Analiza cytometrii przepływowej podzbiorów komórek odpornościowych w mysiej śledzionie, szpiku kostnym, węzłach chłonnych i tkance maziowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów

Nasz protokół umożliwia szczegółową identyfikację i analizę monocytów i makrofagów oraz limfocytów T i ich odpowiednich podzbiorów w neuronach i komórkach jajowych oraz różnych innych tkankach układu odpornościowego. Nasza technika ułatwia wiarygodne pobieranie żywych komórek odpornościowych z błony maziowej i innych istotnych tkanek w celu kompleksowej charakterystyki odpowiedzi immunologicznej choroby zwyrodnieniowej stawów. W celu wyizolowania tkanek będących przedmiotem zainteresowania od myszy modelowej z chorobą zwyrodnieniową stawów, z myszą w pozycji leżącej, przetrzyj klatkę piersiową, brzuch i nogi 70% etanolem.

Użyj nożyczek, aby ostrożnie otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha, pozostawiając nienaruszoną jamę brzuszną. I delikatnie odciągnij skórę po prawej stronie zwierzęcia od leżącego poniżej mięśnia, pozostawiając podskórną tkankę tłuszczową przyczepioną do skóry. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i użyj dwóch zakrzywionych cienkich kleszczyków, aby delikatnie wydobyć tkankę tłuszczową znajdującą się przy udzie.

Po zidentyfikowaniu trzech naczyń krzyżowych użyj cienkich kleszczy preparacyjnych, aby usunąć pachwinowy węzeł chłonny znajdujący się na skrzyżowaniu naczyń, uważając, aby nie pęknąć kapsułki. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostały tłuszcz z powierzchni węzła chłonnego i otwórz jamę brzuszną. Jeśli nie widać pozostałego tłuszczu, natychmiast umieść węzeł chłonny we wcześniej przygotowanej i oznaczonej sześciodołkowej płytce wypełnionej 0,5 mililitra pożywki RPMI.

Następnie otwórz jamę brzuszną. Użyj cienkich nożyczek, aby wyciąć śledzionę i delikatnie usunąć jelita, aby odsłonić aortę i jej rozwidlenie. Następnie natychmiast umieść śledzionę we wcześniej przygotowanym i oznaczonym sześciu dobrze rozegranych wypełnionych 0,5 mililitra pożywki RPMI.

Usuń węzeł chłonny biodrowy znajdujący się w końcowym segmencie aorty brzusznej i początku tętnicy biodrowej wspólnej i ostrożnie usuń skórę z obu kończyn tylnych. Natychmiast umieść węzeł chłonny we wcześniej przygotowanej i oznaczonej sześciodołkowej płytce z 0,5 mililitra pożywki RPMI, zbierając wszystkie węzły chłonne od dwóch zwierząt. Za pomocą cienkich nożyczek lub skalpela oczyść lewą kość udową z przyczepionej tkanki mięśniowej i ostrożnie odłącz zarówno kolano, jak i staw biodrowy, pozostawiając całą kość nienaruszoną podczas usuwania kości udowej.

Następnie umieść kość udową we wcześniej przygotowanej i oznaczonej sześciodołkowej płytce wypełnionej 0,5 mililitra pożywki RPMI. Zidentyfikuj ścięgno rzepki prawego stawu kolanowego i użyj cienkich nożyczek, aby usunąć przylegającą tkankę mięśniową proksymalnie do stawu, aż odsłoniętych zostanie około pięciu mililitrów ścięgna mięśnia czworogłowego bliższego rzepce. Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego około trzech do czterech milimetrów proksymalnie rzepki, aby utworzyć uchwyt i użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie odciągnąć napięcie od stawu, aby odsłonić krawędzie przyczepu torebki stawowej.

Zaczynając od kości udowej i przesuwając się w kierunku kości piszczelowej, użyj skalpela, aby ostrożnie przeciąć wzdłuż krawędzi torebki stawowej po obu stronach, zachowując delikatną przyczepność ścięgna mięśnia czworogłowego. Gdy blok tkanki maziowej jest przyczepiony tylko do kości piszczelowej, śródstawowa poduszeczka tłuszczowa powinna być wyraźnie widoczna dystalnie do rzepki i może być delikatnie odłączona od stawu i przedniej części Minsky'ego. Następnie przeciąć pozostałą część torebki stawowej, aby usunąć blok tkanki maziowej i natychmiast umieścić go we wcześniej przygotowanej i oznakowanej sześciodołkowej płytce wypełnionej 1,5 mililitra pożywki RPMI.

Po zebraniu wszystkich tkanek umieść dwie połączone śledziony na stan na sitku do komórek o średnicy 70 mikrometrów w probówce o pojemności 15 mililitrów i użyj sterylnego tłoka strzykawkowego o pojemności trzech mililitrów, aby delikatnie przemasować tkanki przez filtr siatkowy, często przepłukując sitko łącznie sześcioma mililitrami pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. Osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach rozdymki do lizy czerwonych krwinek. Po pięciu minutach zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów PBS i odwiruj komórki.

Gdy nie zaobserwuje się już czerwonych krwinek, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego PBS w celu policzenia. W celu przetworzenia węzłów chłonnych umieść wszystkie cztery węzły chłonne na sitku do komórek o średnicy 70 mikrometrów w nowej probówce o pojemności 15 mililitrów i użyj nowego sterylnego tłoka o pojemności trzech mililitrów, aby delikatnie przetrzeć węzły chłonne przez siatkę do zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS w celu policzenia. Aby wyizolować szpik kostny, użyj kleszczyków do kciuków, aby ostrożnie chwycić nienaruszoną kość udową i użyj ostrych nożyczek, aby odciąć sam koniec bliższej części kości udowej.

Włóż igłę o rozmiarze 23 do środka wcięcia międzykłykciowego kości udowej i obróć igłę, delikatnie naciskając, aby wywiercić otwór w wcięciu. Zmieniając igłę w razie potrzeby, przepłukać zawartość kości sześcioma mililitrami RPMI uzupełnionymi 10% FBS na sitko o średnicy 70 mikrometrów na nowej 15-mililitrowej probówce i użyć nowego tłoka strzykawki o pojemności trzech mililitrów, aby delikatnie przecisnąć szpik kostny przez siatkę. Następnie wykonaj krok RBC, jak pokazano dla śledziony.

Gdy nie zaobserwuje się już czerwonych krwinek, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżego PBS w celu policzenia. Do przetwarzania tkanki maziowej użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby pokroić dwa bloki tkanki maziowej na drobne kawałki i przenieść próbki do nowej 15-mililitrowej probówki. Przepłukać pojemnik zbiorczy 500 mikrolitrami pożywki, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki i tkanki maziowe, a następnie wyciągnąć płyn do probówki do pobierania próbek.

Następnie dodaj wystarczającą objętość enzymu, aby osiągnąć końcowe stężenie jednej jednostki na mililitr i trawić próbkę tkanki maziowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze przez dwie godziny rotatora. Upewnij się, że podczas umieszczania rurek w rotatorze jest wystarczający ruch. Pod koniec inkubacji przerwij trawienie ośmioma mililitrami RPMI uzupełnionymi 10% FBS i przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Wypłucz starą 15-mililitrową rurkę pięcioma mililitrami pożywki i użyj jej do umycia filtra. Następnie osadź komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach PBS w celu zliczenia. Aby przeprowadzić barwienie żywotności izolowanych komórek odpornościowych, dodaj pięć razy 10 do pięciu komórek każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków dwóch różnych 96-dołkowych płytek z dnem w kształcie litery U i zbierz komórki na dno każdej studzienki.

Zawsze należy uwzględnić wystarczającą ilość niewybarwionych komórek każdego typu tkanki jako kontrolę ujemną. Umyj komórki 200 mikrolitrami PBS i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach komórki w przepuszczalnym barwniku reaktywnym aminami na dołek przez 15 minut inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwa razy w 200 mikrolitrach buforu FACS na przepłukanie i ponownie zawiesić każdą osadkę w 100 mikrolitrach odpowiedniego przeciwciała lub koktajlu kontrolnego.

Jeśli zarówno barwienie wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe jest przeprowadzane w tym samym czasie, wykonaj teraz etap barwienia zewnątrzkomórkowego. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronionej przed światłem, umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu FACS na studzienkę i ponownie zawiesić komórki i płytkę panelową podzbioru monocytów w 250 mikrolitrach buforu FACS uzupełnionego jednym milimolowym EDTA. Wykonaj ten krok tylko wtedy, gdy nie jest planowane barwienie wewnątrzkomórkowe, w przeciwnym razie przejdź do aspektu barwienia wewnątrzkomórkowego protokołu.

Następnie przenieś każdą próbkę podzbioru monocytów do odpowiedniej odpowiedniej probówki FACS na lodzie chronionym przed światłem. W celu barwienia międzykomórkowego komórek panelowych podzbioru limfocytów T, ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach buforu utrwalającego z odpowiedniego zestawu do utrwalania i przepuszczalności na 40-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronioną przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami buforu do przemywania permeabilizacji i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach odpowiedniego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania lub koktajlu kontrolnego na 40-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronioną przed światłem.

Następnie umyj komórki dwa razy w 200 mikrolitrach buforu do przemywania przepuszczalności na pranie. I ponownie zawiesić komórki w 250 mikrolitrach buforu FACS plus EDTA przed przeniesieniem próbek do odpowiednich odpowiednich probówek FACS na lodzie chronionym przed światłem. W tym miejscu można zaobserwować hierarchiczną strategię bramkowania dla panelu podzbioru monocytów na komórkach odpornościowych pobranych ze szpiku kostnego zwierząt poddanych DMM.

Niepoplamione trolle mogą być używane do określania prawdziwych negatywów dla plamy martwej żywej, a bramki mogą być regulowane za każdym razem, gdy eksperyment jest przeprowadzany, jeśli jest to konieczne. W tej reprezentatywnej analizie komórki odpornościowe wyizolowano z tkanek maziowych i wybarwiono markerami powierzchni zewnątrzkomórkowej, sześć tygodni po DMM lub pozorowanej operacji kontrolnej. U zwierząt leczonych DMM obserwuje się wyższy odsetek makrofagów Ly-SC dodatnich MHC2 i M2 w porównaniu z populacjami komórek obserwowanymi u myszy po operacji pozorowanej.

W tym miejscu można zaobserwować hierarchiczną strategię bramkowania dla dodatkowego i wewnątrzkomórkowego panelu limfocytów T na komórkach odpornościowych wyizolowanych ze śledziony zwierząt leczonych DMM. Większy odsetek komórek TH1 obserwuje się w węzłach chłonnych i tkankach maziowych zwierząt DMM, a także większą liczbę komórek regulatorowych T i komórek TH17. Aby zapewnić pobieranie próbek wysokiej jakości, tkanki muszą być pobierane w sposób szybki, skrupulatny i konsekwentny.

Po wyizolowaniu komórek odpornościowych można przeprowadzić inne dalsze analizy, takie jak RTPCR, hodowla komórkowa i odpoczynek na krwi, aby rzucić światło na interesujące procesy molekularne.