Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy
6 maja 2020
Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Nasz protokół odpowiada na niezaspokojoną potrzebę solidnej i powtarzalnej metody analizy ilościowej zmian w rozwoju i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Nasza technika określa specyficzne i powtarzalne parametry do analizy ilościowej zmian w wielu tkankach stawowych w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Ponieważ technika ta pozwala na ilościową analizę choroby zwyrodnieniowej stawów, można ją wykorzystać do porównania wpływu określonych zabiegów na wiele tkanek stawowych w celu oceny ich skuteczności terapeutycznej.
Nasz protokół może być również stosowany do innych modeli choroby zwyrodnieniowej stawów lub obszarów badań układu mięśniowo-szkieletowego, w których potrzebne jest ilościowe określenie chrząstki i kości. Chociaż system jest prosty i intuicyjny, sesje treningowe są nadal konieczne, aby ćwiczyć uzyskiwanie pomiarów w powtarzalny sposób w celu osiągnięcia odtwarzalności. Vengadeshprabhu Karuppagounder, doktor habilitowany z naszego laboratorium, będzie teraz demonstrował naszą procedurę.
Zacznij od włączenia mikroskopu, aparatu, komputera i monitora z ekranem dotykowym. Wybierz cel 4X i kliknij ikonę oprogramowania, aby uruchomić program. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i wyśrodkuj próbkę w oknie pomiarowym, upewniając się, że siatka pomiarowa jest ustawiona na odpowiednie powiększenie, aby pasowało do obiektywu, tak aby zarówno powierzchnia stawowa piszczelowa, jak i udowa oraz kość piszczelowa podchrzęstna znajdowały się w obszarach zainteresowania obrazu.
Następnie w menu Plik wybierz opcję Odczyt ustawień. W oknie Ustawienia wybierz odpowiedni plik ustawień dla parametrów, które mają być mierzone. Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię chrząstki, wybierz funkcję Tib TC i prześledź wzdłuż górnej krawędzi powierzchni chrząstki piszczelowej, gdzie chrząstka styka się z przestrzenią stawową oraz wzdłuż połączenia chrzęstno-kostnego, gdzie zwapniała chrząstka styka się z kością podchrzęstną.
Aby zmierzyć zwapniony obszar chrząstki, wybierz funkcję Tib CC i narysuj linię wzdłuż znaku pływu, naturalnie występującej linii oddzielającej zwapniałe i niezwapnione obszary chrząstki oraz wzdłuż połączenia chrzęstno-kostnego, gdzie zwapniała chrząstka styka się z kością podchrzęstną. Aby określić obszar niezwapnionej chrząstki, odejmij zwapniony obszar chrząstki od całkowitego obszaru chrząstki. Aby określić liczbę chondrocytów, utwórz oddzielne funkcje zliczania w ustawieniach w oprogramowaniu do histomorfometrii, aby odróżnić chondrocyty wytwarzające macierz i niewytwarzające macierzy.
Następnie za pomocą rysika narysuj małą kropkę nad każdym chondrocytem wyrażającym określony fenotyp, aby określić liczbę macierzy produkujących lub niewytwarzających chondrocytów. Aby zmierzyć całkowity parametr powierzchni stawowej piszczelowej, narysuj linię w poprzek powierzchni chrząstki piszczelowej, aby dokładnie określić poszczególne migotania. Następnie narysuj drugą linię wzdłuż znaku pływu, która będzie służyć jako wewnętrzna kontrola płaszczyzny każdej sekcji i podziel parametr powierzchni stawowej piszczeli przez parametr znaku pływu, aby obliczyć wskaźnik migotania powierzchni stawowej kości piszczelowej.
Aby zmierzyć obszar przestrzeni podchrzęstnej szpiku, wybierz funkcję Obszar szpiku. Następnie narysuj linie wokół parametru tych obszarów, aby określić całkowitą powierzchnię przestrzeni szpiku kostnego w kości piszczelowej podchrzęstnej. Aby zmierzyć całkowity obszar podchrzęstny, wybierz funkcję kości podchrzęstnej i nakreśl obszar między połączeniem chrzęstno-kostnym w górnej granicy płytki wzrostu, rozciągającej się bocznie do obszarów przednich i tylnych osteofitów.
