Name: Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę badania przesiewowego fitoestrogenów przy użyciu komórkowego testu reporterowego receptora estrogenowego β. Technika ta pozwala wykrywać estrogenne związki w roślinach i badać ich wpływ na fizjologię oraz zachowanie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Dale'owi Leitmanowi za wstępne szkolenie w zakresie stosowania testów transfekcji przejściowej do określania aktywności estrogennej pokarmów roślinnych naczelnych. Podziękowania dla Bradforda Westricha i C. Erica Johnsona za pomoc w ustawieniu sprzętu laboratoryjnego i przeszkolenie studentów w zakresie metod ekstrakcji. Na koniec dziękuję Indiana University za sfinansowanie tych badań.

1. Przygotowanie materiałów roślinnych
<ol>
	<li>Liofilizuj produkty roślinne, które zostały zebrane świeże za pomocą liofilizatora.
	<ol>
		<li>Aby chronić próbki przed światłem, podczas procesu suszenia należy przykryć komory folią aluminiową.</li>
		<li>Aby upewnić się, że próbki są całkowicie suche, liofilizuj do momentu, gdy komory przestaną być zimne w dotyku, a materiały roślinne nie będą tracić masy podczas ważenia.</li>
		<li>Przechowuj suszone rośliny w sterylnych torebkach o niskiej zawartości pozostałości przy braku światła do czasu zmielenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drobno zmielić próbki za pomocą młynka z sitkiem o oczkach 0,85 mm.
	<ol>
		<li>Zmielone próbki należy przechowywać w workach przy braku światła, aż do ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja metabolitów wtórnych roślin
<ol>
	<li>Aby wyekstrahować wtórne metabolity roślinne, należy użyć proporcji 1 g suchej próbki na 10 ml metanolu klasy HPLC.
	<ol>
		<li>Zważyć próbkę na wadze analitycznej i dodać ją do kolby Erlenmeyera o odpowiedniej wielkości (125–250 ml). Następnie dodaj odpowiednią ilość metanolu. Zanotować masę wyekstrahowanej próbki.</li>
		<li>Przykryj roztwór roślinny metanolu folią aluminiową, a następnie ustaw tak, aby obracał się z prędkością 100 obr./min w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 dni na wytrząsarce orbitalnej, pozwalając potencjalnie estrogennym związkom rozpuścić się w metanolu.</li>
		<li>Zdekantować supernatant do systemu filtracji kroplowej za pomocą bibuły filtracyjnej (125 mm).</li>
		<li>Za pomocą wyparki obrotowej suszyć ekstrakt roślinny aż do zagęszczenia, ale nadającego się do nalewania, w kolbie okrągłodennej o pojemności 300 ml. Wlać próbkę do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml, przepłukując dużą kolbę niewielką ilością metanolu. Kontynuować suszenie próbki w małej kolbie, aż metanol całkowicie odparuje.</li>
		<li>Zważyć pozostałość próbki za pomocą wagi analitycznej. Zapisać masę pozostałości.</li>
		<li>Ekstrakt roślinny rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 0,1 g ekstraktu na 2 ml DMSO. Wirować aż do homogenizacji.</li>
		<li>Roztwór ekstraktu roślinnego-DMSO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w fiolkach ze szkła oranżowego do czasu przeprowadzenia testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Rośliny mogą wytwarzać nieznane biologicznie aktywne substancje chemiczne, a DMSO jest pojazdem, który może je transportować przez błony komórkowe. Podczas obchodzenia się z tymi próbkami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i zachować ostrożność.
3. Test transfekcji ludzkiego receptora estrogenowego β12
UWAGA: Technika aseptyczna i kaptur z przepływem laminarnym są wymagane w dniu 1 protokołu testu.
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia 17β-estradiolu dla krzywej wzorcowej.
