Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego
9 kwietnia 2020
Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.
Dwuwymiarowe hodowle komórkowe nie naśladują odpowiednio wzrostu guza in vivo. Aby ulepszyć, opracowano procedury 3D wykorzystujące sferoidy. Nasz test sferoidy glejaka 3D jest szczególnie dobrze przystosowany do badania inwazji guza mózgu do zdrowego środowiska guza mózgu.
Trójwymiarowe modele hodowli mogą być wykorzystane do podsumowania wielokomórkowej architektury, heterogeniczności i stanu metabolicznego nowotworów, co pozwala na bardziej rygorystyczną ocenę działania leków. Należy pamiętać, aby nie dotykać dna studzienki ani całkowicie usunąć supernatant, utrzymywać żel na lodzie i szybko dodać komórki do żelu. Aby wygenerować sferoidy guza o jednolitej wielkości, najpierw umyj interesującą nas hodowlę komórek nowotworowych pięcioma mililitrami PBS i potraktuj komórki 0,5 do jednego mililitra enzymu dysocjacyjnego.
Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję za pomocą czterech do 4,5 mililitra PBS i przenieś oderwane komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 10 mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do 6 komórek na osiem mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej uzupełnionej dwoma mililitrami o stężeniu 2% metylocelulozy i przenieść zawiesinę do sterylnego pojemnika systemowego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej i umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do czterech dni.
Aby przeprowadzić test inwazji, gdy komórki nowotworowe utworzą sferoidy o jednolitej wielkości, przenieś każdą strukturę komórkową do probówki o pojemności 500 mikrolitrów i przemyj sferoidy raz 200 mikrolitrami PBS. Po drugim płukaniu ostrożnie przenieś sferoidy do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanej matrycy kolagenowej i dodaj każdą zawiesinę sferoidalną do środka każdej studzienki 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj 100 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej na wierzch żelu w każdym dołku.
Pamiętaj, aby umieścić wszystkie sferoidy w środku każdej studzienki, aby uzyskać najlepsze obrazowanie inwazji komórek nowotworowych. Aby przeprowadzić test migracji, gdy komórki nowotworowe utworzą sferoidy o jednolitej wielkości, pokryj sześciodołkową płytkę 0,2 miligrama na mililitr Matrigelu w pożywce wzrostowej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji usunąć Matrigel i dodać dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
Przenieść sferoidy z okrągłej płytki dolnej w objętości 50 mikrolitrów do indywidualnych dołków sześciodołkowej płytki i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia zabarwić sferoidy 10 nanogramami na mililitr Hoechst przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu uzyskania obrazu po teście inwazji lub migracji, umieść płytkę na stoliku mikroskopu konfokalnego Brightfield wyposażonego w kamerę wideo i uzyskaj obrazy w odpowiednim okresie eksperymentalnym.
Aby przeanalizować obrazy w sposób półautomatyczny, zaimportuj obrazy do Fidżi i kliknij Wtyczki, Makra, Interaktywny interpreter. Skopiuj i wklej dostosowaną fioletową pętlę. Zachowaj fioletowe zdania i w razie potrzeby dodaj interesujące Cię zielone zdania.
Następnie, aby zmierzyć powierzchnię każdej sferoidy, kliknij przycisk Analizuj i mierz. Aby zmierzyć niedotlenienie w różnych obszarach struktury sferycznej, można zastosować barwienie anhydrazą węglanową IX w celu określenia aktywności hipoksji. W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano więcej komórek dodatnich anhydrazy węglanowej IX w centrum sferoidalnym.
Niedotlenione komórki znajdujące się w rdzeniu sferoidalnym są zwykle bardziej glikolityczne niż komórki otaczające rdzeń. Mitochondria można obrazować za pomocą mikroskopii elektronowej w celu dalszej analizy. Średnica sferoidy jest bezpośrednio skorelowana z gęstością komórek, które tworzą strukturę komórkową 3D, a makra Fidżi mogą być używane do ilościowego określania proliferacji, inwazji lub migracji komórek w obrębie każdej sferoidy lub migracji komórek w obrębie każdej sferoidy.
Wzrost rdzenia sferoidalnego odzwierciedla stymulację proliferacji komórek. Po zahamowaniu kompleksu I mitochondrialnego łańcucha oddechowego, zdecydowana większość produkcji ATP w mitochondriach jest zagrożona, zmniejszając proliferację o 20% po 72 godzinach. Leczenie chlorowodorem zwiększa inwazję kolagenu typu I w ciągu 24 godzin, ale zmniejsza obszar migracji sferoidów 1,5-krotnie w porównaniu z kontrolnymi sferoidami nieleczonymi.
Jak oceniono za pomocą obrazowania na żywo, sferoidy wykazują wysoką dynamikę wewnętrzną i poruszają się szybko. Rozmiar sferoid powinien być względnie jednolity i należy zachować ostrożność, aby manipulować sferoidami do środka studzienek w celu uzyskania najlepszych wyników obrazowania. Metoda ta może być również stosowana do badania proliferacji, migracji i śmierci komórek nowotworowych, a także ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej, receptorów komórkowych lub białek wewnątrzkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania.
Sferoidy mogą być również zamknięte w kapsułkach, a wpływ zwiększonego napięcia powierzchniowego komórek można badać po wyjęciu kapsułek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia test inwazji oparty na trójwymiarowych sferoidach glejaka opracowany dla komórek macierzystych glejaka. Test ten umożliwia badanie inwazji guza do zdrowej tkanki mózgowej, zapewniając dokładniejszy model warunków in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe nie oddają efektywnie wzrostu guza in vivo.