Następnie odejmij obszar przestrzeni podchrzęstnej szpiku kostnego od całkowitego obszaru podchrzęstnego, aby obliczyć obszar kości podchrzęstnej. Aby zmierzyć obszar osteofitu, wybierz funkcję osteofitu przedniego i prześledź przedni osteofit bliższej kości piszczelowej. Następnie wybierz tylny osteofit i prześledź tylny osteofit bliższej części kości piszczelowej.
Aby zmierzyć grubość błony maziowej przedniej części kości udowej, kliknij Przednia łąkotka maziowa kości udowej i narysuj jedną linię od wewnętrznego punktu przyczepu przedniej błony maziowej na kości udowej w kierunku jej punktu przyczepu na łąkotce i jedną linię od zewnętrznego przyczepu błony maziowej na kości udowej w kierunku jej przyczepu do łąkotki. Następnie podziel całkowitą powierzchnię maziową przez parametr maziowy, aby obliczyć grubość mazi. Choroba zwyrodnieniowa stawów wywołana DMM skutkuje zwiększonym wynikiem Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową stawów w porównaniu z myszami pozorowanymi.
Wyraźnie charakteryzuje się erozją powierzchniową i utratą chrząstki. Ten protokół histomorfometrii może być stosowany do wykrywania kilku zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów, w tym zmniejszenia całkowitej chrząstki i niezwapniałych obszarów chrząstki. Zmniejszenie całkowitej liczby chondrocytów i co ważne, utrata liczby chondrocytów wytwarzających macierz
.Obserwuje się również zmiany w powierzchni stawowej, wskazujące na nasilenie erozji, w tym ogólny wzrost wskaźnika migotania. Choroba zwyrodnieniowa stawów obejmuje również zwiększenie obszaru kości podchrzęstnej i zmniejszenie obszaru przestrzeni szpiku kostnego u myszy DMM, co wskazuje na stwardnienie podchrzęstne kości. Zarówno przedni, jak i tylny obszar osteofitów również zwiększył się u myszy DMM, co sugeruje trwającą przebudowę kości podchrzęstnej, która działa jako mechanizm kompensacyjny do radzenia sobie ze zmianami obciążenia stawów w miejscu urazu.
Analiza histomorfometryczna błony maziowej wykazuje wzrost grubości błony maziowej u myszy DMM. Typowy wynik choroby zwyrodnieniowej stawów związany jest z zapaleniem błony maziowej i dyfuzją cytokin zapalnych do przestrzeni stawowej. Ponadto nie obserwuje się znaczącej zmienności między użytkownikami między analizą histomorfometryczną niezwapnionego obszaru chrząstki w wyniku Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów.
Po analizie histomorfometrycznej można wykorzystać szkiełka sekwencyjne i barwienie immunofluorescencyjne do zbadania zmian w ekspresji białek między próbkami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę ilościowego określania zmian morfologicznych w stawach związanych z chorobą zwyrodnieniową. Został on opracowany w celu skutecznego monitorowania postępu choroby oraz oceny interwencji terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad chorobą zwyrodnieniową stawów
- Analiza tkanek stawowych
- Ocena skuteczności terapeutycznej
Wprowadzenie
- Choroba zwyrodnieniowa stawów charakteryzuje się degeneracją stawów.
- Ilościowa analiza zmian w stawach jest kluczowa dla zrozumienia tej choroby.
- Istniejące metody mogą cechować się niską powtarzalnością.
- Niniejszy protokół ma na celu wypełnienie tej luki poprzez zastosowanie ustandaryzowanego podejścia.
Cel badania
- Ustanowienie powtarzalnej metody ilościowego oznaczania zmian w stawach.
- Ułatwienie monitorowania progresji choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Ocena wpływu interwencji terapeutycznych na tkanki stawowe.
Zastosowane metody
- Analiza ilościowa wielu tkanek stawowych.
- Specyficzne parametry pomiaru zmian w chrząstce i kości.
- Sesje szkoleniowe w celu zapewnienia powtarzalności pomiarów.
- Zastosowanie w różnych modelach choroby zwyrodnieniowej stawów.
Główne wyniki
- Przedstawiono niezawodną metodę oceny zmian w stawach.
- Umożliwiono porównanie efektów leczenia w obrębie tkanek stawowych.
- Opracowano schemat możliwy do zastosowania w innych badaniach nad układem mięśniowo-szkieletowym.