	<ol>
		<li>Przenieś pożywkę do odzyskiwania komórek i złożoną pożywkę przesiewową (CSM) z zamrażarki i rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Oznaczyć probówki do mikrowirówek Pośrednie 1 i 2 (INT1, INT2) oraz 1-8.</li>
		<li>Napełnij INT1 995 μl CSM, INT2 615 μl CSM, probówkę 1 900 μl CSM, a probówki 2-8 600 μl CSM. Odłóż rurkę 8 na bok.</li>
		<li>Przenieś 5 μl 100 μM 17β-estradiolu do INT1. Wyrzuć końcówkę. Wir.</li>
		<li>Przed każdym transferem przepłucz pipetę 3 razy, a następnie przenieś 10 μl z INT1 do INT2. Wyrzuć końcówkę.</li>
		<li>Przepłukać pipetę 3 razy, a następnie przenieść 100 μl z INT2 do probówki 1. Wyrzuć napiwek. Przenieść 300 μl z probówki 1 do probówki 2. Powtórz dla probówek od 3 do 7. Wyrzucić 300 μl z probówki 7 do pojemnika na odpady. Rurka 8 jest zerem i nie otrzymuje estradiolu. Końcowe stężenia platerowanych wzorców to: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 i 0 pM estradiolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować próbki związków.
	<ol>
		<li>Próbki wirowe.</li>
		<li>Weź 4 μl każdej próbki rośliny w DMSO i dodaj do 496 μl CSM, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko rozmrozić komórki reporterowe.
	<ol>
		<li>Pobrać probówkę z pożywką do odzyskiwania komórek z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zdezynfekuj powierzchnię zewnętrzną za pomocą 70% etanolu.</li>
		<li>Odzyskaj komórki reporterowe z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmroź, przenosząc 10 ml wstępnie podgrzanego CRM do probówki z zamrożonymi komórkami.</li>
		<li>Zamknij probówkę Reporter Cells i przenieś do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5-10 minut.</li>
		<li>Wyjmij probówkę z zawiesiną komórek reporterowych z łaźni wodnej. Kilkakrotnie delikatnie odwróć rurkę komórkową, aby rozbić agregaty komórek i wytworzyć jednorodną zawiesinę. Oczyść powierzchnię rurki 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie testowe
	<ol>
		<li>Dozować 100 μl zawiesiny komórek reporterowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Dozować 100 μl próbek w trzech egzemplarzach do odpowiednich studzienek testowych.</li>
		<li>Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, nawilżonego 5% CO2 na 22-24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić substrat do wykrywania i bufor detekcyjny w ciemnej lodówce przez noc, aby przygotować się na Dzień 2.</li>
	<li>Tuż przed zakończeniem inkubacji płytki wyjąć substrat detekcyjny i bufor detekcyjny z lodówki i umieścić w miejscu o słabym oświetleniu, aż do zrównoważenia do RT. Po osiągnięciu RT delikatnie odwróć każdą probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem detekcyjnym, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy. Delikatnie wymieszaj, aby nie wytworzyć piany.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji odwrócić płytkę w celu wyrzucenia jej zawartości do odpowiedniego pojemnika na odpady. Delikatnie postukaj płytką o czysty, chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków.</li>
		<li>Dodaj 100 μl odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdej studzienki. Pozostawić płytkę testową w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nie potrząsaj talerzem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo luminescencję za pomocą 96-dołkowego luminometru do odczytu płytki.</li>
</ol>

<ol><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+%28Procolobus+rufomitratus%29+hormonal+state+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li>
<li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li>
<li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li>
<li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Primate+Diet+%26+Nutrition%22">Primate Diet & Nutrition</a>. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).</li>
<li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Ecology%22%5BJournal%5D)">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li>
<li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li>
<li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li>
<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).</li>
<li>Boué, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li>
<li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li>
<li>Nishikawa, J. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Estrogen+Receptor+Beta+%28ERb%3B+ESR2%3B+NR3A2%29+Reporter+Assay+System%22">Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System</a>. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).</li>
<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+foods+of+red+colobus+monkeys+and+mountain+gorillas+in+uganda%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda.</a> American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).</li>
<li>Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+estrogen+receptor-%CE%B2+target+genes+by+3%2C+3%27-diindolylmethane%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane.</a> Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).</li>
<li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).</li>
<li>Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDi+Gioia%2C+F+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22">Advances in Food and Nutrition Research</a>. , Academic Press Inc. (2019).</li>
<li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors%3A+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li>
<li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens%3A+Degradation+Kinetics+and+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li>
<li>Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3%2FB6%2FF10+pituitary+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li>
<li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li>
<li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li>
<li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Feeding+on+Phytoestrogens%3A+Implications+of+Estrogenic+Plants+for+Primate+Ecology%22">Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology</a>. , UC Berkeley. (2011).</li>
<li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test reporterowy ERβ opracowany do indywidualnego badania przesiewowego środków farmaceutycznych nadaje się również do badań przesiewowych pokarmów roślinnych pod kątem fitoestrogenów biologicznie aktywnych przez ERβ. Ważne kwestie zawarte w protokole obejmują ostrożne traktowanie próbek roślin: świeży materiał roślinny musi być szybko wysuszony, aby zapobiec pleśnieniu lub innej degradacji biologicznej, i musi być trzymany z dala od światła, aby zapobiec fotolizie związków18. Protokół testu<sup c...

