta. Obserwując przesunięcie w górę wartości IC50 dla LHVS u pasożytów z niedoborem TgCPL w porównaniu ze szczepem WT, potwierdzono, że TgCPL jest celem LHVS in vivo.
W tym protokole, RHΔku80::NLuc jest używany jako szczep rodzicielski, który nie posiada efektywnej niehomologicznej ścieżki łączenia końców (NHEJ), co ułatwia rekombinację zależną od podwójnej homologii krzyżowania (HDR)20,21. Dodatkowo, regiony homologiczne 50 pz są otoczone na obu końcach kasety oporności na leki metodą PCR. Produkt PCR służy jako szablon naprawczy do usunięcia całego locus genu za pomocą HDR przy użyciu narzędzi do edycji genomu opartych na CRISPR-Cas9. Tak krótkie obszary homologiczne można łatwo włączyć do starterów, zapewniając wygodną strategię produkcji szablonu naprawczego. Protokół ten można zmodyfikować w celu przeprowadzenia uniwersalnej delecji genów i endogennego znakowania genów.
Na przykład, w naszej najnowszej publikacji, trzy geny proteazy, TgCPL, TgCPB (proteaza podobna do katepsyny Toxoplasma B) i TgSUB1 (proteaza podobna do subtylizyny Toxoplasma 1), zostały genetycznie ablowane u pasożytów z niedoborem TgCRT (transporter oporności na chlorochinę Toxoplasma) przy użyciu tej metody15. Dodatkowo, TgAMN (przypuszczalna aminopeptydaza N [TgAMN, TGGT1_221310]) była endogennie oznaczona tagiem15. Laboratorium Lourido poinformowało również o użyciu krótkich regionów homologicznych w zakresie 40-43 pz do wprowadzenia mutacji genowej ukierunkowanej na miejsce i endogennego znakowania genów w genomie Toxoplasma przy użyciu podobnej metody22. Te udane modyfikacje genomu sugerują, że region homologiczny 40-50 pz jest wystarczający do efektywnej rekombinacji DNA w szczepie z niedoborem TgKU80, co znacznie upraszcza manipulację genomem w Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu agarozowego</td><td>New England BioLabs</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0316S</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H1 Hybrydowy wielomodowy czytnik mikropłytek</td><td>BioTek Instituments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporration System Aparat</td><td></td><td></td><td>Harvarda</td></tr><tr><td>Kompetentne chemicznie komórki E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C29871</td><td></td></tr><tr><td>Premiks CloneAmp HiFi PCR</td><td>Takara Bio</td><td>639298</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine h</td><td>Prolume</td><td>301-10 hCTZ</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>F170L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu</td><td>Zymo Research</td><td>D4054</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>New England BioLabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneious oprogramowanie do projektowania sgRNA (wersja: R11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism (wersja 8th)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SnapGene do klonowania molekularnego (wersja: 4.2.11)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi toxoplasma gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii to patogen pierwotniaka, który szeroko atakuje ludzką populację. Obecne antybiotyki stosowane w leczeniu klinicznej toksoplazmozy są ograniczone. Ponadto wykazują niekorzystne skutki uboczne w niektórych grupach osób. Dlatego konieczne jest odkrycie nowych metod leczenia klinicznej toksoplazmozy. Pierwszym krokiem w procesie opracowywania nowych antybiotyków jest zidentyfikowanie związków chemicznych wykazujących wysoką skuteczność w hamowaniu wzrostu pasożytów przy użyciu strategii wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Jako obowiązkowy patogen wewnątrzkomórkowy, Toxoplasma może replikować się tylko w komórkach gospodarza, co uniemożliwia stosowanie pomiarów absorbancji optycznej jako szybkiego wskaźnika wzrostu. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół testu wzrostu opartego na lucyferazie. Na przykład metoda ta jest stosowana do obliczania czasu podwojenia pasożytów Toxoplasma typu dzikiego i pomiaru skuteczności fenylu morfolinomocznika-leucylo-homofenylo-winylosulfonu (LHVS, związek ukierunkowany na proteazę cysteinową) w hamowaniu wzrostu wewnątrzkomórkowego pasożyta. Opisano również protokół delecji genów oparty na CRISPR-Cas9 w Toxoplasma wykorzystujący regiony homologiczne 50 pz do rekombinacji zależnej od homologii (HDR). Określając ilościowo skuteczność hamowania LHVS u pasożytów z niedoborem typu dzikiego i TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease), wykazano, że LHVS hamuje wzrost pasożytów typu dzikiego skuteczniej niż wzrost Δcpl, co sugeruje, że TgCPL jest celem, z którym LHVS wiąże się w Toxoplasma. Wysoka czułość i łatwa obsługa tego testu wzrostu opartego na lucyferazie sprawiają, że nadaje się on do monitorowania proliferacji Toxoplasma i oceny skuteczności leków w sposób wysokoprzepustowy.

