Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy człowieka
24 kwietnia 2020
Opisujemy i szczegółowo opisujemy zastosowanie translaminarnego systemu autonomicznego. System ten wykorzystuje ludzki tylny odcinek do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrz segmentu (wewnątrzgałkowego) i otaczającego nerw wzrokowy (wewnątrzczaszkowego) w celu wytworzenia translaminarnego gradientu ciśnienia, który naśladuje cechy jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego.
Ten nowatorski autonomiczny system translaminarny oka wykorzystuje ludzki tylny segment do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego w celu wygenerowania translaminarnego gradientu ciśnienia. Model TAS umożliwia ocenę ciśnienia śródczaszkowego u człowieka w sposób przedkliniczny ex vivo, który wcześniej nie był możliwy do zbadania. Model ten może być potencjalnie wykorzystany do badania chorób takich jak jaskra, urazowe uszkodzenie mózgu, idiopatyczne nadciśnienie śródczaszkowe i zespół nerwowo-oczny związany z lotami kosmicznymi.
Aby ustawić strzykawki napływowe, załaduj 30-mililitrową strzykawkę 30 mililitrami interesującego Cię płynu perfuzyjnego i podłącz trójdrożny kurek odcinający do strzykawki. Podłącz filtr hydrofilowy o średnicy 0,22 mikrometra do kurka odcinającego i podłącz adapter króćca luer o rozmiarze 15 do filtra hydrofilowego o średnicy 0,22 mikrometra. Po usunięciu pęcherzyków powietrza z zestawu strzykawki należy przymocować rurkę do adaptera króćca luer i zamknąć boczny port kurka odcinającego nieodpowietrzoną uniwersalną nasadką blokującą.
Po skonfigurowaniu drugiej strzykawki napływowej, jak właśnie pokazano, oznacz jeden kanał strzykawki jednym ICP, a drugi kanał strzykawki oznacz dwoma IOP. Następnie ustawić strzykawki odpływowe, jak pokazano, ale bez ładowania strzykawek medium infuzyjnego. Aby przygotować próbkę całej gałki oka ludzkiego, należy usunąć osłonkę nerwu wzrokowego i usunąć ciało szkliste z tylnego segmentu.
Aby zapewnić dobre dopasowanie do okrągłej kopuły komory IOP, w razie potrzeby przytnij dodatkową twardówkę z tylnego segmentu i użyj kleszczy, aby upewnić się, że siatkówka jest równomiernie rozłożona na ludzkiej tylnej części segmentu. Następnie umieść segment w komorze IOP TAS nad okrągłą kopułą z nerwem wzrokowym skierowanym do góry i użyj O-ringu z żywicy epoksydowej i czterech, aby uszczelnić tylny segment. Aby skonfigurować komorę IOP, włóż rurkę do portów wejściowych i wyjściowych komory, a następnie włóż strzykawkę dopływającą IOP do portu wejściowego.
Włóż pustą strzykawkę z odpływem IOP do portu wyjściowego i użyj metody pchania/ciągnięcia, aby powoli wlewać medium perfuzyjne do portu dopływowego, aby napełnić tylną muszlę oczną, jednocześnie powoli wyciągając medium perfuzyjne przez strzykawkę odpływową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodów. Gdy zarówno rurki wlotowe, jak i wyjściowe są pozbawione pęcherzyków powietrza, należy zatrzymać infuzję i zablokować kurki odcinające w pozycji wyłączonej. Wyjąć strzykawkę z IOP w zespole filtra portu i napełnić strzykawkę dodatkowymi 30 milimetrami pożywki, a następnie ponownie włożyć zestaw strzykawki do zespołu filtra.
Aby ustawić komorę ICP, umieść komorę z tyłu tylnego segmentu, uważając, aby nerw wzrokowy znajdował się w górnej komorze i uszczelnij górną komorę czterema, a następnie włóż rurkę do portów wejściowych i wyjściowych komory ICP, strzykawkę wejściową ICP do portu wejściowego, i pustą strzykawkę odpływową ICP do portu wyjściowego, aby przepłukać system pożywką, jak właśnie pokazano. Aby skonfigurować system rejestracji danych, włącz ośmiokanałowe źródło zasilania i komputer, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Wybierz pozycję Plik i Nowy, a następnie wybierz pozycję Ustawienia i ustawienia kanału.
