Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Używamy tego testu, aby ocenić, czy pokarmy roślinne zawierają fitosteriody, które mogą wpływać na procesy fizjologiczne u zwierząt, a także na zachowanie i sukces reprodukcyjny. Test ten zapewnia prostą i wiarygodną metodę określania, czy rośliny wytwarzają związki estrogenowe o aktywności biologicznej. Metoda ta została początkowo opracowana do badań przesiewowych leków o aktywności ksenoestrogenowej do zastosowań w medycynie.

Na przykład hamowanie proliferacji komórek. Używamy go, aby zapewnić wgląd w ekologię i ewolucję naczelnych. Ważne jest, aby przed przystąpieniem do tego testu nabrać wprawy w pracy z techniką aseptyczną w czystym środowisku, ponieważ jest ona bardzo wrażliwa na zanieczyszczenie.

Rozpocznij od liofilizacji świeżych elementów roślinnych za pomocą liofilizatora, a następnie drobno zmielić je za pomocą młynka z sitkiem o oczkach 0,85 milimetra. Zmielone próbki należy przechowywać w workach w ciemności do czasu ekstrakcji. Aby wyekstrahować potencjalne fitosteroidy z roślin, należy dodać wysuszoną próbkę do kolby o odpowiedniej wielkości, a następnie do metanolu klasy HPLC.

Przykryj roślinny roztwór metanolu folią aluminiową i ustaw go tak, aby obracał się z prędkością 100 obr./min przez trzy dni na wytrząsarce orbitalnej. Po trzech dniach należy użyć bibuły filtracyjnej do zdekantacji supernatu i wprowadzić go do systemu filtracji kroplowej. Wysuszyć ekstrakt roślinny za pomocą wyparki obrotowej, aż zgęstnieje, ale będzie można go nalać do 300 mililitrów kolby z okrągłym dnem.

Wlać próbkę do kolby o pojemności 50 ml i przepłukać dużą kolbę niewielką ilością metanolu, a następnie kontynuować suszenie próbki w małej kolbie, aż do całkowitego odparowania metanolu. Po zakończeniu zważyć pozostałość próbki za pomocą wagi analitycznej i zanotować masę. Rozpuść ekstrakt roślinny w DMSO w stężeniu 0,1 grama ekstraktu do dwóch mililitrów DMSO i wiruj go aż do homogenizacji.

DMSO sam w sobie nie jest toksyczny, ale jest nośnikiem, który umożliwia innym substancjom przenikanie przez błony. Ponieważ nie wiemy, czy nasze rośliny zawierają toksyczne chemikalia, wszystkie są traktowane tak, jakby były niebezpieczne. Nie dopuścić do kontaktu roztworu ze skórą, załóż rękawiczki, jeśli jest zanieczyszczony, noś grube buty z zakrytymi palcami i fartuchy laboratoryjne.

Przechowywać próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w fiolkach ze szkła oranżowego do czasu przygotowania jej do użycia. Wirować próbki, a następnie dodać cztery mikrolitry każdej próbki do 496 mikrolitrów złożonej pożywki przesiewowej, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO. Zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię wstępnie podgrzanej probówki z pożywką do odzyskiwania komórek 70% etanolem i przenieś 10 mililitrów pożywki do probówki z zamrożonymi komórkami reporterowymi w celu ich rozmrożenia.

Zamknij probówkę z komórkami reporterowymi i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut. Po pobraniu komórek z łaźni wodnej należy kilkakrotnie delikatnie odwrócić rurkę w celu rozbicia agregatów komórek i wytworzenia jednorodnej zawiesiny, a następnie oczyścić powierzchnię rurki 70% etanolem. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórki reporterowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej, a następnie dozować 100 mikrolitrów próbek w trzech próbkach do odpowiednich dołków.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 22 do 24 godzin. Tuż przed zakończeniem inkubacji płytki wyjmij substrat detekcyjny i bufor detekcyjny z lodówki i umieść je w miejscu o słabym oświetleniu, aż osiągną równowagę z temperaturą pokojową, a następnie delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać roztwory. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji płytki wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem do wykrywania, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy.

Delikatnie wymieszaj rurkę, aby nie wytworzyć piany. Wyrzuć zawartość płytki z próbką do nieodpowiedniego pojemnika na odpady i delikatnie postukaj nią w czysty chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków. Dodać 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdego dołka i pozostawić płytkę testową do spoczynku w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie określić ilościowo luminescencję za pomocą luminometru do odczytu płytki 96-dołkowej.

22 ekstrakty z owoców i warzyw powszechnie występujących w diecie człowieka zostały przebadane pod kątem obecności związków estrogenowych. Aktywność estrogenowa jest prezentowana w porządkowy jakościowy sposób wysokiej, średniej, niskiej lub braku aktywności. Soja ekologiczna i nieekologiczna była badana pod wysokim poziomem aktywności, podczas gdy wszystkie inne owoce i warzywa nie odnotowały żadnej aktywności.

Porównanie wyników soi z krzywą standardową pokazuje również, że mają one wysoki poziom aktywności estrogenowej w tym stężeniu. Ekstrakt z soi, znany z silnego źródła izoflawonów, daidzeiny i genisteiny, został następnie wykorzystany do określenia rozcieńczenia, dając 50% sygnał do maksimum. Ekstrakt ten wymaga 422 razy większego rozcieńczenia, aby wytworzyć połowę sygnału w naszym standardowym protokole rozcieńczania.

Próbki zidentyfikowane pod kątem aktywności mogą być wysyłane do analizy za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji aktywnych substancji chemicznych. Korzystając z metody antagonistycznej, możemy również określić, czy pokarm roślinny zawiera substancje chemiczne, które zmniejszają wiązanie i aktywność endogennych estrogenów. Ta technika pozwala nam lepiej zrozumieć, jak powszechne są pokarmy estrogenowe w diecie naczelnych, a także jak spożywanie fitoestrogenów wpływa na fizjologię i zachowanie, gdy test jest połączony z analizami hormonów kałowych i danymi terenowymi.