Rysunek 1 przedstawia przykład krzywej wzrostu dla szczepu RHΔku80::NLuc oraz wynik obliczenia czasu jego podwojenia. Zazwyczaj test wykonuje się w trzech powtórzeniach technicznych dla każdego z trzech powtórzeń biologicznych, aby uwzględnić różnice w odczytach aktywności lucyferazy. W celu obliczenia znormalizowanej krotności zmiany wzrostu pasożytów, każdy odczyt z okresu 24–96 h po infekcji podzielono przez odczyt początkowy w 4 h po inf...

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi in vitro Toxoplasma gondii za pomocą testu wzrostu opartego na lucyferazie. Technikę tę stosuje się w celu potwierdzenia swoistości inhibicji poprzez genetyczną delecję odpowiedniego genu docelowego. Jako przykład oceniane jest hamowanie LHVS wobec proteazy TgCPL.

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Te czułe strategie mogą być wykorzystane do oceny skuteczności hamowania inhibitorów chemicznych oraz w połączeniu z delecją genu CRISPR-Cas9 do zbadania celów leków. Zamiast korzystać z testu końcowego, wzrost pasożyta może być monitorowany w czasie, aby umożliwić obliczenie czasu podwojenia pasożyta przy użyciu czułego białka reporterowego. Test ten można potencjalnie zwiększyć w 384 lub 1 536 mikropłytkach w celu testowania wielu związków lub do badań przesiewowych bibliotek w sposób wysokoprzepustowy.Strategia ta może być modyfikowana w celu ilościowego określenia wzrostu innych wewnątrzkomórkowych patogenów drobnoustrojów i ich reakcji na lek będący przedmiotem zainteresowania. Aby przeprowadzić test wzrostu Toxoplasmy na bazie lucyferazy, zacznij od ostrożnego zasysania pożywki z wstępnie wysianych 96-dołkowych kultur mikropłytek ludzkich fibroblastów napletka i zaszczepij 150 mikrolitrów zawiesiny pasożyta B do studzienek w formacie trzykolumnowym-pięciorzędowym. Po czterogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych ostrożnie zassać pożywkę z każdej studzienki, aby usunąć niezaatakowane pasożyty i napełnić studzienki w każdym rzędzie z wyjątkiem pierwszego pożywką wolną od czerwieni fenolowej o temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 100 mikrolitrów 12,5 mikromolowego roztworu substratu lucyferazy w PBS do każdej studzienki górnego rzędu i inkubuj mikropłytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić pełną lizę komórek. Pod koniec inkubacji zmierz aktywność lucyferazy na czytniku mikropłytek. Każdy odczyt reprezentuje początkową liczbę zaatakowanych pasożytów w ciągu czterech godzin po zakażeniu.Powtarzaj analizę co 24 godziny przez następne cztery dni bez zmiany pożywki. Aby obliczyć znormalizowaną zmianę krotności wzrostu pasożyta, każdy odczyt można podzielić przez początkowy odczyt po czterech godzinach od infekcji. Logarytm 2 znormalizowanej zmiany krotności wzrostu pasożyta można następnie wykreślić w odniesieniu do każdego punktu czasowego i poddać funkcji regresji liniowej w celu uzyskania nachylenia reprezentującego czas podwojenia.Aby ocenić skuteczność hamowania związku będącego przedmiotem zainteresowania we wzroście Toxoplasma, należy hodować ludzkie fibroblasty napletka w 96-dołkowych mikropłytkach przez co najmniej siedem dni przed inokulacją każdej studzienki komórek 150 mikrolitrami pasożytów, jak wykazano przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Podczas inkubacji należy przygotować interesujący nas związek w ośmiu różnych stężeniach w 12-dołkowym zbiorniku przez seryjne rozcieńczanie. Rozcieńczyć związki w 12-dołkowym zbiorniku w rozcieńczeniu od jednego do trzech, pipetując każdą mieszaninę w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Po czterech godzinach od zakażenia zastąpić pożywkę w każdej studzience od kolumn od drugiej do dziewiątej 150 mikrolitrami pożywki uzupełnionej każdym rozcieńczeniem związku, pozostawiając pierwszą kolumnę wypełnioną zwykłą pożywką, która służy jako kontrola niepoddana działaniu substancji. Następnie należy zwrócić kultury komórkowe do inkubatora hodowli komórkowych na 96 godzin i zmierzyć aktywność lucyferazy dla każdej studzienki, aby określić procent zahamowania wzrostu w kulturach przy każdym stężeniu związku. Aby obliczyć znormalizowaną aktywność lucyferazy w procentach, podziel średnią aktywność lucyferazy dla każdego stężenia związku przez średnią aktywność lucyferazy pochodzącą z nieleczonych pasożytów.Następnie użyj odpowiedniego programu do tworzenia wykresów, aby wykreślić znormalizowane aktywności lucyferazy w