Wybierz trzy kanały i zmień ich nazwy zgodnie ze wskazaniami. Wybierz dwa miliwolty dla opcji Zakres na wszystkich kanałach, a następnie w kolumnie Obliczenia wybierz opcję Brak obliczeń dla kanałów pierwszego i drugiego. Wybierz opcję Arytmetyka dla kanału trzeciego W oknie Formuła, w obszarze Kanały, wybierz Ch 2.
W obszarze Funkcja wybierz opcję Math and Minus, a w obszarze Channels (Kanały) wybierz Ch 1. Aby skonfigurować i skalibrować przetworniki ciśnienia hydrostatycznego, podłącz przetworniki ciśnienia hydrostatycznego do przewodów przetworników podłączonych do wielokanałowego wzmacniacza mostkowego i podłącz pustą 30-mililitrową strzykawkę do bocznego portu przetwornika ciśnienia ICP kanału pierwszego. Przymocuj ciśnieniomierz do dolnej części przetwornika ciśnienia ICP w jednym kanale i kliknij strzałkę obok czasu próbkowania, aby ustawić prędkość próbkowania na 100.
Wybierz Bridge Amp, Filtr sieciowy i Zero i poczekaj, aż system się wyzeruje, uważając, aby nie przesunąć przetwornika ciśnienia. Następnie ściśnij białe wypustki przetwornika ciśnienia i przepchnij powietrze przez przetwornik, aż na ciśnieniomierzu uzyskasz 40 milimetrów rtęci, a następnie zwolnij białe wypustki i wyjmij strzykawkę i ciśnieniomierz. Na stronie Konwersja jednostek wybierz wartość minus i podświetl najwyższy płaskowyż, aby wskazać 40 milimetrów słupa rtęci.
Kliknij strzałkę 0,1, wprowadź wartość 100 i podświetl najniższy płaskowyż, aby wskazać zero milimetrów słupa rtęci. Kliknij strzałkę liczby 0,2, wprowadź zero, wybierz milimetry słupa rtęci jako jednostki i kliknij przycisk OK. W oknie Bridge Amp kliknij przycisk OK i skalibruj przetworniki ciśnienia hydrostatycznego dla kanału drugiego IOP, jak pokazano, używając 100 milimetrów słupa rtęci dla najwyższego plateau i zera dla najniższego plateau.
Aby podłączyć jednostkę tylnego segmentu TAS do systemu akwizycji danych, umieść jednostkę tylnego segmentu TAS w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i podłącz rurkę ICP z portu wyjściowego przetwornika ciśnienia ICP kanału pierwszego. Podłącz rurkę IOP z portu wyjściowego do przetwornika ciśnienia IOP kanału drugiego. Na stronie Widok wykresu wybierz pozycję Rozpocznij próbkowanie i ustaw szybkość próbkowania na Wolno i jedną minutę.
Następnie wyreguluj strzykawki na pierścieniu, stojąc w górę lub w dół, aby wyregulować ciśnienie ICP i IOP zgodnie z wymaganiami protokołu, lub umieść je na pompach perfuzyjnych w celu regulacji ciśnienia. W tej reprezentatywnej analizie badano utrzymanie średnich normalnych różnic ciśnień w obu komorach za pomocą różnych parametrów warunków IOP i ICP. Aby zapewnić żywotność tkanki, podłoże w tkance było wymieniane co 48 godzin.
Minimalny wzrost ciśnienia wystąpił w czasie wymiany pożywki i nie wpłynął na żywotność ani morfologię głowy nerwu wzrokowego, co zaobserwowano w analizie immunohistochemicznej i ekspresji kolagenu dożylnie w 14 i 30 dniu eksperymentu. Zwiększanie lub zmniejszanie ciśnienia wewnątrzgałkowego w różnych punktach czasowych pozwala na utrzymanie zakresu podwyższonego gradientu ciśnienia translaminarnego przez siedem dni. Po siedmiu dniach podwyższonego gradientu ciśnienia translaminarnego zaobserwowano bańki i pogrubienie w tylnych segmentach, a ekspresja kolagenu IV wykazuje pogrubione wiązki ze zwiększoną ekspresją sygnału w okresie eksperymentalnym.
