Translaminarny model autonomicznego systemu do modulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i śródczaszkowego w tylnych segmentach dawcy człowieka
April 24th, 2020
Opisujemy i szczegółowo opisujemy zastosowanie translaminarnego systemu autonomicznego. System ten wykorzystuje ludzki tylny odcinek do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrz segmentu (wewnątrzgałkowego) i otaczającego nerw wzrokowy (wewnątrzczaszkowego) w celu wytworzenia translaminarnego gradientu ciśnienia, który naśladuje cechy jaskrowej neuropatii nerwu wzrokowego.
Ten nowatorski autonomiczny system translaminarny oka wykorzystuje ludzki tylny segment do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i wewnątrzczaszkowego w celu wygenerowania translaminarnego gradientu ciśnienia. Model TAS umożliwia ocenę ciśnienia śródczaszkowego u człowieka w sposób przedkliniczny ex vivo, który wcześniej nie był możliwy do zbadania. Model ten może być potencjalnie wykorzystany do badania chorób takich jak jaskra, urazowe uszkodzenie mózgu, idiopatyczne nadciśnienie śródczaszkowe i zespół nerwowo-oczny związany z lotami kosmicznymi.
Aby ustawić strzykawki napływowe, załaduj 30-mililitrową strzykawkę 30 mililitrami interesującego Cię płynu perfuzyjnego i podłącz trójdrożny kurek odcinający do strzykawki. Podłącz filtr hydrofilowy o średnicy 0,22 mikrometra do kurka odcinającego i podłącz adapter króćca luer o rozmiarze 15 do filtra hydrofilowego o średnicy 0,22 mikrometra. Po usunięciu pęcherzyków powietrza z zestawu strzykawki należy przymocować rurkę do adaptera króćca luer i zamknąć boczny port kurka odcinającego nieodpowietrzoną uniwersalną nasadką blokującą.
Po skonfigurowaniu drugiej strzykawki napływowej, jak właśnie pokazano, oznacz jeden kanał strzykawki jednym ICP, a drugi kanał strzykawki oznacz dwoma IOP. Następnie ustawić strzykawki odpływowe, jak pokazano, ale bez ładowania strzykawek medium infuzyjnego. Aby przygotować próbkę całej gałki oka ludzkiego, należy usunąć osłonkę nerwu wzrokowego i usunąć ciało szkliste z tylnego segmentu.
Aby zapewnić dobre dopasowanie do okrągłej kopuły komory IOP, w razie potrzeby przytnij dodatkową twardówkę z tylnego segmentu i użyj kleszczy, aby upewnić się, że siatkówka jest równomiernie rozłożona na ludzkiej tylnej części segmentu. Następnie umieść segment w komorze IOP TAS nad okrągłą kopułą z nerwem wzrokowym skierowanym do góry i użyj O-ringu z żywicy epoksydowej i czterech, aby uszczelnić tylny segment. Aby skonfigurować komorę IOP, włóż rurkę do portów wejściowych i wyjściowych komory, a następnie włóż strzykawkę dopływającą IOP do portu wejściowego.
Włóż pustą strzykawkę z odpływem IOP do portu wyjściowego i użyj metody pchania/ciągnięcia, aby powoli wlewać medium perfuzyjne do portu dopływowego, aby napełnić tylną muszlę oczną, jednocześnie powoli wyciągając medium perfuzyjne przez strzykawkę odpływową, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z przewodów. Gdy zarówno rurki wlotowe, jak i wyjściowe są pozbawione pęcherzyków powietrza, należy zatrzymać infuzję i zablokować kurki odcinające w pozycji wyłączonej. Wyjąć strzykawkę z IOP w zespole filtra portu i napełnić strzykawkę dodatkowymi 30 milimetrami pożywki, a następnie ponownie włożyć zestaw strzykawki do zespołu filtra.
Aby ustawić komorę ICP, umieść komorę z tyłu tylnego segmentu, uważając, aby nerw wzrokowy znajdował się w górnej komorze i uszczelnij górną komorę czterema, a następnie włóż rurkę do portów wejściowych i wyjściowych komory ICP, strzykawkę wejściową ICP do portu wejściowego, i pustą strzykawkę odpływową ICP do portu wyjściowego, aby przepłukać system pożywką, jak właśnie pokazano. Aby skonfigurować system rejestracji danych, włącz ośmiokanałowe źródło zasilania i komputer, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Wybierz pozycję Plik i Nowy, a następnie wybierz pozycję Ustawienia i ustawienia kanału.
Wybierz trzy kanały i zmień ich nazwy zgodnie ze wskazaniami. Wybierz dwa miliwolty dla opcji Zakres na wszystkich kanałach, a następnie w kolumnie Obliczenia wybierz opcję Brak obliczeń dla kanałów pierwszego i drugiego. Wybierz opcję Arytmetyka dla kanału trzeciego W oknie Formuła, w obszarze Kanały, wybierz Ch 2.
W obszarze Funkcja wybierz opcję Math and Minus, a w obszarze Channels (Kanały) wybierz Ch 1. Aby skonfigurować i skalibrować przetworniki ciśnienia hydrostatycznego, podłącz przetworniki ciśnienia hydrostatycznego do przewodów przetworników podłączonych do wielokanałowego wzmacniacza mostkowego i podłącz pustą 30-mililitrową strzykawkę do bocznego portu przetwornika ciśnienia ICP kanału pierwszego. Przymocuj ciśnieniomierz do dolnej części przetwornika ciśnienia ICP w jednym kanale i kliknij strzałkę obok czasu próbkowania, aby ustawić prędkość próbkowania na 100.
Wybierz Bridge Amp, Filtr sieciowy i Zero i poczekaj, aż system się wyzeruje, uważając, aby nie przesunąć przetwornika ciśnienia. Następnie ściśnij białe wypustki przetwornika ciśnienia i przepchnij powietrze przez przetwornik, aż na ciśnieniomierzu uzyskasz 40 milimetrów rtęci, a następnie zwolnij białe wypustki i wyjmij strzykawkę i ciśnieniomierz. Na stronie Konwersja jednostek wybierz wartość minus i podświetl najwyższy płaskowyż, aby wskazać 40 milimetrów słupa rtęci.
Kliknij strzałkę 0,1, wprowadź wartość 100 i podświetl najniższy płaskowyż, aby wskazać zero milimetrów słupa rtęci. Kliknij strzałkę liczby 0,2, wprowadź zero, wybierz milimetry słupa rtęci jako jednostki i kliknij przycisk OK. W oknie Bridge Amp kliknij przycisk OK i skalibruj przetworniki ciśnienia hydrostatycznego dla kanału drugiego IOP, jak pokazano, używając 100 milimetrów słupa rtęci dla najwyższego plateau i zera dla najniższego plateau.
Aby podłączyć jednostkę tylnego segmentu TAS do systemu akwizycji danych, umieść jednostkę tylnego segmentu TAS w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i podłącz rurkę ICP z portu wyjściowego przetwornika ciśnienia ICP kanału pierwszego. Podłącz rurkę IOP z portu wyjściowego do przetwornika ciśnienia IOP kanału drugiego. Na stronie Widok wykresu wybierz pozycję Rozpocznij próbkowanie i ustaw szybkość próbkowania na Wolno i jedną minutę.
Następnie wyreguluj strzykawki na pierścieniu, stojąc w górę lub w dół, aby wyregulować ciśnienie ICP i IOP zgodnie z wymaganiami protokołu, lub umieść je na pompach perfuzyjnych w celu regulacji ciśnienia. W tej reprezentatywnej analizie badano utrzymanie średnich normalnych różnic ciśnień w obu komorach za pomocą różnych parametrów warunków IOP i ICP. Aby zapewnić żywotność tkanki, podłoże w tkance było wymieniane co 48 godzin.
Minimalny wzrost ciśnienia wystąpił w czasie wymiany pożywki i nie wpłynął na żywotność ani morfologię głowy nerwu wzrokowego, co zaobserwowano w analizie immunohistochemicznej i ekspresji kolagenu dożylnie w 14 i 30 dniu eksperymentu. Zwiększanie lub zmniejszanie ciśnienia wewnątrzgałkowego w różnych punktach czasowych pozwala na utrzymanie zakresu podwyższonego gradientu ciśnienia translaminarnego przez siedem dni. Po siedmiu dniach podwyższonego gradientu ciśnienia translaminarnego zaobserwowano bańki i pogrubienie w tylnych segmentach, a ekspresja kolagenu IV wykazuje pogrubione wiązki ze zwiększoną ekspresją sygnału w okresie eksperymentalnym.
Obrazowanie fazowe ujawnia zdrowe komórki zwojowe siatkówki w warstwie komórek zwojowych bez baniek w segmentach kontrolnych, podczas gdy obrazy z kultur o podwyższonym translaminarnym gradiencie ciśnienia wykazują rozległe bańki bez komórek zwojowych siatkówki pozostających w warstwie włókien nerwowych siatkówki i zwiększoną przebudowę macierzy pozakomórkowej. Technika ta pozwoli naukowcom skutecznie badać paradygmaty chorób biomechanicznych i odkrywać ciśnienie translaminarne w ludzkim oku ukierunkowane na patogenezę molekularną.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nowy autonomiczny system translaminarny oka (TAS) zaprojektowany do niezależnej regulacji ciśnienia wewnątrzgałkowego i czaszkowego. Poprzez stworzenie gradientu ciśnienia translaminarnego, system ma na celu naśladowanie neuropatii nerwu wzrokowego związanej z jaskrem w celu badań nad chorobami oka i stanami wpływającymi na ciśnienie czaszkowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Oftalmologia
- Neurobiologia
Tło
- Badania nad gradientami ciśnienia związanymi ze zdrowiem nerwu wzrokowego.
- Znaczenie badania ciśnienia czaszkowego w chorobach oka.
- Eksplorowanie stanów takich jak jaskr i uraz mózgu.
Cel badania
- Opracowanie systemu do badania różnic ciśnienia w oku i mózgu.
- Dostarczenie modelu do badania chorób związanych ze zmianami ciśnienia.
- Poprawa zrozumienia potencjalnych interakcji między ciśnieniem okołorogówkowym i czaszkowym.
Stosowane metody
- Wykorzystanie autonomicznego systemu translaminarnego (TAS) do regulacji ciśnienia.
- Przygotowanie próbek ludzkiego oka w celu stworzenia kontrolowanego eksperymentu.
- Monitorowanie i kalibracja czujników ciśnienia w celu zebrania danych na temat IOP i ICP.
- Strzykawki do napełniania i opróżniania służyły do wymiany medium i zarządzania ciśnieniem.
Główne wyniki
- Pomyślne ustanowienie średnich normalnych różnic ciśnienia w modelu TAS.
- Minimalne zaburzenia ciśnienia podczas wymiany płynów, utrzymując żywotność tkanki.
- Obserwacje obejmowały stabilne zachowanie morfologii główki nerwu wzrokowego w całym czasie eksperymentu.
Wnioski
- Badanie wykazuje wykonalność wykorzystania modelu TAS do badań nad ciśnieniem okołorogówkowym.
- Podkreśla potencjalne zastosowania do zrozumienia jaskry i pokrewnych stanów.
- Implikacje dla przyszłych badań nad interakcjami ciśnienia i ich wpływem na zdrowie nerwu wzrokowego są istotne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The translaminar autonomous system (TAS) addresses a critical unmet need in ophthalmic and neuro-ophthalmic research by enabling independent regulation of intraocular and intracranial pressures in human donor posterior segments. This ex vivo model supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses related to glaucoma, traumatic brain injury, idiopathic intracranial hypertension, and spaceflight-associated neuro-ocular syndrome by preserving optic nerve head tissue structure and complexity. It enhances predictive confidence in preclinical target validation by providing a disease-relevant system that reduces reliance on animal models and improves translational continuity from discovery to preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating translaminar pressure gradients to study pathogenic paradigms in human tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining optic nerve head integrity and structural complexity under controlled pressure conditions.
- Predictive Value: Improves target confidence through disease-relevant system modeling that reflects human pathophysiology of pressure-related ocular neurodegeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated human posterior segments for downstream compound evaluation by establishing stable, reproducible pressure-controlled environments.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via independent IOP and ICP regulation using calibrated hydrostatic pressure transducers and perfusion fluid exchange protocols.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse through medium exchange every 48 hours without compromising tissue viability or morphology, supporting longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving optic nerve head tissue structure and enabling longitudinal observation of cupping, thickening, and extracellular matrix remodeling under elevated translaminar pressure gradients.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying structural and molecular changes (e.g., collagen IV expression) linked to pressure-induced pathogenesis over defined timepoints (e.g., seven days).
- Mechanistic De-risking: Allows study of biomechanical disease paradigms and molecular pathogenesis targeting translaminar pressure in a human-relevant ex vivo system.
Pipeline & Workflow Integration
The TAS model integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research by providing a human-relevant, pressure-modulatable system that supports hypothesis testing, assay readiness, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling independent manipulation of IOP and ICP to generate translaminar pressure gradients linked to optic nerve head pathology.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible pressure control, tissue viability maintenance, and quantitative outputs from pressure transducers and immunohistochemical analysis.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (IOP, ICP, translaminar gradient) and qualitative readouts (collagen IV expression, phase imaging, tissue morphology) that enable comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant observations of cupping, retinal ganglion cell loss, and extracellular matrix remodeling under sustained pressure stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability via standardized setup, medium exchange every 48 hours, and long-term culture viability up to 30 days, supporting repeated experimental cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in pressure-related ocular neurodegeneration, and human-relevant pathophysiological modeling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of pressure regulation and tissue maintenance protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through reduced animal use, and decreased late-stage biological risk in ophthalmic drug development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on translaminar pressure response profiles and advancement decisions grounded in human tissue morphology and biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ocular tissue handling, pressure transducer calibration, and aseptic technique for medium exchange and system setup.
- Dependent on instrumentation including hydrostatic pressure transducers, multi-channel bridge amplifier, perfusion syringes, stop cocks, filters, and a 37°C, 5% CO₂ incubator.
- Necessitates cross-team standardization of pressure protocols, tissue preparation (optic nerve sheath and vitreous removal), and sealing procedures using epoxy resin O-rings and screws.
- Involves adaptation considerations across donor variability in posterior segment integrity, scleral thickness, and retinal flatness, requiring trimming and forceps-based retina spreading for optimal chamber fit.
- Includes practical limitations such as the need for precise pressure calibration, avoidance of air bubbles in fluid lines, and monitoring for minimal pressure increases during medium exchange to preserve tissue viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Translaminar Autonomous System (TAS) Setup
1:42
Human Whole Eye Globe Preparation
2:24
IOP (Bottom) Chamber Setup
3:20
ICP (Top) Chamber Setup
3:52
Data Recording System Setup
6:56
Results: Representative Translaminar Autonomous System Model Analyses
8:26
Conclusion
