Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Metody te można wykorzystać do scharakteryzowania reakcji na stres u C. elegans i określenia, czy zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne wpływają na aktywację ochronnych szlaków komórkowych. Metody te pozwalają na szybkie i wysokoprzepustowe testowanie setek perturbacji, takich jak knockdown genów, zarówno na poziomie molekularnym, jak i fizjologicznym. Aby upewnić się, że test jest wykonywany prawidłowo, należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne.

Zsynchronizuj zdrowe, dobrze odżywione zwierzęta do odpowiedniego etapu i użyj świeżych talerzy do eksperymentu. Wizualizacja mikromanipulacji robakami za pomocą kilofa może pomóc nowym użytkownikom zrozumieć, w jaki sposób robaki mogą być ustawiane w szeregu i oceniane pod kątem żywotności. Procedury zademonstrują Phil Frankino, Holly Gildea i Melissa Metcalf, doktoranci w naszym laboratorium.

Aby wykorzystać zwierzęta wykazujące ekspresję GFP pod promotorem białka szoku cieplnego cztery do aktywacji odpowiedzi białkowej niewiasty retikulum endoplazmatycznego, należy wyhodować zsynchronizowane zwierzęta reporterowe w temperaturze 20 stopni Celsjusza do etapu L4 i zmyć robaki z płytki za pomocą pożywki M9 i przenieść do probówki. Po zebraniu robaków przez odwirowanie, zastąpić M9 25 nanogramami na mililitr badanego leku w M9 lub dimetylosulfotlenku w M9 w probówkach dla zwierząt kontrolnych. Następnie umieść robaki na obrotowej platformie na trzy do czterech godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji odwirować robaki, aby osiadły, zanim zastąpi roztwór do leczenia 15 mililitrami samego M9. Po dwóch myciach przenieś zwierzęta na płytki NGM lub płytki interferencyjne RNA NGM, w zależności od potrzeb i pozwól robakom zregenerować się przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Kiedy robaki wyzdrowieją, dodaj od pięciu do 10 mikrolitrów 100-milimolowego azydku sodu na standardową płytkę NGM bez bakterii i umieść płytkę z robakami pod mikroskopem preparacyjnym.

Przenieś od 10 do 20 zwierząt z płytki na miejsce azydku sodu. Zwierzęta powinny zahamować ruch wkrótce po wylądowaniu w roztworze soli. Po odparowaniu azydku sodu należy ustawić zwierzęta w żądanej konfiguracji obrazowania z przednią i tylną stroną w tej samej orientacji dla wszystkich zwierząt i natychmiast umieścić płytkę zwierząt pod mikroskopem stereoskopowym.

Uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopem stereoskopowym i na karcie akwizycji kliknij otwórz projekty i folder, aby otworzyć nowy projekt. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zmień nazwę, aby zmienić nazwę folderu. Umieść próbkę robaka pod obiektywem mikroskopu i użyj ustawienia Brightfield, aby zlokalizować właściwy punkt ogniskowy robaków, aby zminimalizować blaknięcie fluorescencyjne.

Środek próbki będzie punktem, w którym linia jaj jest wyraźnie widoczna i nie jest rozmyta. Ustaw czas ekspozycji, aby upewnić się, że piksele nie są nasycone, a także aby upewnić się, że sygnał przekracza granicę wykrywalności. Po ustawieniu czasu ekspozycji, zoomu, ostrości i kondensatorów jasnego pola na odpowiednie ustawienia, kliknij przycisk przechwytywania obrazu, aby uzyskać obraz.

W przypadku obrazowania za pomocą złożonego mikroskopu szerokokątnego, umieść podstawową płytkę kontrolną na stoliku mikroskopu złożonego o szerokim polu i użyj panelu dotykowego, aby uruchomić program kontrolny. Utwórz nowy album i nazwę pliku, a następnie umieść płytkę pod soczewką obiektywu. Użyj płytek kontroli podstawowej i kontroli dodatniej, aby ustawić czas ekspozycji i intensywność fluorescencji tak, aby sygnał był widoczny, ale nie nasycony.

Następnie zapisz obrazy Brightfield i GFP FITC. Aby określić ilościowo indukcję reportera za pomocą cytometrii przepływu dużych cząstek, najpierw włącz lasery cytometru i otwórz oprogramowanie cytometru. Kliknij start, aby włączyć lasery w oknie oprogramowania i kliknij uruchom, aby zainicjować laser w wyskakującym okienku sterowania laserem argonowym.

Gdy laser osiągnie około 12 miliwatów, a poziom źródła światła 488 wzrośnie do około 12, kliknij gotowe i sprawdź cztery wartości ciśnienia. Jeśli wartości wyglądają podobnie do tych zaobserwowanych w oryginalnej konfiguracji, zaznacz pole OK ciśnienia. Następnie, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani zanieczyszczeń blokujących przepływ osłony i próbki przez celę przepływową, kliknij kilkakrotnie przycisk Wyczyść.