Rośliny są niezbędnym źródłem pożywienia dla wielu zwierząt, dostarczając kalorii i składników odżywczych niezbędnych do przetrwania, reprodukcji, wzrostu, rozwoju i zachowania1. Rośliny wytwarzają tysiące substancji chemicznych, z których wiele jest adaptacją do własnego wzrostu, utrzymania stomatycznego i rozmnażania. Inne związki, uważane za roślinne metabolity wtórne (PSM), mają funkcje, które są mniej jasne, chociaż niektóre są toksyczne i prawdopodobnie używane jako obrona przed roślinożernością i pasożytnictwem (np. alkaloidy, garbniki)2,3. Niektóre z tych substancji chemicznych mają zdolność wpływania na długoterminowe procesy fizjologiczne u zwierząt, takie jak funkcjonowanie układu hormonalnego, chociaż nadal nie jest jasne, dlaczego te aktywne hormonalnie fitochemikalia oddziałują z układem hormonalnym kręgowców2,4.
Fitoestrogeny, najlepiej przebadane hormonalnie aktywne fitochemikalia, to polifenolowe PSM, które strukturalnie i funkcjonalnie naśladują estrogeny, bezpośrednio oddziałując z osią podwzgórzowo-przysadkową gonad układu hormonalnego kręgowców5. Spożywanie fitoestrogenów w diecie człowieka wiąże się z ochroną przed niektórymi nowotworami, chorobami serca i objawami menopauzy, chociaż inne skutki obejmują problemy z płodnością. W rzeczywistości fizjologiczne działanie tych związków zostało odkryte w latach czterdziestych XX wieku, kiedy niepłodność owiec przypisano ich wypasowi na bogatej w fitoestrogeny koniczynie (Trifolium subterrareum)6. Po spożyciu fitoestrogeny mogą przenikać do komórek i naśladować działanie estrogenu. Chociaż fitoestrogeny miały negatywny wpływ na płodność owiec, związek między fitoestrogenami a fizjologią nie jest prosty. Podobnie jak owce, nosorożec biały południowy wykazuje wrażliwość na związki estrogenowe w paszy pochodzącej z dużych ilości soi i lucerny. Córki samic karmionych tą dietą w czasie ciąży mają mniejsze szanse na rozmnażanie7. Jednak inne badania wykazały, że fitoestrogeny mogą mieć również pozytywne skutki, w tym dojrzewanie pęcherzyków jajnikowych u starszych myszy8, zapobieganie niektórym nowotworom, aktywność przeciwutleniająca i działanie antyproliferacyjne9.
Zakres działania fitoestrogenów nie jest zaskakujący, biorąc pod uwagę, że estrogeny wpływają na szeroki zakres funkcji biologicznych, w tym wzrost, rozwój i regulację układu rozrodczego i ośrodkowego układu nerwowego10. Chociaż istnieje wiele mechanizmów działania, fitoestrogeny często mają zdolność modyfikowania, wzmacniania lub zakłócania sygnalizacji estrogenowej poprzez ich zdolność do działania jako ligandy dla wewnątrzjądrowych receptorów estrogenowych alfa i beta (ERα i ERβ). Wiele fitoestrogenów ma fenolową strukturę pierścieniową podobną do estrogenów, która pozwala im wiązać receptory estrogenowe. Te z agonistyczną aktywnością estrogenową działają jak estrogen, tworząc aktywowany kompleks ligandu ER, który może dimeryzować i wiązać się z elementem odpowiedzi estrogenowej (ERE) i wyzwalać transkrypcję genu11. W ten sposób estrogeny i fitoestrogeny regulują aktywność komórek i funkcje systemu poprzez swoje działanie jako czynniki transkrypcyjne.
Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu komórkowego do badania ekstraktów roślinnych pod kątem obecności związków o estrogennej aktywności biologicznej. W tym teście wykorzystuje komórki CHO jajnika chomika chińskiego zmodyfikowane do wysokiej ekspresji ERβ, które zostały transfekowane genem lucyferazy świetlika (Photinus pyralis) połączonym z promotorem ERE 12. Kiedy związki estrogenowe są obecne, wiążą się z ER, dimeryzują i wiążą się z ERE, co prowadzi do transkrypcji genu lucyferazy. Po dodaniu roztworu substratu lucyferazy katalizuje reakcję prowadzącą do emisji fotonów. W związku z tym próbki dodatnie dają światło, a próbki ujemne nie.
Ten komercyjnie dostępny test eliminuje potrzebę transfekcji komórek ssaków przez laboratoria za pomocą genu reporterowego i receptora estrogenowego13,14, który był niestabilny i miał zmienną skuteczność. Test zapewnia stabilną platformę transfekcyjną, która pozwala szybko i prosto określić, czy roślina ma aktywność estrogenową poprzez wiązanie receptora.
Testujemy hipotezę, że soja ma wyższą aktywność estrogenową niż wszystkie inne produkty spożywcze, biorąc pod uwagę znane stężenia estrogenowych izoflawonów15, używając żywności dla ludzi z lokalnych sklepów spożywczych.

<table><tbody><tr><td>1000 &mikro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 i mikro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &mikro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; łaźnia</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>37 &#176;, nawilżana 5% inkubator</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>analityczna Kaptur z przepływem</td><td></td><td></td><td></td>laminarnym do hodowli komórek</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td></td> dimetylu<td></td><td></td></tr><tr><td>jednorazowy zbiornik na media, sterylny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>system</td><td></td><td></td><td></td>filtracji kroplowej</tr><tr><td>Kolby</td><td></td><td></td> Erlenmeyera <td>125 ml i 250 ml</td></tr><tr><td>metanol</td><td></td><td></td><td></td>klasy HPLC</tr><tr><td>Ludzki ER &beta; Reporter Assay System, 1 x 96-dołkowy format testów</td><td>Indigo Biosciences</td><td>IB00411</td><td>Zestaw testowy - analizuje 24 próbki plus</td></tr><tr><td>liofilizator</td><td></td><td></td><td></td></tr> o krzywej wzorcowej <tr><td>wielokanałowa pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna</tr><tr><td>luminometr</td><td></td><td></td> z odczytem płytki, np. Parownik <td></td></tr><tr><td></td><td>rotacyjny Bioteck Synergy HTX</td><td></td><td></td></tr><tr>kolby <td></td><td></td><td>okrągłodenne</td><td>50 ml i 300 ml</td></tr><tr><td>sterylne probówki do mikrowirówek lub sterylne wielokanałowe zbiorniki</td><td></td><td></td><td></td>na podłoża</tr><tr><td>sterylne końcówki</td><td></td><td></td><td>200 i mikro; L oraz 1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>Worki</td><td></td><td></td> papierowe <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Whatman klasy 1</td></tr> whirl-pak sterylne torby polietylenowe</tbody></table>

badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Rośliny są źródłem pożywienia dla wielu zwierząt i mogą produkować tysiące substancji chemicznych. Niektóre z tych związków wpływają na procesy fizjologiczne u kręgowców, które je spożywają, takie jak funkcje hormonalne. Fitoestrogeny, najlepiej przebadane fitochemikalia czynne endokrynologicznie, bezpośrednio oddziałują z osią podwzgórze-przysadka gonad układu hormonalnego kręgowców. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie zastosowanie testu komórkowego do badań przesiewowych ekstraktów roślinnych pod kątem obecności związków o estrogennej aktywności biologicznej. W teście tym wykorzystuje się komórki ssaków zmodyfikowane do wysokiej ekspresji receptora estrogenowego beta (ERβ) i które zostały transfekowane genem lucyferazy. Ekspozycja na związki o aktywności estrogenowej powoduje, że komórki wytwarzają światło. Ten test jest wiarygodnym i prostym sposobem testowania biologicznej aktywności estrogenowej. Ma kilka ulepszeń w stosunku do testów transfekcji przejściowej, w szczególności łatwość użycia, stabilność komórek i czułość testu.

