Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego
June 7th, 2020
Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.
Używamy tego testu, aby ocenić, czy pokarmy roślinne zawierają fitosteriody, które mogą wpływać na procesy fizjologiczne u zwierząt, a także na zachowanie i sukces reprodukcyjny. Test ten zapewnia prostą i wiarygodną metodę określania, czy rośliny wytwarzają związki estrogenowe o aktywności biologicznej. Metoda ta została początkowo opracowana do badań przesiewowych leków o aktywności ksenoestrogenowej do zastosowań w medycynie.
Na przykład hamowanie proliferacji komórek. Używamy go, aby zapewnić wgląd w ekologię i ewolucję naczelnych. Ważne jest, aby przed przystąpieniem do tego testu nabrać wprawy w pracy z techniką aseptyczną w czystym środowisku, ponieważ jest ona bardzo wrażliwa na zanieczyszczenie.
Rozpocznij od liofilizacji świeżych elementów roślinnych za pomocą liofilizatora, a następnie drobno zmielić je za pomocą młynka z sitkiem o oczkach 0,85 milimetra. Zmielone próbki należy przechowywać w workach w ciemności do czasu ekstrakcji. Aby wyekstrahować potencjalne fitosteroidy z roślin, należy dodać wysuszoną próbkę do kolby o odpowiedniej wielkości, a następnie do metanolu klasy HPLC.
Przykryj roślinny roztwór metanolu folią aluminiową i ustaw go tak, aby obracał się z prędkością 100 obr./min przez trzy dni na wytrząsarce orbitalnej. Po trzech dniach należy użyć bibuły filtracyjnej do zdekantacji supernatu i wprowadzić go do systemu filtracji kroplowej. Wysuszyć ekstrakt roślinny za pomocą wyparki obrotowej, aż zgęstnieje, ale będzie można go nalać do 300 mililitrów kolby z okrągłym dnem.
Wlać próbkę do kolby o pojemności 50 ml i przepłukać dużą kolbę niewielką ilością metanolu, a następnie kontynuować suszenie próbki w małej kolbie, aż do całkowitego odparowania metanolu. Po zakończeniu zważyć pozostałość próbki za pomocą wagi analitycznej i zanotować masę. Rozpuść ekstrakt roślinny w DMSO w stężeniu 0,1 grama ekstraktu do dwóch mililitrów DMSO i wiruj go aż do homogenizacji.
DMSO sam w sobie nie jest toksyczny, ale jest nośnikiem, który umożliwia innym substancjom przenikanie przez błony. Ponieważ nie wiemy, czy nasze rośliny zawierają toksyczne chemikalia, wszystkie są traktowane tak, jakby były niebezpieczne. Nie dopuścić do kontaktu roztworu ze skórą, załóż rękawiczki, jeśli jest zanieczyszczony, noś grube buty z zakrytymi palcami i fartuchy laboratoryjne.
Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w fiolkach ze szkła oranżowego do czasu przygotowania jej do użycia. Wirować próbki, a następnie dodać cztery mikrolitry każdej próbki do 496 mikrolitrów złożonej pożywki przesiewowej, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO. Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię wstępnie podgrzanej probówki z pożywką do odzyskiwania komórek 70% etanolem i przenieś 10 mililitrów pożywki do probówki z zamrożonymi komórkami reporterowymi w celu ich rozmrożenia.
Zamknij probówkę z komórkami reporterowymi i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut. Po pobraniu komórek z łaźni wodnej należy kilkakrotnie delikatnie odwrócić rurkę w celu rozbicia agregatów komórek i wytworzenia jednorodnej zawiesiny, a następnie oczyścić powierzchnię rurki 70% etanolem. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórki reporterowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej, a następnie dozować 100 mikrolitrów próbek w trzech próbkach do odpowiednich dołków.
Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 22 do 24 godzin. Tuż przed zakończeniem inkubacji płytki wyjmij substrat detekcyjny i bufor detekcyjny z lodówki i umieść je w miejscu o słabym oświetleniu, aż osiągną równowagę z temperaturą pokojową, a następnie delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać roztwory. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji płytki wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem do wykrywania, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy.
Delikatnie wymieszaj rurkę, aby nie wytworzyć piany. Wyrzuć zawartość płytki z próbką do nieodpowiedniego pojemnika na odpady i delikatnie postukaj nią w czysty chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdego dołka i pozostawić płytkę testową do spoczynku w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie określić ilościowo luminescencję za pomocą luminometru do odczytu płytki 96-dołkowej.
22 ekstrakty z owoców i warzyw powszechnie występujących w diecie człowieka zostały przebadane pod kątem obecności związków estrogenowych. Aktywność estrogenowa jest prezentowana w porządkowy jakościowy sposób wysokiej, średniej, niskiej lub braku aktywności. Soja ekologiczna i nieekologiczna była badana pod wysokim poziomem aktywności, podczas gdy wszystkie inne owoce i warzywa nie odnotowały żadnej aktywności.
Porównanie wyników soi z krzywą standardową pokazuje również, że mają one wysoki poziom aktywności estrogenowej w tym stężeniu. Ekstrakt z soi, znany z silnego źródła izoflawonów, daidzeiny i genisteiny, został następnie wykorzystany do określenia rozcieńczenia, dając 50% sygnał do maksimum. Ekstrakt ten wymaga 422 razy większego rozcieńczenia, aby wytworzyć połowę sygnału w naszym standardowym protokole rozcieńczania.
Próbki zidentyfikowane pod kątem aktywności mogą być wysyłane do analizy za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji aktywnych substancji chemicznych. Korzystając z metody antagonistycznej, możemy również określić, czy pokarm roślinny zawiera substancje chemiczne, które zmniejszają wiązanie i aktywność endogennych estrogenów. Ta technika pozwala nam lepiej zrozumieć, jak powszechne są pokarmy estrogenowe w diecie naczelnych, a także jak spożywanie fitoestrogenów wpływa na fizjologię i zachowanie, gdy test jest połączony z analizami hormonów kałowych i danymi terenowymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje zoptymalizowany test reporterowy receptora estrogenu β do przesiewania żywności pod kątem aktywności estrogennej. Test został zweryfikowany za pomocą znanych związków estrogennych i dostarcza wglądu w ekologiczne i ewolucyjne aspekty życia naczelnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Ekologia
Tło
- Związki estrogenne mogą wpływać na procesy fizjologiczne u zwierząt.
- Fitosteroidy w pokarmach roślinnych mogą wpływać na zachowanie i sukces reprodukcyjny.
- Test został początkowo opracowany do przesiewania leków związanych z aktywnością ksenoestrogenów.
- Czułość na zanieczyszczenia wymaga zastosowania technik aseptycznych w laboratorium.
Cel badania
- Ocenić estrogenną aktywność różnych pokarmów roślinnych.
- Dostarczyć wglądu w ekologię i ewolucję naczelnych.
- Opracować niezawodną metodę wykrywania biologicznie aktywnych związków estrogennych.
Zastosowane metody
- Optymalizacja komercyjnie dostępnego testu reporterowego receptora estrogenu β.
- Przesiewanie ludzkich i nieludzkich pokarmów naczelnych.
- Walidacja testu za pomocą znanych estrogennych pokarmów.
- Zastosowanie technik aseptycznych w celu zapobiegania zanieczyszczeniom.
Główne wyniki
- Test z powodzeniem zidentyfikował soję jako pokarm o wysokiej aktywności estrogennej.
- Inne badane pokarmy nie wykazały aktywności estrogennej.
- Metoda okazała się prosta i niezawodna w przesiewaniu.
- Uzyskane wglądy przyczyniają się do lepszego zrozumienia wpływu pokarmu na naczelne.
Wnioski
- Zoptymalizowany test jest skuteczny w przesiewaniu aktywności estrogennej w pokarmach.
- Zrozumienie źródeł estrogennych związków w pokarmach jest kluczowe dla zdrowia naczelnych.
- To badanie otwiera możliwości dalszych badań nad wpływem diety na zachowanie i reprodukcję.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay enables early-stage target validation by providing a quantitative readout of estrogen receptor β activation, supporting mechanistic de-risking in endocrine-disruptor screening. It offers a reproducible, cell-based system for assessing ligand-dependent transcriptional activity, which aids in lead identification and predictive confidence for compounds targeting nuclear receptor pathways. The method’s stability and sensitivity facilitate integration into discovery workflows focused on hormonal modulation and pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates ligand-dependent activation of estrogen receptor β to clarify mechanism of action for test compounds.
- Operational Value: Uses a stable reporter cell line that reduces variability compared to transient transfection systems.
- Predictive Value: Enables dose-response characterization to estimate relative potency and prioritize hits for follow-up.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces a luminescent signal proportional to receptor activation, enabling high-throughput compatibility.
- Reproducibility: Demonstrates consistent results across replicates when performed under aseptic, controlled conditions.
- Scalability: Adaptable to 96-well format for screening libraries of extracts or synthetic compounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports evaluation of endogenous and exogenous ligands in disease-relevant hormonal contexts.
- Biomarker Alignment: Luminescent output correlates with transcriptional activity, serving as a functional readout for pathway engagement.
- De-risking: Helps distinguish agonists from antagonists when combined with competitive binding assays.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for nuclear receptor modulators. It provides a functional confirmation step after initial binding or phenotypic screens, helping to triage compounds based on pathway-specific activity. The output supports go/no-go decisions by quantifying transcriptional response, which informs structure-activity relationship efforts and reduces false positives in downstream profiling.
- Discovery Biology: Confirms whether a compound acts as an agonist via estrogen receptor β-mediated transcription.
- Screening: Delivers a quantitative, luminescence-based readout suitable for screening natural product extracts or compound libraries.
- Analytics: Generates dose-response data that can be compared to reference agonists like estradiol or genistein.
- Translational Research: Connects in vitro activity to physiological relevance when paired with hormonal or behavioral readouts in model systems.
- Enterprise Reuse: The stable cell line can be banked and reused across projects, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into nuclear receptor activation, reducing ambiguity in compound profiling.
- Operational Value: Eliminates need for repeated transfection, improving assay consistency and throughput.
- Strategic Value: Supports early identification of endocrine-active compounds, enabling proactive risk assessment.
- Portfolio Impact: Informs prioritization of scaffolds with desired receptor selectivity or activity profile.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aseptic technique, and luciferase-based detection.
- Depends on access to a luminometer and reagent preparation for luminescence detection.
- Necessitates standardization of DMSO vehicle controls and incubation times across runs.
- Must account for compound solubility and cytotoxicity when screening at higher concentrations.
- Limited to detecting agonist activity; antagonist effects require orthogonal methods.
