Name: Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru migracji i inwazji komórek glioblastomy U-118MG w czasie rzeczywistym bez barwienia. Ta technika pozwala ocenić kinetykę komórkową i efekty leczenia w sposób nieinwazyjny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Olivii Funk za jej pomoc techniczną przy danych systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym. Dziękujemy również Medical Writing Center w Children's Mercy Kansas City za redakcję tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (do TP) oraz przez Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (do TP).

UWAGA: Wszystkie materiały do hodowli komórkowych muszą być sterylne, a cały eksperyment musi być przeprowadzony w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.
1. Hodowla i elektroporacja linii komórkowej glejaka U-118MG
<ol>
	<li>Wyhodować linię komórkową U-118MG w 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco (pożywka hodowlana) i utrzymać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 inkubator (warunki hodowli).</li>
	<li>Do elektroporacji użyj 70-80% zlewających się zdrowych komórek.</li>
	<li>W celu pobrania komórek umyj komórki rosnące w szalkach hodowlanych 1x PBS i dodaj 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Umieścić w inkubatorze na 30 s i usunąć trypsynę-EDTA. Zebrać komórki z pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą ręcznego automatycznego licznika komórek, odwiruj komórki przy 100 x g przez 5 minut i odrzuć supernatant.</li>
	<li>Zawieś osad komórkowy w pożywce hodowlanej i weź 600 000 komórek dla każdego stanu do probówki mikrowirówkowej. Dostosuj liczbę komórek w zależności od projektów eksperymentalnych i szybkości wzrostu. </li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej i dodać 800 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Wirować za pomocą miniwirówki przez 30 s i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 60 μl buforu do respensji R do osadu komórkowego i dodać siRNA (tj. niedocelowe siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA lub zarówno Crk, jak i CrkL siRNA) w stężeniu 6 μM do odpowiedniej probówki mikrowirówkowej. Wymieszaj je delikatnie, stukając.</li>
	<li>Elektroporować 10 μl komórek za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 V przez 10 ms za pomocą trzech impulsów i przenieść elektroporowane ogniwa do 5 ml pożywki hodowlanej. Powtórz elektroporację dla pozostałych komórek przygotowanych dla każdego stanu.</li>
	<li>Zakończ wszystkie odpowiednie elektroporacje. Przenieś elektroporowane komórki do dwóch szalek o średnicy 35 mm na warunki i hoduj je w warunkach hodowli przez 3 dni.</li>
	<li>Trzeciego dnia należy traktować wszystkie elektroporowane ogniwa w 0,5% FBS zawierającym DMEM (pożywka o niskiej surowicy) przez 6 godzin przed właściwym pomiarem impedancji ogniwa. </li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, płytek do inwazji i migracji komórek (CIM) oraz elektroporowanych ogniw U-118MG do powlekania
<ol>
	<li>Umieść system analizy komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w warunkach hodowli na 5–6 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, aby ustabilizować system do warunków hodowli.</li>
	<li>Do testu inwazji należy umieścić na płytce 50 μl DMEM (zwykłego podłoża) zawierającego żel z matrycą zewnątrzkomórkową (ECM) w ilości 0,1 μg/μl w każdym dołku górnej komory płytki CIM. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, należy stosować metodę pipetowania odwrotnego. Natychmiast usuń 30 μl żelu ECM, pozostawiając 20 μl w studzience.</li>
	<li>Po nałożeniu powłoki żelowej ECM należy przechowywać płytkę w inkubatorze w warunkach hodowli przez 4 godziny pod pokrywą. Podczas powlekania i suszenia żelu ECM należy podjąć środki zapobiegawcze, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu elektrod górnej komory płytek z rękami, powierzchniami komory bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatoraCO2</li>.
	<li>Aby skonfigurować program do pomiaru impedancji, kliknij dwukrotnie odpowiednią ikonę oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby otworzyć aplikację oprogramowania systemowego (jednostkę sterującą). Każda kołyska ma indywidualne okno z różnymi zakładkami do ustawiania warunków eksperymentu, interwału czasowego pomiaru impedancji i czasu trwania oraz analizy danych.</li>
	<li>Na karcie Układ ustaw poczwórne studzienki dla każdego stanu biologicznego i ustaw dwuetapowe pomiary impedancji komórek na karcie Harmonogram. Pierwszym krokiem jest jednorazowy pomiar linii bazowej (jedno przemiatanie w odstępie 1 minuty), a drugim krokiem jest pomiar impedancji ogniw w odpowiednich indywidualnych kołyskach do rzeczywistego eksperymentu. W przypadku migracji należy użyć 145 przemiatania z 10-minutowym interwałem, a w przypadku inwazji 577 przemiatania z 10-minutowym interwałem, ustawianym indywidualnie) w odpowiednich indywidualnych kołyskach.</li>