stosunku do pojedynczego związku i obliczyć połowę maksymalnego stężenia hamującego dla każdego związku. Aby wygenerować konstrukt plazmidowy eksprymujący jednoprzewodnikowy RNA i Cas9 w celu usunięcia interesującego genu, przejdź do strony Toxoplasma Genomics Resource i pobierz całą sekwencję kodującą geny, w tym introny i eksony, wraz z 1,5 kilobase five i trzema pierwszymi regionami nieulegającymi translacji. Skopiuj pobraną sekwencję TgCPL do oprogramowania do analizy sekwencji i oznacz pięć i trzy pierwsze nietranslowane regiony.Na stronie Toxoplasma Genomics Resource (Zasób genomiki Toxoplasma) kliknij pozycję Pobierz, Pliki danych i Current_Release. W folderze T.gondii GT1 wybierz FASTA. Z folderu danych pobierz plik sekwencji genomu szczepu Toxoplasma gondii GT1.Następnie utwórz folder lokalny o nazwie Toxoplasma Genome w oprogramowaniu do analizy sekwencji DNA i zaimportuj plik sekwencji genomu Toxoplasma do tego folderu. Wybierz Narzędzia, Klonowanie i Znajdź witryny CRISPR i ustaw trzy główne Cas9 prime dla lokalizacji witryny PAM. Wybierz RNA z pojedynczym przewodnikiem, który wykazuje wysoki wynik swoistości, zwykle większy niż 98% i nie ma G po NGG.Wybrany pojedynczy przewodnik RNA jest zwykle zlokalizowany w miejscach znajdujących się w pobliżu kodonów start i stop interesującego genu. Następnie użyj premiksu PCR z ustawieniami wskazanymi w tabeli, aby przeprowadzić reakcję PCR w celu zmodyfikowania istniejącego wcześniej plazmidu eksprymującego jednoprowadnicowy RNA, który jest ukierunkowany na gen TgUPRT. W przypadku transfekcji Toxoplasma wymieszaj dwa mikrogramy naprawionego matrycowego DNA z 20 mikrogramami plazmidów ekspresyjnych Cas9 z pojedynczym przewodnikiem RNA i wymieszaj 400 mikrolitrów zawiesiny pasożyta, DNA i pięciu mikrolitrów 200 milimolowego ATP 500 milimolowego zredukowanego glutationu w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej.Dodaj bufor cytomiksu, aby zwiększyć całkowitą objętość do 500 mikrolitrów, jeśli to konieczne, i przenieś mieszaninę DNA pasożyta do czteromilimetrowej szczeliny za pomocą kuwety elektroporacyjnej. Następnie elektropoturuj pasożyty przy rezystancji dwóch kilowoltów i 50 omów. Aby sklonować pasożyty nokautujące, najpierw wykonaj dwuetapowe rozcieńczenie pasożytów, aby uzyskać 10 pasożytów na mililitr pożywki D10 uzupełnionej odpowiednim stężeniem antybiotyku.Następnie przenieś 150 mikrolitrów zawieszonych oczyszczonych pasożytów do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki wstępnie obsianej fibroblastami napletka i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez siedem dni. Pod koniec inkubacji zidentyfikuj studzienki zawierające pojedynczą płytkę i przenieś 75 mikrolitrów ponownie zawieszonych ludzkich fibroblastów napletka zakażonych Toxoplasmą z każdej studzienki 96-dołkowej kultury mikropłytki do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 10,25 mikrolitrach buforu do lizy zawierającego bufor rozcieńczający w dodatku uwalniającym DNA.Następnie inkubuj próbki przez cztery minuty w temperaturze pokojowej i dwie minuty w temperaturze 98 stopni Celsjusza przed wykonaniem PCR w celu zbadania integracji kasety oporności na leki i utraty interesującego genu. Skuteczność hamowania LHVS i typu dzikiego w szczepach delta CPL można określić, wykreślając ich aktywność lucyferazy w stosunku do różnych stężeń inhibitorów. Po PCR zmutowany plazmid jest linearyzowany i ładowany do 1% żelu agarozowego w celu weryfikacji udanej amplifikacji.Po ekstrakcji żelu i transformacji E. coli, klony zawierające oczekiwane plazmidy mogą być badane przesiewowo przez restrykcyjne trawienie endonukleazy w sekwencjonowaniu DNA. Po amplifikacji matrycy naprawczej można zastosować elektroforezę w żelu agarozowym w celu sprawdzenia prawidłowego rozmiaru produktu PCR. Ogólnie rzecz biorąc, siedem do ośmiu klonów jest wybieranych do wstępnego badania przesiewowego, aby sprawdzić delecję sekwencji kodującej gen będący przedmiotem zainteresowania, a następnie wykrywa się pięć i trzy główne ramiona, aby zminimalizować całkowitą liczbę klonów do przebadania.Dalsza weryfikacja może być zakończona przez immunoblotting, jeśli dostępne jest jakiekolwiek przeciwciało rozpoznające białko docelowe. Przed uzyskaniem pomiarów aktywności lucyferazy, przezroczystą mikropłytkę z pozorowaną infekcją należy sprawdzić pod mikroskopem, aby upewnić się, że pasożyty nie dokonują pełnej lizy komórek gospodarza.