- Wykazano znaczenie przeszkolenia dla dokładności pomiarów.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi cenne narzędzie w badaniach nad chorobą zwyrodnieniową stawów.
- Umożliwia on ocenę skuteczności terapeutycznej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne obszary badań nad układem mięśniowo-szkieletowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena histomorfometryczna odpowiada na krytyczną potrzebę odtwarzalnej i obiektywnej oceny patologii choroby zwyrodnieniowej stawów w modelach przedklinicznych. Poprzez ograniczenie subiektywizmu właściwego dla półilościowych systemów punktacji, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz ocenie skuteczności leczenia. Wspiera ono podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane na wczesnym etapie odkrywania leków, umożliwiając czułe wykrywanie subtelnych zmian strukturalnych w chrząstce, kości i błonie maziowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowy pomiar degeneracji chrząstki i przebudowy kości podchrzęstnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne parametry oceny oddziaływania na cel w wielu tkankach stawowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wykrywanie wczesnych zmian w liczbie chondrocytów wytwarzających macierz oraz włóknienie powierzchni stawowej.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Generuje zestandaryzowane, ilościowe odczyty powierzchni chrząstki, stosunku chrząstki zwapniałej do niezwapniałej oraz stopnia tworzenia się osteofitów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację analizy poprzez zdefiniowane protokoły obrysowywania oraz kontrole wewnętrzne, takie jak linia przypływu (tide mark).
- Skalowalność: Umożliwia zastosowanie w innych modelach układów zapalenia stawów, wymagających ilościowego określenia chrząstki i kości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy punkty końcowe strukturalne z istotnością chorobową poprzez rejestrację zwiększenia grubości błony maziowej i sklerozy kości podchrzęstnej.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera podejmowanie decyzji przedklinicznych poprzez kwantyfikację powierzchni osteofitów jako biomarkera kompensacyjnego przebudowy.
- Wgląd mechanistyczny: Umożliwia korelację zmian histomorfometrycznych z późniejszym barwieniem immunofluorescencyjnym w celu analizy ekspresji białek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – dostarczając ilościowych odczytów na poziomie tkankowym, które stanowią podstawę do oceny skuteczności terapeutycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar ubytku chrząstki, zmian fenotypu chondrocytów oraz stanu zapalnego błony maziowej.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanemu wyznaczaniu granic chrząstki piszczelowej, kości podchrzęstnej i osteofitów.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą za pomocą wyznaczonych wskaźników, takich jak wskaźnik fibrylacji powierzchni stawowej piszczeli oraz obliczenia grubości błony maziowej.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez kwantyfikację zmian strukturalnych, które pozwalają przewidzieć funkcjonalny spadek sprawności stawu.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Służy jako wielokrotnego użytku platforma histomorfometryczna, którą można zastosować w różnych modelach chorób układu mięśniowo-szkieletowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję zmienności między użytkownikami w pomiarach powierzchni chrząstki.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki półautomatycznemu oprogramowaniu i zestandaryzowanym plikom ustawień.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrywanie nieskutecznych związków poprzez czułe punkty końcowe strukturalne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez mierzalne zmiany w obrębie osteofitów i kości podchrzęstnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga przeszkolenia w obsłudze oprogramowania do histomorfometrii w celu uzyskania spójnego obrysowywania granic tkanek.
- Zależność od infrastruktury obejmującej mikroskop, kamerę, komputer i ekran dotykowy w celu akwizycji obrazów.
- Konieczność standaryzacji plików ustawień pomiędzy użytkownikami i laboratoriami dla zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu parametrów do różnych obszarów stawów lub modeli choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Ograniczenie wynikające z konieczności ręcznego obrysowywania, mimo wsparcia oprogramowania półautomatycznego.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Histomorphometric Analysis Setup
1:59
Total, Calcified, and Uncalcified Cartilage Area Measurements
2:47
Chondrocyte Number and Phenotype Evaluation
3:17
Tibial Articular Surface Perimeter Measurement
3:47
Subchondral Bone and Marrow Space Area Measurement
4:30
Anterior and Posterior Osteophyte Area and Synovial Thickness Measurement
5:21
Results: Representative Histomorphometric Osteoarthritis (OA) Evaluation in Destabilization of the Medial Meniscus (DMM) and Sham Mice
7:06
Conclusion