Następnie wyłącz sortowanie i włącz osłonę, aby ponownie uruchomić przepływ. Aby sprawdzić natężenie przepływu, zbierz osłonę na 60 sekund. Zbierz osłonę do 15-mililitrowej probówki na 60 sekund.

Natężenie przepływu powinno wynosić od dziewięciu do 10 mililitrów na minutę. Aby uruchomić próbki, należy dostosować moc fotopowielacza laserowego do poziomu na tyle wysokiego, aby sygnał przekraczał granicę wykrywalności, ale nie przekraczał limitu nasycenia. Wykonaj bramkowanie według wielkości, aby wykluczyć pęcherzyki, zanieczyszczenia, jaja i inne niepożądane małe cząstki i uwzględnić tylko zwierzęta będące przedmiotem zainteresowania, takie jak dorosłe osobniki.

Po ustawieniu parametrów przesiewania dodaj przygotowane robaki do kubka i kliknij pobierz. Obserwuj, aby upewnić się, że cała ciecz nie zostanie wchłonięta do urządzenia, ponieważ spowoduje to, że cytometr przepływowy nabierze powietrza i utworzy pęcherzyki w detektorze. Gdy próbka jest niska i/lub zebrano wystarczającą liczbę zwierząt, kliknij przycisk stop.

Aby przechowywać dane bramkowane tylko na podstawie ograniczeń rozmiaru, kliknij pozycję konfiguracja, magazyn danych, tylko bramkowanie i przechowywanie bramkowane, aby zapisać dane. Następnie przepłucz kubek zbiorczy wodą dejonizowaną i trzykrotnie usuń płukanie za pomocą próżni przed powtórzeniem analizy z następną próbką. Aby zmierzyć wrażliwość mitochondriów i stresu oksydacyjnego, dodaj od 50 do 75 mikrolitrów Parakwatu w M9 do ośmiu do 10 dołków na stan płaskiej 96-dołkowej płytki i przenieś od ośmiu do 10 robaków na stan do każdej studzienki Paraquatu.

Co dwie godziny delikatnie postukaj w płytkę, aby żywe zwierzęta rzucały się lub zginały, aby umożliwić ocenę liczby martwych zwierząt w dołku. Aby zmierzyć wrażliwość zwierząt na temperaturę, należy inkubować robaki przez trzy do czterech dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie posiać od 10 do 15 zwierząt na płytkę na warunek, co daje w sumie od czterech do sześciu płytek. Następnie umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 34 lub 37 stopni Celsjusza i oceniaj przeżywalność robaków co dwie godziny, jak pokazano powyżej.

Reporter hsp-4 ma minimalne podstawowe wrażenie przy braku stresu, ale wykazuje silną ekspresję GFP, gdy zwierzęta są narażone na stres retikulum endoplazmatycznego przy użyciu leku Tunicamycin. Różnice te można również określić ilościowo za pomocą cytometru przepływu dużych cząstek. Co więcej, indukcja transgenu pod wpływem stresu retikulum endoplazmatycznego może być całkowicie stłumiona przez knockdown XBP-1 poprzez interferencję RNA.

Podobne testy można wykonać w celu pomiaru stresu mitochondrialnego, stresu oksydacyjnego i stresu cieplnego. Reakcje fizjologiczne całego zwierzęcia na stres można również zmierzyć za pomocą kilku testów przeżycia. Na przykład ekspozycja na tunikamycynę służy do pomiaru wrażliwości na stres retikulum endoplazmatycznego.

Knockdown genu XBP-1 powoduje znaczny wzrost wrażliwości na tunikamycynę. Ponadto narażenie na czynnik chemiczny Parakwat służy do pomiaru wrażliwości na stres oksydacyjny i mitochondrialny. Knockdown genu DAF-2 powoduje znaczny wzrost oporności na Parakwat.

Tolerancję termiczną można zmierzyć, określając przeżywalność zwierząt w podwyższonych temperaturach i można ją wykreślić jako krzywą przeżycia. Testy te powinny być wykonywane co najmniej cztery do sześciu razy, a wszystkie kontrpróby powinny być wykreślane względem siebie, ponieważ termotolerancja wykazuje niewiarygodnie wysoką zmienność w porównaniu z innymi testami naprężeń. Podczas obrazowania zwierząt bardzo ważne jest ustawienie parametrów w taki sposób, aby nie było nadmiernego lub niedostatecznego nasycenia sygnału oraz zapewnienie, że te same parametry są używane przez cały czas trwania eksperymentu.

Opisane tutaj protokoły obrazowania nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę, w tym badań przesiewowych całego genomu, i doskonale nadają się zarówno do badań eksploracyjnych, jak i potwierdzających, które można następnie śledzić za pomocą opisanych testów fizjologicznych.