	<li>Godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji ogniwa dodać 160 μl DMEM z 10% FBS jako chemoatraktantu w dołkach dolnej komory płytki. Połączyć górną komorę zawierającą studzienki pokryte żelem ECM lub studzienki niepowlekane z dolną komorą w celu zmierzenia odpowiednio inwazji i migracji.</li>
	<li>Napełnij studzienki w górnej komorze 50 μl pożywki o niskiej surowicy i umieść je w kołysce systemu. Sprawdź, czy wszystkie studzienki są rozpoznawane przez jednostkę sterującą, klikając kartę Komunikat. Jeśli komunikat zostanie wyświetlony jako OK, oznacza to, że płytka w podstawce jest gotowa do eksperymentu. </li>
	<li>Całkowicie wypełnione płytki należy wstępnie inkubować w inkubatorze w warunkach hodowli przez 1 godzinę przed pomiarami w kołysce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do aklimatyzacji wypełnionej płytki do warunków hodowli komórkowej.</li>
	<li>W przypadku pobierania komórek poddanych działaniu pożywki o niskiej surowicy, należy dokonać trypsynizacji komórek jak w kroku 1.3, zebrać je w pożywce o niskiej surowicy i policzyć komórki jak w kroku 1.4.</li>
	<li>Po zliczeniu odwirować komórki o masie 100 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 800 000 komórek w 800 μl pożywki o niskiej surowicy do testów migracji i inwazji. Dodatkowo ponownie zawieś 300 000 komórek w 2 ml pożywki hodowlanej i wysiew w naczyniu o średnicy 35 mm w celu analizy Western blot, aby potwierdzić regulowany knockdown Crk i CrkL.</li>
</ol>
3. Odczyt linii bazowej, rozsiewanie komórek oraz pomiar i wizualizacja impedancji komórek
<ol>
	<li>Zmierz odczyt linii bazowej, klikając przycisk Start stacji dokującej. Linię bazową należy odczytać po wstępnej inkubacji płytek przez 1 godzinę w kołysce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym w warunkach hodowli w inkubatorze CO2 oraz przed wysiewem komórek do odpowiednich studzienek w górnej komorze. 
	nuta: Po kliknięciu przycisku Start podstawki jednostka sterująca zapyta, czy zapisać plik eksperymentalny. Po zapisaniu pliku analizator stacji dokującej mierzy impedancję ogniwa linii bazowej zgodnie z początkowym ustawieniem w programie i przechodzi w tryb pauzy do momentu ponownego kliknięcia przycisku Start stacji dokującej w celu zmierzenia impedancji komórki w drugim kroku.</li>
	<li>Po pomiarze podstawowym wyjąć obie płytki do migracji i inwazji z kołysek i przechowywać je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Zasiać 100 μl komórek (100 000 komórek) w poczwórnych duplikatach dla każdego stanu biologicznego w górnej komorze płytki CIM w odpowiednich dołkach, zgodnie z programowaniem w jednostce sterującej kołyski, poprzez odwrotne pipetowanie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Po wysianiu trzymaj płytkę pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby komórki równomiernie opadły na dno. Przenieś płytkę z powrotem do odpowiedniej podstawki i kliknij przycisk start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa zgodnie z programem w drugim kroku 2.5.</li>
	<li>Po ostatnim zamiataniu eksperyment zostaje zakończony, a wyniki są zapisywane automatycznie.</li>
	<li>Na karcie Analiza danych wizualizuj zmiany impedancji komórek jako indeks komórek w sposób zależny od czasu w trakcie lub po zakończeniu eksperymentu. Każdy z odpowiednich warunków poczwórnych duplikatów może być wizualizowany indywidualnie lub jako średnie i/lub odchylenia standardowe, klikając pola Opcje dla średniej i odchylenia standardowego.</li>
	<li>Aby wyeksportować dane indeksu komórek do pliku arkusza kalkulacyjnego, otwórz pusty plik arkusza kalkulacyjnego, umieść kursor na środku okna Analiza danych i kliknij prawym przyciskiem myszy. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję Kopiuj dane do formatu listy i wklej dane do otwartego arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Dostosuj czas w surowych danych, aby reprezentował rzeczywisty czas rozpoczęcia pomiaru impedancji ogniwa. Czas rozpoczęcia drugiego kroku jest ustawiony na zero. 
	nuta: Jednostka sterująca ma możliwość uzyskania indeksu komórek z normalizacją lub bez niej (tj. znormalizowanego indeksu komórki) i wizualizacji wyników w formie prezentacji graficznej w sposób zależny od czasu. W tym przykładzie dane indeksu komórek są eksportowane bez normalizacji w celu przetworzenia i prezentacji graficznej.</li>
	<li>Zwolnij eksperyment, klikając przycisk Zwolnij w każdej kołysce.</li>
</ol>