- Modele hodowli 3D potrafią odtworzyć architekturę wielokomórkową i heterogenność nowotworu.
- Modele te pozwalają na lepszą ocenę wpływu leków na guzy.
- Glioblastoma jest wysoce agresywnym nowotworem mózgu o złym rokowaniu.
Cel badania
- Opracowanie łatwego w użyciu testu do badania inwazji glejaka wielopostaciowego.
- Dostarczenie metody ilościowego określania inwazji, migracji oraz proliferacji.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania glejaka wielopostaciowego w środowisku bardziej istotnym fizjologicznie.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie trójwymiarowych kultur sferoidów dla komórek glejaka wielopostaciowego.
- Wdrożenie makra w programie Fiji w celu przeprowadzenia kwantyfikacji.
- Staranne obchodzenie się z żelami i komórkami w celu zachowania integralności analizy.
- Przemywanie i traktowanie komórek enzymami dysocjującymi w celu formowania sferoidów.
Główne wyniki
- Test skutecznie naśladuje inwazję glejaka w zdrową tkankę mózgową.
- Metody ilościowe dostarczyły wiarygodnych danych na temat zachowania komórek.
- Hodowle 3D wykazały usprawnioną ocenę odpowiedzi na leki.
- W celu uzyskania spójnych wyników wygenerowano sferoidy o jednolitym rozmiarze.
Wnioski
- Opracowany test jest cennym narzędziem w badaniach nad glejakiem wielopostaciowym.
- Pozwala on na uzyskanie wglądu w mechanizmy naciekania nowotworu.
- Metodykę tę można dostosować do różnych warunków eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ten trójwymiarowy (3D) model sferoidów glejaka wielopostaciowego wypełnia krytyczną lukę w onkologii przedklinicznej, zapewniając fizjologicznie istotny system do badania inwazji nowotworu i odpowiedzi na leki. Umożliwia on bardziej predykcyjną ocenę kandydatów terapeutycznych w porównaniu z tradycyjnymi kulturami 2D, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach rozwoju leków w neuroonkologii. Test ten zwiększa ciągłość translacyjną, łącząc wyniki in vitro z interakcjami w mikrośrodowisku nowotworu przypominającym warunki in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów naciekania nowotworu i wyjaśnienie szlaków sygnałowych w trójwymiarowej architekturze wielokomórkowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez mierzalne odczyty naciekania i migracji sferoidów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność hipotez dotyczących celów terapeutycznych poprzez modelowanie efektów leków w systemie odpowiadającym chorobie, który odtwarza heterogeniczność nowotworu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia znormalizowane sferoidy o jednolitym rozmiarze, co umożliwia powtarzalny screening związków oraz ocenę odpowiedzi na dawkę.
- Wartość operacyjna: Umożliwia stosowanie przepływów pracy kompatybilnych z wysoką przepustowością przy użyciu płytek 96-dołkowych oraz półautomatyczną analizę obrazu za pomocą makr Fiji.
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe dane dotyczące proliferacji, inwazji i migracji, które wspierają walidację testu oraz powtarzalność między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje powstawanie niedotlenionego rdzenia oraz gradienty metaboliczne obserwowane w guzach pacjentów, zwiększając istotność biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia badania nad kokulturą stromy lub modulacją ECM w celu zbadania oddziaływań między guzem a stromą w kontrolowanym środowisku.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie danych o inwazji in vitro z profilowaniem skuteczności i bezpieczeństwa w fazie przedklinicznej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Analiza ta integruje się z procesem badawczym – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby do badań mechanistycznych i oceny fenotypowej przed badaniami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników napędzających inwazję oraz oddziaływań ze stromą w trójwymiarowym modelu glejaka wielopostaciowego.
- Przesiewanie: Umożliwia zestandaryzowaną, powtarzalną ocenę wpływu związków na rozmiar sferoidów, obszar inwazji oraz zdolność do migracji.
- Analityka: Dostarcza mierzalne parametry poprzez analizę obrazu (np. średnicę sferoidu, rdzeń hipoksyczny, front inwazyjny) w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie cech mikrośrodowiska guza, takich jak hipoksja i przebudowa ECM.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla glejaka wielopostaciowego i potencjalnie innych typów guzów OUN, ograniczając redundantny rozwój modeli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach inwazji nowotworowej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zstandaryzowanym protokołom tworzenia i obrazowania sferoidów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wcześniejsze i bardziej biologicznie miarodajne dane na temat skuteczności związków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w oparciu o analizę ryzyka, bazując na fenotypach inwazji i proliferacji w trójwymiarowym modelu choroby.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej 3D, technice sterylnej oraz mikroskopii konfokalnej w celu zapewnienia powtarzalności obchodzenia się ze sferoidami i ich obrazowania.
- Zależne od dostępu do macierzy kolagenowej, Matrigelu, enzymów dysocjujących oraz 2% metylocelulozy niezbędnych do formowania sferoidów i przeprowadzania testów inwazji.
- Wymaga ustandaryzowanych procedur analizy obrazu (np. makr w programie Fiji), aby zapewnić spójność ilościową wyników pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wymaga ścisłej kontroli temperatury i czasu podczas przygotowywania żelu oraz osadzania sferoidów w celu zachowania integralności testu.
- Ograniczone koniecznością uzyskania jednolitej wielkości sferoidów oraz unikaniem kontaktu z dnem dołka, aby zapewnić wiarygodność pomiarów inwazji i migracji.