Obrazowanie fazowe ujawnia zdrowe komórki zwojowe siatkówki w warstwie komórek zwojowych bez baniek w segmentach kontrolnych, podczas gdy obrazy z kultur o podwyższonym translaminarnym gradiencie ciśnienia wykazują rozległe bańki bez komórek zwojowych siatkówki pozostających w warstwie włókien nerwowych siatkówki i zwiększoną przebudowę macierzy pozakomórkowej. Technika ta pozwoli naukowcom skutecznie badać paradygmaty chorób biomechanicznych i odkrywać ciśnienie translaminarne w ludzkim oku ukierunkowane na patogenezę molekularną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy autonomiczny system translaminarny (TAS) do aplikacji okularnej, zaprojektowany w celu niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego. Poprzez wytworzenie translaminarnego gradientu ciśnień, system ma na celu symulację jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego w badaniach nad chorobami oczu oraz stanami wpływającymi na ciśnienie wewnątrzczaszkowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Neurobiologia
Wstęp
- Badania nad gradientami ciśnienia związanymi ze zdrowiem nerwu wzrokowego.
- Znaczenie badania ciśnienia wewnątrzczaszkowego w chorobach oczu.
- Analiza schorzeń takich jak jaskra i urazy czaszkowo-mózgowe.
Cel badania
- Opracowanie systemu do badania różnic ciśnień w oku i mózgu.
- Dostarczenie modelu do badania chorób związanych ze zmianami ciśnienia.
- Pogłębienie zrozumienia potencjalnych interakcji między ciśnieniem wewnątrzgałkowym a wewnątrzczaszkowym.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie translaminarnego systemu autonomicznego (TAS) do regulacji ciśnienia.
- Przygotowanie próbek ludzkiego oka w celu stworzenia kontrolowanego układu eksperymentalnego.
- Monitorowanie i kalibrowanie czujników ciśnienia w celu gromadzenia danych dotyczących IOP i ICP.
- Strzykawki doprowadzające i odprowadzające były używane do wymiany medium oraz zarządzania ciśnieniem.
Główne wyniki
- Pomyślne ustanowienie średnich, normalnych różnic ciśnień w modelu TAS.
- Minimalne zaburzenia ciśnienia podczas wymiany płynów, zapewniające żywotność tkanek.
- Obserwacje obejmowały zachowanie stanu stacjonarnego morfologii głowy nerwu wzrokowego w ramach ram czasowych eksperymentu.
Wnioski
- Badanie wykazuje możliwość wykorzystania modelu TAS w badaniach nad ciśnieniem wewnątrzgałkowym.
- Podkreśla ono potencjalne zastosowania w zrozumieniu jaskry oraz schorzeń z nią związanych.
- Istotne są wnioski dla przyszłych badań nad oddziaływaniami ciśnienia i ich wpływem na stan nerwu wzrokowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Translaminarny system autonomiczny (TAS) odpowiada na krytyczną niezaspokojoną potrzebę w badaniach okulistycznych i neurookulistycznych, umożliwiając niezależną regulację ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego w tylnych odcinkach oka pobranych od ludzkich dawców. Ten model ex vivo wspiera mechanistyczną weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z jaskrą, urazami czaszkowo-mózgowymi, idiopatycznym nadciśnieniem wewnątrzczaszkowym oraz zespołem neurookularnym związanym z lotami kosmicznymi, zachowując strukturę i złożoność tkanek głowy nerwu wzrokowego. Zwiększa on pewność prognostyczną w przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych, dostarczając systemu istotnego z punktu widzenia jednostek chorobowych, co ogranicza zależność od modeli zwierzęcych i poprawia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modulowanie translaminarnych gradientów ciśnienia w celu badania paradygmatów patogennych w tkankach ludzkich.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez utrzymanie integralności i złożoności strukturalnej głowy nerwu wzrokowego w kontrolowanych warunkach ciśnienia.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu dzięki modelowaniu systemowemu istotnemu z punktu widzenia choroby, które odzwierciedla ludzką patofizjologię neurodegeneracji ocznej związanej z ciśnieniem.