determination-chemical-inhibitor-efficiency-against-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

W tym filmie pokazujemy test lucyferazy do ilościowego określenia wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenu Toxoplasma gondii. Wykorzystując szczep Toxoplasma, który eksprymuje enzym lucyferazy po zakażeniu komórek gospodarza, aktywność lucyferazy jest wykrywana w zakażonej kulturze komórkowej w celu określenia pomyślnego rozmnażania pasożyta.

Test wzrostu oparty na lucyferazie do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowej reprodukcji pasożytów

Wideo demonstruje test lucyferazy używany do określenia skuteczności chemicznego inhibitora przeciwpasożytniczego przeciwko wewnątrzkomórkowemu patogenowi Toxoplasma gondii. Badanie obejmuje pasożyty wykazujące ekspresję lucyferazy, które atakują komórki gospodarza w celu replikacji i przetrwania. Inhibitor chemiczny wiąże się z proteazami cysteinowymi pasożyta i hamuje replikację. Wykryta aktywność lucyferazy jest proporcjonalna do zmian w pofałdowaniu wzrostu pasożyta, decydując o...

Test lucyferazy w celu zbadania skuteczności przeciwpasożytniczych substancji chemicznych przeciwko pasożytom

W tym filmie opisujemy prostą i solidną metodę określania potencjału cytotoksycznego leku trypanobójczego przeciwko pasożytowi, Trypanosoma cruzi, wyrażającemu enzym β-galaktozydazy. β-galaktozydaza służy jako wskaźnik lizy komórek, a jej aktywność może być wykorzystana do oceny efektów działania leku.

Test β-galaktozydazy do oceny cytotoksyczności wywołanej lekiem u pasożytów

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Opisujemy wysokoprzepustowy test kolorymetryczny mierzący aktywność β-galaktozydazy w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi, czynnika wywołującego chorobę Chagasa. Ten test może być używany do identyfikacji związków trypanobójczych w łatwy, szybki i powtarzalny sposób.

In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę oceny skuteczności inhibitorów chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma gondii przy użyciu testu opartego na lucyferazie.

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Przeglądaj więcej filmów