Przeprowadzono screening dwudziestu dwóch ekstraktów z owoców i warzyw powszechnie występujących w diecie człowieka pod kątem obecności związków estrogennych. Przebadano różnorodne produkty spożywcze, w tym rośliny strączkowe, takie jak soja, groszek cukrowy i groszek śnieżny, ponieważ rodzina grochowatych jest znanym źródłem fitoestrogenów16, a także figi, daktyle, kukurydzę, marchew, jabłka, banany, truskawki, pomidory, jarmuż i kapustę. Związki zaburzające gospodarkę hormonalną występują w pows...

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Używamy tego testu, aby ocenić, czy pokarmy roślinne zawierają fitosteriody, które mogą wpływać na procesy fizjologiczne u zwierząt, a także na zachowanie i sukces reprodukcyjny. Test ten zapewnia prostą i wiarygodną metodę określania, czy rośliny wytwarzają związki estrogenowe o aktywności biologicznej. Metoda ta została początkowo opracowana do badań przesiewowych leków o aktywności ksenoestrogenowej do zastosowań w medycynie.Na przykład hamowanie proliferacji komórek. Używamy go, aby zapewnić wgląd w ekologię i ewolucję naczelnych. Ważne jest, aby przed przystąpieniem do tego testu nabrać wprawy w pracy z techniką aseptyczną w czystym środowisku, ponieważ jest ona bardzo wrażliwa na zanieczyszczenie.Rozpocznij od liofilizacji świeżych elementów roślinnych za pomocą liofilizatora, a następnie drobno zmielić je za pomocą młynka z sitkiem o oczkach 0,85 milimetra. Zmielone próbki należy przechowywać w workach w ciemności do czasu ekstrakcji. Aby wyekstrahować potencjalne fitosteroidy z roślin, należy dodać wysuszoną próbkę do kolby o odpowiedniej wielkości, a następnie do metanolu klasy HPLC.Przykryj roślinny roztwór metanolu folią aluminiową i ustaw go tak, aby obracał się z prędkością 100 obr./min przez trzy dni na wytrząsarce orbitalnej. Po trzech dniach należy użyć bibuły filtracyjnej do zdekantacji supernatu i wprowadzić go do systemu filtracji kroplowej. Wysuszyć ekstrakt roślinny za pomocą wyparki obrotowej, aż zgęstnieje, ale będzie można go nalać do 300 mililitrów kolby z okrągłym dnem.Wlać próbkę do kolby o pojemności 50 ml i przepłukać dużą kolbę niewielką ilością metanolu, a następnie kontynuować suszenie próbki w małej kolbie, aż do całkowitego odparowania metanolu. Po zakończeniu zważyć pozostałość próbki za pomocą wagi analitycznej i zanotować masę. Rozpuść ekstrakt roślinny w DMSO w stężeniu 0,1 grama ekstraktu do dwóch mililitrów DMSO i wiruj go aż do homogenizacji.DMSO sam w sobie nie jest toksyczny, ale jest nośnikiem, który umożliwia innym substancjom przenikanie przez błony. Ponieważ nie wiemy, czy nasze rośliny zawierają toksyczne chemikalia, wszystkie są traktowane tak, jakby były niebezpieczne. Nie dopuścić do kontaktu roztworu ze skórą, załóż rękawiczki, jeśli jest zanieczyszczony, noś grube buty z zakrytymi palcami i fartuchy laboratoryjne.Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w fiolkach ze szkła oranżowego do czasu przygotowania jej do użycia. Wirować próbki, a następnie dodać cztery mikrolitry każdej próbki do 496 mikrolitrów złożonej pożywki przesiewowej, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO. Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię wstępnie podgrzanej probówki z pożywką do odzyskiwania komórek 70% etanolem i przenieś 10 mililitrów pożywki do probówki z zamrożonymi komórkami reporterowymi w celu ich rozmrożenia.Zamknij probówkę z komórkami reporterowymi i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut. Po pobraniu komórek z łaźni wodnej należy kilkakrotnie delikatnie odwrócić rurkę w celu rozbicia agregatów komórek i wytworzenia jednorodnej zawiesiny, a następnie oczyścić powierzchnię rurki 70% etanolem. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórki reporterowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej, a następnie dozować 100 mikrolitrów próbek w trzech próbkach do odpowiednich dołków.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 22 do 24 godzin. Tuż przed zakończeniem inkubacji płytki wyjmij substrat detekcyjny i bufor detekcyjny z lodówki i umieść je w miejscu o słabym oświetleniu, aż osiągną równowagę z temperaturą pokojową, a następnie delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać roztwory. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji płytki wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem do wykrywania, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy.Delikatnie wymieszaj rurkę, aby nie wytworzyć piany. Wyrzuć zawartość płytki z próbką do nieodpowiedniego pojemnika na odpady i delikatnie postukaj nią w czysty chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdego dołka i pozostawić płytkę testową do spoczynku w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie określić ilościowo luminescencję za pomocą luminometru do odczytu płytki 96-dołkowej.22 ekstrakty z owoców i warzyw powszechnie występujących w diecie człowieka zostały przebadane pod kątem obecności związków estrogenowych. Aktywność estrogenowa jest prezentowana w porządkowy jakościowy sposób wysokiej, średniej, niskiej lub braku aktywności. Soja ekologiczna i nieekologiczna była badana pod wysokim poziomem aktywności, podczas gdy wszystkie inne owoce i warzywa nie odnotowały żadnej aktywności.Porównanie wyników soi z krzywą standardową pokazuje również, że mają one wysoki poziom aktywności estrogenowej w tym stężeniu. Ekstrakt z soi, znany z silnego źródła izoflawonów, daidzeiny i genisteiny, został następnie wykorzystany do określenia rozcieńczenia, dając 50% sygnał do maksimum. Ekstrakt ten wymaga 422 razy większego rozcieńczenia, aby wytworzyć połowę sygnału w naszym standardowym protokole rozcieńczania.Próbki zidentyfikowane pod kątem aktywności mogą być wysyłane do analizy za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji aktywnych substancji chemicznych. Korzystając z metody antagonistycznej, możemy również określić, czy pokarm roślinny zawiera substancje chemiczne, które zmniejszają wiązanie i aktywność endogennych estrogenów. Ta technika pozwala nam lepiej zrozumieć, jak powszechne są pokarmy estrogenowe w diecie naczelnych, a także jak spożywanie fitoestrogenów wpływa na fizjologię i zachowanie, gdy test jest połączony z analizami hormonów kałowych i danymi terenowymi.

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Integracja danych z eksperymentów sekwencjonowania całego genomu i eksperymentów metabolomicznych jest wyzwaniem.  W niniejszej pracy po raz pierwszy przedstawiono generację, analizę i integrację danych dotyczących transkryptomu, cistromu i metabolomu z komórek raka piersi leczonych estradiolem.

Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Klinicznie, niedobór estrogenu u kobiet w okresie menopauzy może nasilać występowanie zaburzeń lipidowych i miażdżycy. Ustaliliśmy model niedoboru estrogenu in vivo za pomocą obustronnej owariektomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-. Model mysi ma zastosowanie do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.

Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Poznaj metodę badania przesiewowego fitoestrogenów przy użyciu komórkowego testu reporterowego receptora estrogenowego β. Technika ta pozwala wykrywać estrogenne związki w roślinach i badać ich wpływ na fizjologię oraz zachowanie zwierząt.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Przeglądaj więcej filmów