<ol><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+%28Crk%29+and+Crk-like+%28CrkL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a%2Fb+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration%2C+invasion%2C+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li>
<li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646(2017).</li>
<li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li>
<li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74(2012).</li>
<li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li>
<li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li>
<li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li>
<li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li>
<li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li>
<li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym jest prostym, szybkim i ciągłym procesem monitorowania z wieloma istotnymi zaletami w porównaniu z tradycyjnymi metodami, które dostarczają dane w jednym punkcie czasowym. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych metod, warunki eksperymentalne muszą być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej dla systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, ponieważ każda linia komórkowa może różnić się pod względem adhezj...

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie genotypów i fenotypów nowotworów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i zaprojektowania skutecznych strategii terapeutycznych. Dziesięciolecia badań nad rakiem doprowadziły do opracowania i dostosowania różnych metod określania genotypów i fenotypów raka. Jednym z najnowszych osiągnięć technicznych jest pomiar migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym na podstawie impedancji komórek. Adhezja komórek do substratów i kontakty komórka-komórka odgrywają ważną rolę w komunikacji i regulacji między komórkami, rozwoju i utrzymaniu tkanek. Nieprawidłowości w adhezji komórek prowadzą do utraty kontaktu komórka-komórka, degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz uzyskania zdolności migracyjnych i inwazyjnych przez komórki, z których wszystkie przyczyniają się do przerzutów komórek nowotworowych do różnych narządów1,2. Dostępne są różne metody określania migracji komórek (gojenie ran i testy w komorze Boydena) oraz inwazji (test w komorze Matrigel-Boyden)3,4,5. Te konwencjonalne metody są półilościowe, ponieważ komórki muszą być znakowane barwnikiem fluorescencyjnym lub innymi barwnikami przed lub po eksperymencie w celu zmierzenia fenotypów komórek. Ponadto w niektórych przypadkach konieczne są zakłócenia mechaniczne w celu utworzenia rany w celu pomiaru migracji komórek do miejsca rany. Co więcej, te istniejące metody są czasochłonne, pracochłonne i mierzą wyniki tylko w jednym punkcie czasowym. Ponadto metody te są podatne na wykonywanie niedokładnych pomiarów z powodu niespójnej obsługi podczas procedury eksperymentalnej6.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, system analizy komórek w czasie rzeczywistym mierzy impedancję komórek w czasie rzeczywistym, bez konieczności wstępnego lub końcowego barwienia i mechanicznego uszkadzania komórek. Co ważniejsze, czas trwania eksperymentu można wydłużyć, tak aby efekty biologiczne można było określić w sposób zależny od czasu. Przeprowadzenie eksperymentu jest efektywne czasowo i nie jest pracochłonne. Analiza danych jest stosunkowo prosta i dokładna. W porównaniu z innymi metodami, ta metoda jest jednym z najlepszych pomiarów w czasie rzeczywistym do pomiaru migracji i inwazji komórek6,7,8,9.
