Name: Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę 3D sferoidową do badania inwazji glejaka wielopostaciowego w tkance mózgu. Technika ta pozwala na dokładną ocenę efektów leków i zachowania komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon jest stypendystą Szpitala Uniwersyteckiego w Tuluzie (CHU Toulouse).

Uzyskano świadomą pisemną zgodę od wszystkich pacjentów (ze Szpitala Haukeland, Bergen, Norwegia zgodnie z lokalnymi przepisami komisji etyki). Nasz protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach w naszej instytucji. 
1. Generowanie sferoidów guza o jednakowej wielkości
UWAGA: Komórki macierzyste są hodowane w pożywce neurobazalnej uzupełnionej suplementem B27, heparyną, FGF-2, penicyliną i streptomycyną, jak opisano w poprzednich artykułach12. Komórki te spontanicznie tworzą sferoidy w hodowli.
<ol>
	<li>Przemyć komórki nowotworowe 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować komórki z 0,5-1 ml enzymu dysocjacyjnego (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć 4-4,5 ml PBS i dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej (kompletna pożywka nerwowo-podstawowa, cNBM).</li>
	<li>Policzyć komórki przy użyciu techniki automatycznego liczenia z błękitem trypanowym i szkiełkiem komory do liczenia komórek.</li>
	<li>Aby wygenerować 100 sferoid z 104 komórkami na sferoidę (w zależności od preferowanej wielkości), wymieszaj 106 komórek w 8 ml NBM z 2 ml 2% metylocelulozy.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do sterylnego pojemnika systemowego i dozować 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej do 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%. Utworzą się sferoidy o równej wielkości i można je użyć po 3-4 dniach.</li>
</ol>
2. Eksperymenty trójwymiarowe
<ol>
	<li>proliferacja
	<ol>
		<li>preparat
		<ol>
			<li>Zawiesić inhibitory (np. rotenon jak w <klasa silna = "xfig" >Rysunek 4A) i chemikalia w 100 μl pożywki i dodać do 100 μl pożywki w każdym dołku (tj. jeden sferoid na studzienkę).</li>
			<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Akwizycja i analiza obrazu
		<ol>
			<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu wideo w jasnym polu, aby stworzyć serię warunków przy T0 i oczekiwanych czasach.</li>
			<li>Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby zrobić to ręcznie, narysuj okrąg wokół rdzenia sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz powierzchnię każdej sferoidy. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, należy użyć makra pokazanego w dokumencie uzupełniającym 1 tylko z //Obszarem podstawowym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>inwazja
	<ol>
		<li>preparat
		<ol>
			<li>Przygotuj matrycę kolagenową w probówce na lodzie z kolagenem typu I o stężeniu końcowym 1 mg/ml, 1x PBS,kolagenem 0,023xV, 1 M wodorotlenkiem sodu i sterylnymH2O. Inkubuj roztwór na lodzie przez 30 minut.</li>
			<li>Zebrać sferoidy z okrągłej płytki dołka do probówek o pojemności 500 μl i przemyć 2x 200 μl 1x PBS.</li>
			<li>Ostrożnie odpipetować sferoidy do 100 μl matrycy kolagenowej i włożyć do środka studzienki do normalnych 96-dołkowych płytek.</li>
			<li>Inkubować żel kolagenowy przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać cNBM na wierzch żelu. Na tym etapie do pożywki można dodać inhibitory lub aktywatory (np. chlorowodór, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 4B, 4C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Akwizycja i analiza obrazu
		<ol>
			<li>Rób zdjęcia sekwencyjnie za pomocą mikroskopu wideo w trybie jasnego pola 24 godziny po włączeniu kolagenu.</li>
			<li>Użyj Fidżi do analizy zdjęć ręcznie lub w sposób półautomatyczny. Aby to zrobić ręcznie, narysuj wokół rdzenia i całkowitego obszaru sferoidy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i zmierz obszar inwazyjny każdej sferoidy, odejmując całkowitą powierzchnię od powierzchni rdzenia. Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, należy użyć makra wskazanego w dokumencie uzupełniającym 1 w celu określenia obszaru inwazyjnego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>migracja
	<ol>
		<li>preparat
		<ol>
			<li>Pokryć 6-dołkową płytkę Matrigelem (0,2 mg/ml) w NBM przez 30 minut w temperaturze 37 °C, następnie wyjąć Matrigel i dodać 2 ml cNBM.</li>
			<li>Przenieść sferoidy do 50 μl cNBM z płytki dołkowej z okrągłym dnem na płytkę 6-dołkową.</li>
			<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i odczekać 30 minut, aż sferoidy się przylgną.</li>
			<li>Po 24 godzinach inkubacji wybarwić 10 ng/ml Hoechst i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Akwizycja i analiza obrazu
		<ol>
			<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu wideo w jasnym polu. Laser o długości fali 405 nm służy do wizualizacji barwienia metodą Hoechst.</li>
			<li>Użyj oprogramowania Fidżi, aby przeanalizować zdjęcia i uruchomić makro, jak wskazano w dokumencie uzupełniającym 1. 
			UWAGA: Dotknięcie dna studzienki lub całkowite usunięcie supernatantu uszkadza sferoidy. W przypadku obchodzenia się z żelem kolagenowym typu I należy trzymać żel na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji kolagenu, nie dodawać składnika kwaśnego, ponieważ zmiana pH wpłynie na zwartość żelu i szybko pipetować komórki do kolagenu, aby zapobiec śmierci komórek i degradacji żelu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Makro Fidżi
UWAGA: Fidżi to program do analizy obrazów opracowany w domenie publicznej, który pozwala na rozwój makr przyspieszających analizę obrazów. Możliwa jest również ręczna analiza, ale jest to powolny proces i może wprowadzać błędy systematyczne. Obrazy można importować metodą "przeciągnij i upuść" w oprogramowaniu i określać ilościowo za pomocą wtyczki ROI Manager Tools. Procedura zastosowana w tym badaniu została opisana poniżej:
<ol>
	<li>Otwórz okno makra: Wtyczki | Makra | Interaktywny tłumacz.</li>
	<li>Skopiuj i wklej następującą dostosowaną fioletową pętlę. Zachowaj fioletowe zdania i dodaj zielone zdania, które Cię interesują (Dokument uzupełniający 1).</li>
	<li>Aby przeanalizować całą serię, dostosuj parametry w kolorze czerwonym dla określonej kwantyfikacji i uruchom makro za pomocą punktu menu Makra | Uruchom makro lub naciśnij Ctrl+R.</li>
	<li>Sprawdź i, jeśli to konieczne, ręcznie dostosuj obszar zainteresowania (ROI).</li>
</ol>
4. Mikroskopia elektronowa sferoid
UWAGA: Większość z poniższych kroków musi być wykonana w okapie chemicznym.
<ol>
	<li>Etap mocowania
	<ol>
		<li>Zebrać sferoidę za pomocą przeciętej końcówki pipety, umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml i przemyć 1x 0,1 M buforem fosforanowym (PB).</li>
		<li>Utrwalić sferoidę przez noc w temperaturze 4 °C w 2% aldehydzie glutarowym/2% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M PB.</li>
		<li>Zastąp roztwór utrwalający roztworem 1% PFA w 0,1 M PB, a następnie przygotuj próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Przenieś sferoidy do sitka i umieść je w szklanej zlewce, aby uniknąć uszkodzenia sferoidów.</li>
		<li>Ostrożnie umyć 3x 0,1 M PB.</li>
		<li>Inkubować z osmem przez 2 godziny w ciemności. Rozcieńczyć osm do 4% w 1% buforze 0,1 M PB.</li>
		<li>Ostrożnie umyć 3x 0,1 M PB.
		<ol>
			<li>Odwodnić w następujący sposób: moczyć w 50% etanolu przez 10 min, 70% etanolu przez 10 min, 2x 90% etanolu przez 15 min, 2x 100% etanolu przez 20 min i 2x acetonie przez 30 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Próbki należy inkubować w mieszaninie acetonu i żywicy w proporcji 50/50 przez 2 godziny. Na tym etapie przygotuj żywicę EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).</li>
		<li>Wyrzuć mieszaninę acetonu i żywicy, zastąp świeżo przygotowaną żywicą i inkubuj przez noc.</li>
		<li>Wymień żywicę na nową i inkubuj przez 2-6 godzin.</li>
		<li>Dodaj sferoidy w żywicy do formy w temperaturze 60 °C przez 48-72 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Testy sferoidalne guza są dobrze przystosowane do badania cech guza, w tym proliferacji, inwazji i migracji, a także śmierci komórki i odpowiedzi na lek. Komórki rakowe atakują macierz 3D, tworząc inwazyjny mikroguz, jak widać na rycinie 4B,C. Podczas procesu inwazyjnego metaloproteinazy macierzy (MMP) trawią matryce otaczające komórki nowotworowe13, a inhibitory MMP (np. GM6001 lub Rebimastat) mogą upośledzać inwazję komórek, ale nie migrację<sup cla...

W większości badań z wykorzystaniem pierwotnych lub komercyjnie dostępnych linii komórkowych, testy są przeprowadzane na komórkach hodowanych na powierzchniach plastikowych jako hodowle jednowarstwowe. Zarządzanie hodowlą komórkową w 2D ma wady, ponieważ nie naśladuje środowiska komórkowego 3D in vivo. W hodowlach 2D cała powierzchnia komórki jest w bezpośrednim kontakcie z pożywką, co zmienia wzrost komórek i modyfikuje dostępność leków. Co więcej, niefizjologiczna powierzchnia z tworzywa sztucznego wyzwala różnicowanie komórek1. Aby przezwyciężyć te trudności, opracowano trójwymiarowe modele hodowli. Mają one tę zaletę, że naśladują wielokomórkową architekturę i heterogeniczność nowotworów2, a zatem mogą być uważane za bardziej odpowiedni model dla guzów litych3. Złożona morfologia sferoid przyczynia się do lepszej oceny penetracji i oporności leków4. Niejednorodność guza w sferoidzie wpływa na dyfuzję tlenu i składników odżywczych oraz odpowiedź na środki farmakologiczne (ryc. 1A). Dyfuzja tlenu zmienia się, gdy rozmiar sferoidy osiąga 300 μm, wywołując niedotlenienie środowiska w środku sferoidy (ryc. 1A,C). Metabolity są również mniej przenikające przez warstwy komórkowe i zachodzą kompensacyjne reakcje metaboliczne5. Gdy średnica sferoidy wzrasta, można zaobserwować nekrotyczne rdzenie, co dodatkowo naśladuje cechy występujące w wielu litych nowotworach, w tym w agresywnym glejaku mózgu (GBM)6.
Kilka testów inwazji 2D lub 3D na glejaka zostało zgłoszonych w literaturze7,8. Testy dwuwymiarowe służą głównie do badania inwazji w płaszczyźnie poziomej na cienkiej warstwie matrycy lub w teście komorowym Boydena9. Testy trójwymiarowe zostały opisane za pomocą hodowli sferoidalnych 3D przy użyciu klasycznych linii komórkowych glejaka10. Bardziej złożone warianty są reprezentowane przez inwazję organoidów mózgowych przez sferoidy nowotworowe w kulturach konfrontacji11. Jednak nadal ważne jest, aby opracować łatwy w użyciu i powtarzalny test dostępny dla każdego laboratorium. Opracowaliśmy protokół generowania komórek macierzystych podobnych do glejaka z próbek pobranych od pacjentów. Kwantyfikacja tych testów jest łatwa do opanowania i wymaga jedynie otwartego oprogramowania online. Krótko mówiąc, kawałki guza są cięte na małe kawałki i trawione enzymatycznie. Pojedyncze komórki pochodzące z trawienia są hodowane w pożywce neurobazalnej. Po 4-7 dniach spontanicznie tworzą się struktury sferoidalne. Po implantacji wewnątrzczaszkowej w modelach mysich tworzą one guzy wykazujące martwiczy rdzeń otoczony komórkami pseudo-palisadowymi12. Jest to bardzo podobne do cech występujących u pacjentów z GBM.
W tym artykule opisujemy nasz protokół wytwarzania sferoidów z określonej liczby komórek, aby zapewnić odtwarzalność. W tym celu można zastosować dwie komplementarne matryce: Matrigel i kolagen typu I. Matrigel jest wzbogacony w czynniki wzrostu i naśladuje błonę podstawną ssaków niezbędną do przyłączania i migracji komórek. Z drugiej strony kolagen typu I, element strukturalny zrębu, jest najczęstszą fibrylarną macierzą zewnątrzkomórkową i jest stosowany w testach inwazji komórek. W tym miejscu ilustrujemy nasz model sferoidalny GBM, wykonując testy migracji i proliferacji. Analizę przeprowadzono nie tylko w ustalonych punktach czasowych, ale także poprzez monitorowanie ekspansji sferoidowej i ruchu komórek za pomocą obrazowania na żywo. Ponadto przeprowadzono mikroskopię elektronową w celu uwidocznienia szczegółów morfologicznych.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa płyta okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Przechowywana w temperaturze 4 stopni; C, enzym dysocjacji sfery</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C, rozmrozić przed użyciem</td></tr><tr><td>Szkiełka z komorą do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Służy do analizy zdjęć</td></tr><tr><td>Kolba 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &deg; C, rozcieńczony do końcowego stężenia 0,2 mg/ml w zimnym NBM</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Rozcieńczony w NBM dla 2% stężenia końcowego</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Penicylina - Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Trypan niebieski 0,4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Służy do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Typ I Kolagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Przechowywany w temperaturze 4 & stopni; Z</td></tr></tbody></table>

model sferoidalny 3d glejaka wielopostaciowego

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe nie naśladują w zadowalający sposób wzrostu guza in vivo. W związku z tym opracowano trójwymiarowe (3D) modele sferoidalne hodowli. Modele te mogą być szczególnie istotne w dziedzinie neuroonkologii. Rzeczywiście, guzy mózgu mają tendencję do atakowania zdrowego środowiska mózgu. Opisujemy tutaj idealny test 3D oparty na sferoidach glejaka, który opracowaliśmy do badania inwazji guza. Zapewniamy wszystkie szczegóły techniczne i narzędzia analityczne, aby z powodzeniem przeprowadzić ten test.

Sferoidy przygotowano zgodnie z opisem w sekcji protokołów, a następnie przeprowadzono obserwacje dotyczące migracji, inwazji, proliferacji oraz analizę mikroskopową. W celu pomiaru hipoksji w różnych obszarach struktury sferycznej zastosowano barwienie na anhydrazę węglanową IX do określenia aktywności hipoksycznej (Rycina 1A-C). W centrum sferoidu zaobserwowano więcej komórek dodatnich pod kątem CAIX (Rycina 1<...

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Dwuwymiarowe hodowle komórkowe nie naśladują odpowiednio wzrostu guza in vivo. Aby ulepszyć, opracowano procedury 3D wykorzystujące sferoidy. Nasz test sferoidy glejaka 3D jest szczególnie dobrze przystosowany do badania inwazji guza mózgu do zdrowego środowiska guza mózgu.Trójwymiarowe modele hodowli mogą być wykorzystane do podsumowania wielokomórkowej architektury, heterogeniczności i stanu metabolicznego nowotworów, co pozwala na bardziej rygorystyczną ocenę działania leków. Należy pamiętać, aby nie dotykać dna studzienki ani całkowicie usunąć supernatant, utrzymywać żel na lodzie i szybko dodać komórki do żelu. Aby wygenerować sferoidy guza o jednolitej wielkości, najpierw umyj interesującą nas hodowlę komórek nowotworowych pięcioma mililitrami PBS i potraktuj komórki 0,5 do jednego mililitra enzymu dysocjacyjnego.Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję za pomocą czterech do 4,5 mililitra PBS i przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do 6 komórek na osiem mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej uzupełnionej dwo

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje, jak glejaki, pochodzące z guzów mózgu, są rozdzielane na pojedyncze komórki i zamykane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego. Proces ten sprzyja interakcjom komórka-komórka, tworząc ustrukturyzowany, trójwymiarowy model glejaka.

Hydrożel na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Embriony piskląt są używane do badania ludzkich guzów mózgu z glejakiem (GBM) in ovo i w kokulturach ex vivo. Zachowanie komórek GBM można rejestrować za pomocą mikroskopii poklatkowej w kokulturach ex vivo, a oba preparaty można analizować w eksperymentalnym punkcie końcowym za pomocą szczegółowej analizy konfokalnej 3D.

Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj metodę 3D sferoidową do badania inwazji glejaka wielopostaciowego w tkance mózgu. Technika ta pozwala na dokładną ocenę efektów leków i zachowania komórek nowotworowych.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Przeglądaj więcej filmów