Przesiewy i opracowanie testów analitycznych
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane tylne odcinki oka człowieka do późniejszej oceny związków poprzez stworzenie stabilnych, powtarzalnych środowisk z kontrolowanym ciśnieniem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki niezależnej regulacji IOP i ICP przy użyciu skalibrowanych przetworników ciśnienia hydrostatycznego oraz protokołów wymiany płynu perfuzyjnego.
- Wartość skalowalności: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dzięki wymianie medium co 48 godzin bez naruszania żywotności lub morfologii tkanek, co wspiera badania podłużne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez zachowanie struktury tkanki głowy nerwu wzrokowego oraz umożliwienie podłużnej obserwacji wgłębienia, pogrubienia i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach podwyższonego gradientu ciśnienia translaminarnego.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez kwantyfikację zmian strukturalnych i molekularnych (np. ekspresji kolagenu IV) związanych z patogenezą indukowaną ciśnieniem w określonych punktach czasowych (np. siedem dni).
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie biomechanicznych paradygmatów choroby oraz molekularnej patogenezy ukierunkowanej na ciśnienie translaminarne w ludzkim systemie ex vivo.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model TAS integruje się z kontinuum odkryć naukowych, od wczesnej walidacji celu po badania przedkliniczne, zapewniając system relewantny dla człowieka i podatny na modulację ciśnienia, który wspiera testowanie hipotez, przygotowanie testów analitycznych oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie niezależnej manipulacji IOP i ICP w celu generowania translaminarnych gradientów ciśnienia związanych z patologią główki nerwu wzrokowego.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki powtarzalnej kontroli ciśnienia, utrzymaniu żywotności tkanki oraz ilościowym wynikom z przetworników ciśnienia i analiz immunohistochemicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (IOP, ICP, gradient translaminarny) oraz jakościowych odczytów (ekspresja kolagenu IV, obrazowanie fazowe, morfologia tkanki), co umożliwia porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez obserwacje istotne dla przebiegu choroby, takie jak ekskawacja, utrata komórek zwojowych siatkówki i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej pod wpływem długotrwałego stresu ciśnieniowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako możliwość wielokrotnego wykorzystania dzięki standaryzacji konfiguracji, wymianie medium co 48 godzin i długoterminowej żywotności kultur do 30 dni, co wspiera powtarzalne cykle eksperymentalne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celów terapeutycznych, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w neurodegeneracji oka związanej z ciśnieniem oraz modelowanie patofizjologiczne istotne dla ludzi.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność protokołów regulacji ciśnienia oraz utrzymania tkanek.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji go/no-go, efektywność kapitałowa dzięki ograniczeniu wykorzystania zwierząt oraz zmniejszenie biologicznego ryzyka w późnych etapach rozwoju leków oftalmicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów skorygowana o ryzyko w oparciu o profile odpowiedzi na ciśnienie translaminarne oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na morfologii tkanek ludzkich i danych biomarkerowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obchodzenia się z tkanką oczną, kalibracji przetworników ciśnienia oraz technik aseptycznych podczas wymiany medium i konfiguracji systemu.
- Metoda jest zależna od instrumentarium, w tym od hydrostatycznych przetworników ciśnienia, wielokanałowego wzmacniacza mostkowego, strzykawek perfuzyjnych, kraników, filtrów oraz inkubatora w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów ciśnienia między zespołami, przygotowania tkanek (usunięcia pochewki nerwu wzrokowego i ciała szklistego) oraz procedur uszczelniania z wykorzystaniem o-ringów z żywicy epoksydowej i śrub.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne wynikające z różnorodności dawców w zakresie integralności segmentu tylnego, grubości twardówki i płaskości siatkówki, co wymaga przycinania i rozprostowywania siatkówki pęsetą w celu optymalnego dopasowania do komory.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność precyzyjnej kalibracji ciśnienia, unikania pęcherzyków powietrza w liniach z cieczą oraz monitorowania minimalnych wzrostów ciśnienia podczas wymiany medium w celu zachowania żywotności tkanki.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Translaminar Autonomous System (TAS) Setup
1:42
Human Whole Eye Globe Preparation
2:24
IOP (Bottom) Chamber Setup
3:20
ICP (Top) Chamber Setup
3:52
Data Recording System Setup
6:56
Results: Representative Translaminar Autonomous System Model Analyses
8:26
Conclusion
