Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Korzystając z tego protokołu, migracja i inwazja komórek może być ujawniana w warunkach czasu rzeczywistego, co umożliwia określenie kinetyki komórek w przypadku utraty lub wzmocnienia funkcji genów i leków. W przeciwieństwie do innych metod, nie jest potrzebne barwienie, mechaniczne uszkodzenie komórek ani markery fluorescencyjne. Co najważniejsze, kinetykę ogniw w czasie rzeczywistym można określić w skuteczny sposób.

Gdy hodowla linii komórkowej U-118MG osiągnie zbieżność od 70 do 80%, umyj komórki PBS przed potraktowaniem komórek dwoma mililitrami 0,5% trypsyny-EDTA. Po 30 sekundach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję z 10 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po zliczeniu zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w stężeniu sześć razy od 10 do piątej komórki na warunek w odpowiedniej objętości świeżej pożywki.

Przenieś sześć razy po 10 do piątej komórki do jednej probówki mikrowirówkowej na warunek i dodaj 800 mikrolitrów PBS firmy Dulbecco do każdej probówki. Po odwirowaniu ponownie zawieś każdą osadkę w 60 mikrolitrach buforu do reprodukcji zawiesiny R i sześciu mikromolach interesującego nas siRNA. Wymieszaj każdą probówkę, delikatnie stukając, a następnie poddaj elektroryfikacji 10 mikrolitrów podwielokrotności każdej zawiesiny komórek trzema 10-milisekundowymi impulsami o napięciu 1,350 woltów.

Po każdym zabiegu połącz elektroporowane komórki z każdego stanu w pojedynczych pięciomililitrowych porcjach świeżej pożywki hodowlanej. Następnie zasiej komórki do dwóch 35-milimetrowych szalek hodowlanych na każdy warunek i umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy dni. Pięć do sześciu godzin przed analizą komórek w czasie rzeczywistym umieść system analizy komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze hodowli komórkowych.

Aby skonfigurować test inwazji, użyj pipetowania wstecznego, aby umieścić 50 mikrolitrów DMEM uzupełnionych 0,1 mikrograma na mililitr żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w każdym dołku górnej komory płytki do inwazji komórek. Natychmiast po posiewie należy usunąć 30 mikrolitrów roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej z każdej studzienki i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na cztery godziny. Aby skonfigurować program pomiaru impedancji, sześć godzin przed pomiarem należy wymienić pożywkę we wszystkich elektroporowanych kulturach komórkowych na pożywkę o niskiej zawartości surowicy.

Na karcie Układ w powiązanym oprogramowaniu do pomiaru impedancji wybierz czterokrotnie zduplikowane studzienki dla każdego stanu biologicznego. Na karcie Harmonogram ustaw jednorazowy krok przemiatania pomiaru linii bazowej z jednominutowym interwałem i ustaw drugi krok, aby zmierzyć impedancję ogniw w odpowiednich indywidualnych kołyskach dla rzeczywistego eksperymentu. Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji komórek dodać 160 mikrolitrów pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą jako chemoatraktantem do studzienek dolnej komory płytki inwazji i migracji komórek.

Aby zmierzyć inwazję, zmontuj górną komorę zawierającą studzienki pokryte żelem macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby zmierzyć migrację, użyj niepowlekanych studzienek w górnej komorze. W przypadku każdego rodzaju eksperymentu, należy napełnić studzienki w górnej komorze 50 mikrolitrami pożywki o niskiej surowicy i umieścić komory w kołysce systemu.

Kliknij kartę Komunikat w oprogramowaniu, aby określić, czy wszystkie studzienki są rozpoznawane przez jednostkę sterującą. Jeśli komunikat zostanie wyświetlony zgodnie z oczekiwaniami, oznacza to, że płytka w podstawce jest gotowa do eksperymentu. Następnie umieść całkowicie zapakowane płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w kołysce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym na jedną godzinę, aby zaaklimatyzować płytkę do warunków hodowli komórkowej.

Podczas gdy płytki równoważą się, zbierz komórki glejaka, jak pokazano, i ponownie zawieś komórki z każdego stanu w ilości osiem razy 10 do piątej komórki na 800 mikrolitrów niskiego stężenia pożywki w surowicy. Dodatkowo odłóż trzy razy 10 do piątej komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej do wysiewu w 35-milimetrowym naczyniu do dalszej analizy Western blot. Aby zmierzyć bazowy odczyt przed migracją, po zakończeniu aklimatyzacji kliknij przycisk Start stacji dokującej.

Po uzyskaniu pomiaru podstawowego przenieś płytki migracyjne i inwazyjne z odpowiednich kołysek do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odwróć pipetę 100 mikrolitrów komórek do poczwórnych studzienek górnej komory dla każdego stanu biologicznego w odpowiednim dołku płytek do inwazji i migracji komórek, zgodnie z programem w jednostce sterującej kołyski. Po wysianiu trzymaj płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby komórki mogły równomiernie osiąść na dnie płytki przed przeniesieniem płytek do odpowiednich kołysek.

Kliknij przycisk Start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa. Aby zobrazować zmiany impedancji komórki jako indeks komórki w sposób zależny od czasu w trakcie lub po zakończeniu eksperymentu, otwórz kartę Analiza danych. Aby wyświetlić dane dla każdego z odpowiednich warunków osobno lub jako średnie i/lub odchylenia standardowe, kliknij pola opcji dla średniej i odchylenia standardowego.

Aby wyeksportować dane indeksu komórki do pliku arkusza kalkulacyjnego, umieść kursor na środku okna analizy danych i kliknij prawym przyciskiem myszy. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję skopiuj dane do formatu listy i wklej dane do otwartego arkusza kalkulacyjnego. Aby zwolnić eksperyment, kliknij przycisk Zwolnij w każdej kołysce.

Knockdown białka adapterowego Crk obniża poziom białka Crk1 i Crk2 odpowiednio o 85% i 86%, nie indukując poziomów białka podobnego do Crk. Knockdown Crk-like zmniejsza ekspresję białka podobnego do Crk o 85% przy niewielkim zmniejszeniu poziomu białka Crk1 i Crk2. Połączenie obu siRNA zmniejsza ekspresję Crk1, Crk2 i podobną do Crk o ponad 80%, podczas gdy żadna kombinacja knockdownu podobnego do Crk lub Crk nie ma wpływu na ekspresję Winkuliny ani alfa-tubuliny.

Komórki glejaka wielopostaciowego ludzkiego mózgu migrują wzdłuż gradientu w odpowiedzi na wysokie stężenia w surowicy, osiągając maksymalny poziom migracji po 13 godzinach. W komórkach knockdown Crk, chociaż migracja jest początkowo opóźniona, komórki kontynuowały migrację do 23 godzin. Nokaut podobny do Crk znacznie zmniejsza migrację komórek, przy czym linia komórkowa glejaka całkowicie traci swoją zdolność migracyjną po knockdown zarówno Crk, jak i Crk-like, co sugeruje, że Crk i Crk-like odgrywają zasadnicze nakładające się role w migracji komórek rakowych.

Jednakże, gdy inwazja komórek jest monitorowana przez kilka dni, komórki knockdown Crk osiągają podobny maksymalny poziom inwazji komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi glejaka po 60 godzinach, przy czym komórki podobne do Crk częściowo odzyskują swoją zdolność inwazyjną po 90 godzinach, a podwójne komórki Crk-Crk wykazują zmniejszoną zdolność do inwazji po 40 godzinach. Wyniki jednoznacznie potwierdzają sugestię, że inwazja komórek powinna być analizowana przez cały okres trwania eksperymentu. Wysiewanie odpowiedniej liczby komórek i unikanie pęcherzyków powietrza podczas rejestrowania macierzy zewnątrzkomórkowej do testu inwazji i wysiewu komórek to kluczowe punkty powodzenia tego eksperymentu.

Postępując zgodnie z podobną procedurą, ale przy użyciu e-płytek, można określić adhezję komórek i kinetykę proliferacji komórek.