Giaever i Keese jako pierwsi opisali oparty na impedancji pomiar populacji komórek na powierzchni elektrod10. System analizy komórek w czasie rzeczywistym działa na tej samej zasadzie. Powierzchnia każdej studzienki mikropłytki jest w około 80% pokryta układem złotych mikroelektrod. Gdy powierzchnia elektrody jest zajęta przez ogniwa z powodu przylegania lub rozprzestrzeniania się ogniw, zmienia się impedancja elektryczna. Impedancja ta jest wyświetlana jako indeks ogniwa, który jest wprost proporcjonalny do ogniw pokrywających powierzchnię elektrody po przeniknięciu przez błonę mikroporowatą (mediana wielkości porów tej membrany wynosi 8 μm)<klasa sup = "xref">11.
Crk i CrkL są białkami adaptorowymi zawierającymi domeny SH2 i SH3 i odgrywają ważne role w różnych funkcjach komórkowych, takich jak regulacja cytoszkieletu, transformacja komórki, proliferacja, adhezja, przejście nabłonkowo-mezenchymalne, migracja, inwazja i przerzuty, pośrednicząc w interakcjach białko-białko w wielu szlakach sygnałowych1,12,13,14,15,16,17,18. Dlatego ważne jest, aby określić zależne od CRK / CrkL zdolności migracyjne i inwazyjne komórek nowotworowych. Przeprowadzono analizę komórek w czasie rzeczywistym w celu określenia zdolności migracyjnych i inwazyjnych komórek glejaka po knockknocku genów Crk i CrkL.
Ten artykuł metodyczny opisuje szczegółowe pomiary migracji i inwazji ludzkich komórek glejaka za pośrednictwem Crk i CrkL.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1300 Series Class II, typ A2</td><td></td></tr><tr><td>Płytki CIM</td><td>Dział Analizy Komórek Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>Płytki do inwazji i migracji komórek</td></tr><tr><td>Crk siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>J-010503-10</td><td></td></tr><tr><td>CrkL siRNA</td><td>Ambion</td><td>ID: 3522 i ID: 3524</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany orzeł" s pożywka (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>Pożywka hodowlana używana do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS używany do płukania komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Heracell VIOS 160i CO2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030285</td><td>CO2 inkubator</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>System elektroporacji neonowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>System do elektroporacji</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 &micro; Zestaw L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>Zestaw do elektroporacji</td></tr><tr><td>Nieukierunkowane siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-01</td><td>siRNA do kontroli bez targacji</td></tr><tr><td>Odyssey CLx (system obrazowania)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>System obrazowania Western blot</td></tr><tr><td>Oprogramowanie RTCA</td><td>Dział Analizy Komórek firmy Agilent Technologies, Inc</td><td></td><td>Instrument używany do eksperymentu</td></tr><tr><td>Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>Ręczny automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>U-118MG</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB15</td><td>Linie komórkowe używane do eksperymentów</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>Przyrząd używany do eksperymentów</td></tr></tbody></table>

oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Rak powstaje w wyniku niekontrolowanej proliferacji komórek zainicjowanej przez niestabilność genetyczną, mutacje oraz czynniki środowiskowe i inne czynniki stresowe. Te nabyte nieprawidłowości w złożonych, wielowarstwowych molekularnych sieciach sygnalizacyjnych indukują nieprawidłową proliferację i przeżycie komórek, degradację macierzy zewnątrzkomórkowej i przerzuty do odległych narządów. Szacuje się, że około 90% zgonów związanych z rakiem jest spowodowanych bezpośrednimi lub pośrednimi skutkami rozsiewu przerzutów. Dlatego ważne jest, aby ustanowić wysoce niezawodny, kompleksowy system charakteryzujący zachowania komórek nowotworowych po manipulacjach genetycznych i środowiskowych. Taki system może dać jasne zrozumienie molekularnej regulacji przerzutów nowotworowych i szansę na pomyślne opracowanie stratyfikowanych, precyzyjnych strategii terapeutycznych. W związku z tym dokładne określenie zachowań komórek nowotworowych, takich jak migracja i inwazja ze wzrostem lub utratą funkcji genu (genów), pozwala na ocenę agresywnej natury komórek nowotworowych. System pomiaru w czasie rzeczywistym oparty na impedancji ogniw umożliwia naukowcom ciągłe pozyskiwanie danych podczas całego eksperymentu oraz natychmiastowe porównywanie i ilościowe określanie wyników w różnych warunkach eksperymentalnych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, ta metoda nie wymaga utrwalania, barwienia i przetwarzania próbek w celu analizy komórek, które migrują lub atakują. W artykule położono nacisk na szczegółowe procedury określania w czasie rzeczywistym migracji i inwazji komórek nowotworowych glejaka.

Sugerowano, że Crk i CrkL są istotne dla migracji i inwazji komórek w różnych liniach komórkowych nowotworów13,17. Chociaż białka Crk i CrkL są strukturalnie i funkcjonalnie podobne i pełnią istotne, nakładające się funkcje16,19,20,21, wiele badań nad wyciszaniem genów Crk i CrkL nie rozstrzygnęło jednoznacznie, czy wyciszenie jest spec...

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Korzystając z tego protokołu, migracja i inwazja komórek może być ujawniana w warunkach czasu rzeczywistego, co umożliwia określenie kinetyki komórek w przypadku utraty lub wzmocnienia funkcji genów i leków. W przeciwieństwie do innych metod, nie jest potrzebne barwienie, mechaniczne uszkodzenie komórek ani markery fluorescencyjne. Co najważniejsze, kinetykę ogniw w czasie rzeczywistym można określić w skuteczny sposób.Gdy hodowla linii komórkowej U-118MG osiągnie zbieżność od 70 do 80%, umyj komórki PBS przed potraktowaniem komórek dwoma mililitrami 0,5% trypsyny-EDTA. Po 30 sekundach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję z 10 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po zliczeniu zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu sześć razy od 10 do piątej komórki na warunek w odpowiedniej objętości świeżej pożywki.Przenieś sześć razy po 10 do piątej komórki do jednej probówki mikrowirówkowej na warunek i dodaj 800 mikrolitrów PBS firmy Dulbecco do każdej probówki. Po odwirowaniu ponownie zawieś każdą osadkę w 60 mikrolitrach buforu do reprodukcji zawiesiny R i sześciu mikromolach int

impedance-based-real-time-measurement-cancer-cell-migration

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Ten film opisuje test inwazji przy użyciu trzykomorowej matrycy opartej na impedancji elektrycznej. Technika ta mierzy potencjał inwazyjny komórek nowotworowych pod wpływem rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez rezydentne komórki zrębu w mikrośrodowiskach guza.

Trójkomorowy test impedancji oparty na układzie: technika analizy w czasie rzeczywistym do oceny potencjału inwazyjnego komórek rakowych poprzez pomiar impedancji elektrycznej

Źródło: Mudduluru, G.,  et. al. Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia test oparty na impedancji do pomiaru inwazji i migracji komórek glejaka. Komórki degradują macierz zewnątrzkomórkową, przemieszczają się przez mikroporowate błony i przylegają do elektrod, generując impedancję. Ta analiza w czasie rzeczywistym odzwierciedla ich potencjał inwazyjny w zastosowaniach badawczych nad rakiem.

Pomiary inwazji komórek raka mózgu oparte na impedancji

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

Poznaj metodę pomiaru migracji i inwazji komórek glioblastomy U-118MG w czasie rzeczywistym bez barwienia. Ta technika pozwala ocenić kinetykę komórkową i efekty leczenia w sposób nieinwazyjny.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów