W pełni zautomatyzowane śledzenie nóg u swobodnie poruszających się owadów przy użyciu funkcji segmentacji i śledzenia nóg (FLLIT)
23 kwietnia 2020
Opisujemy szczegółowe protokoły korzystania z FLLIT, w pełni zautomatyzowanej metody uczenia maszynowego do śledzenia ruchów pazurów nóg u swobodnie poruszających się Drosophila melanogaster i innych owadów. Protokoły te mogą być używane do ilościowego pomiaru subtelnych ruchów chodu u much dzikich typów, zmutowanych much i modeli neurodegeneracji much.
FLLIT to algorytm, który oblicza skład ciała i nóg śledzonego zwierzęcia. Jest to przydatne do scharakteryzowania obwodów, które leżą u podstaw zarówno normalnych, jak i chorobowych zachowań związanych z chodzeniem. Unikalną cechą FLLIT jest to, że nie wymaga żadnych zestawów danych z adnotacjami użytkownika do trenowania, a zatem jest w pełni zautomatyzowany.
Ale także automatycznie analizuje dane toru, tworząc serię pomiarów chodu, wykresy chodu do wizualizacji i wideo z trasy. Procedurę zademonstruje Animesh Banerjee, kolega po doktorze z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że stacja nagraniowa jest wyposażona w szybką kamerę ze stopniem nad nią, w którym znajduje się komora areny.
Umieść diody LED na podczerwień w górnej części stolika z dyfuzorem między kamerą a próbką. Około 40 minut przed rozpoczęciem nagrywania przenieś muchy do pustego podłego zbiornika na lodzie na pięć do siedmiu minut. Podczas gdy muchy są uspokajane, użyj wody i chusteczki, aby oczyścić arenę i szklane zjeżdżalnie komory i przyklej taśmą jedną ze szklanych szkiełek pod komorą.
Za pomocą czystej szczotki przenieś jedną znieczuloną muchę do komory i zabezpiecz komorę drugim szkiełkiem i taśmą. Następnie pozwól muszce komorowej zaaklimatyzować się w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Aby wygenerować filmy do analizy FLLIT, najpierw włącz źródło zasilania i otwórz aplikację przeglądarki w podłączonym systemie komputerowym.
Zmień liczbę klatek na sekundę nagrywania na 1 000 klatek na sekundę i ustaw czas otwarcia migawki na jedną milisekundę. Umieść komorę z muchą na arenie nagrywającej i kliknij przycisk NA ŻYWO. Potwierdzono, że kamera skupia się na czubkach nóg, gdy mucha idzie pionowo po podłodze komory i kliknij przycisk Nagraj.
Podczas nagrywania upewnij się, że mucha idzie po stosunkowo prostej trajektorii, nie dotykając krawędzi areny, chodzi co najmniej trzy kroki na nogę, nie zatrzymuje się podczas spaceru i że przebyty dystans jest równy co najmniej półtorej długości ciała. Na końcu analizy kliknij przycisk Nagraj gotowe, aby zatrzymać nagrywanie i zapisać pliki w formacie mraw lub tiff w odpowiednich folderach. Aby zainstalować FLLIT, najpierw pobierz program na dowolny system operacyjny.
Wyodrębnij zawartość pliku zip i pobierz przykładowe zestawy danych. Aby zainstalować FLLIT w Ubuntu, przejdź do katalogu FLLIT/Compiled i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Otwórz w Terminalu. Pobierz przykładowy zestaw danych i utwórz folder data w obszarze FLLIT-master/Compiled, w którym zostaną umieszczone foldery zestawu danych.
Zainstaluj biblioteki wykonawcze MATLAB w katalogu HOME/MCR. Po zakończeniu instalacji biblioteki wykonawczej MATLAB wydaj polecenie, aby upewnić się, że prawa do pliku wykonywalnego są rejestrowane w FLLIT. Następnie wprowadź polecenie, aby uruchomić FLLIT.
W celu segmentacji wideo przekonwertuj plik na pojedyncze pliki TIFF i zapisz przekonwertowane pliki w folderze danych FLLIT. Po przesłaniu wszystkich plików uruchom FLLIT. W wyskakującym oknie wybierz wartość 0, aby przeprowadzić tylko segmentację nóg lub wybierz 1, aby uwzględnić śledzenie nóg z segmentacją nóg
.Wybierz folder zawierający obrazy TIFF klatka po klatce filmu, który ma być śledzony, oraz plik zainteresowania, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Następnie kliknij Gotowe, aby rozpocząć segmentację i śledzenie wybranego filmu. Aby sprawdzić dokładność śledzenia i przeprowadzić korektę błędów, kliknij opcję Wybierz folder danych, a następnie wybierz folder, który ma być śledzony.
Kliknij opcję Wyświetl śledzenie i sprawdź oznaczenia wszystkich nóg w pierwszej klatce. Jeśli noga jest nieprawidłowo oznaczona i wymagana jest korekta, kliknij przycisk Wstrzymaj wyświetlanie i dostosuj prognozę. W panelu Ramię do dopasowania wybierz ramię, które wymaga korekty, a następnie kliknij dwukrotnie prawidłowe położenie tego ramienia w oknie obrazu.
Następnie kliknij Zapisz i wyjdź. Aby przetworzyć posegmentowane i śledzone dane, kliknij opcję Przetwarzanie danych. Najpierw oblicz rzeczywiste pole widzenia przechwyconego wideo, aby można było zmierzyć parametry bramki.
W wyskakującym okienku wprowadź liczbę klatek na sekundę, z jaką nagrywane jest wideo i wprowadź obliczone pole widzenia w milimetrach. Aby uzyskać dostęp do wyników śledzenia, otwórz foldery wyników i śledzenia. Aby wygenerować film ze śledzoną muchą, wybierz opcję Utwórz wideo.
Po segmentacji, śledzeniu i przetwarzaniu danych nóg, FLLIT automatycznie generuje surowe dane dotyczące pozycji ciała i każdego pazura nogi, 20 parametrów chodu i towarzyszących wykresów oraz śledzonych filmów. SCA3 charakteryzuje się ataksyjnym chodem z skręcaniem ciała, nieregularnym ułożeniem stopy i krótkimi, chwiejnymi krokami. Aby scharakteryzować chód zmutowanych much SCA3 i zbadać, czy wykazują one chód podobny do chodu u ludzi, można przeanalizować odpowiednie parametry chodu generowane przez FLLIT.
Muchy SCA3-Q84 wykazują więcej skrętów, nieregularne ułożenie stopy, o czym świadczy niska regularność śladu i zwiększone nakładanie się domen nóg, powiększone domeny nóg pod względem długości i powierzchni oraz zmniejszona długość kroku. FLLIT może również wygenerować film pokazujący śledzoną muchę i nogi w widokach wyśrodkowanych na arenie i skoncentrowanych na ciele, trajektorii ciała, kierunku kierunku oraz pionowych i bocznych przemieszczeń każdej nogi. W porównaniu do much SCA3-Q27, muchy SCA3-Q84 wykazują nieregularne, przecinające się domeny nóg o różnych rozmiarach, co wskazuje na chwiejny, ataksyjny chód.
Surowe dane dotyczące pozycji pazurów ciała i nóg mogą być dalej analizowane pod kątem określonych ruchów będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład zastosowanie FLLIT pozwoliło naszej grupie ustalić, że sztywne fenotypy wykazywane przez modele choroby Parkinsona Drosophila są spowodowane dysfunkcją neuronów dopaminergicznych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły dla FLLIT, zautomatyzowanej metody uczenia maszynowego służącej do śledzenia ruchów odnóży u Drosophila melanogaster oraz innych owadów. Metoda ta pozwala na ilościowy pomiar subtelnych zmian w chodu w różnych modelach much, w tym w modelach z neurodegeneracją.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Uczenie maszynowe
Wstęp
- FLLIT to w pełni zautomatyzowany algorytm do śledzenia ruchów zwierząt.
- Nie wymaga on zestawów danych z adnotacjami użytkownika do celów szkolenia.
- Metoda ta zapewnia szczegółowe pomiary chodu oraz wizualizacje.
- Znajduje ona zastosowanie zarówno w przypadku much typu dzikiego, jak i mutantów.
Cel badania
- Ilościowa analiza chodu u Drosophila.
- Badanie nieprawidłowości chodu w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Dostarczenie zstandaryzowanego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zestawu rejestracyjnego z kamerami wysokiej prędkości.
- Wykorzystanie diod LED emitujących podczerwień w celu uzyskania optymalnej widoczności.
- Zautomatyzowana analiza wideo do śledzenia kończyn i pomiaru chodu.
- Przetwarzanie danych w celu wygenerowania parametrów chodu i wizualizacji.
Główne wyniki
- FLLIT generuje surowe dane dotyczące pozycji ciała i nóg.
- Zidentyfikowano nieprawidłowości w chodu u much z mutacją SCA3.
- Wykazano różnice w wzorcach chodu pomiędzy modelami much.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy leżące u podstaw neurodegeneracji.
Wnioski
- FLLIT jest potężnym narzędziem do analizy lokomocji owadów.
- Może ono pomóc w wyjaśnieniu wpływu mutacji genetycznych na chód.
- Metoda ta poszerza naszą wiedzę na temat chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana kwantyfikacja lokomocji owadów umożliwia wysokoprzepustowy screening fenotypowy dla modeli chorób neurodegeneracyjnych. System FLLIT dostarcza obiektywnych pomiarów chodu, które wspierają walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Jego w pełni zautomatyzowany przepływ pracy redukuje błąd poznawczy użytkownika i zwiększa powtarzalność wyników dla zespołów interdyscyplinarnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie nieprawidłowości w ruchach kończyn dolnych w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki obiektywnemu, wysokorozdzielczemu fenotypowaniu chodu.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe wyniki, które pomagają w selekcji portfela projektów i identyfikacji wiodących kandydatów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Tworzy zestandaryzowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania związków.
- Powtarzalność: Zapewnia spójne ilościowe parametry chodu w powtórzeniach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w kampaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje ludzkie fenotypy chodu ataksycznego u much z mutacją SCA3.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia badawcze z walidacją przedkliniczną poprzez mierzalne punkty końcowe chodu.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji na temat kryteriów postępu w oparciu o potencjał normalizacji chodu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
FLLIT wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, dostarczając mierzalnych fenotypów lokomocyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez zautomatyzowane śledzenie kończyn.
- Przesiewy: Umożliwia standaryzację testów i uzyskanie powtarzalnych wyników ilościowych do oceny związków.
- Analityka: Dostarcza 20 parametrów chodu oraz wizualizacji ułatwiających porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez analizę istotnych dla choroby zaburzeń chodu w modelach neurodegeneracji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku zasób w wielu modelach chorób opartych na owadach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w fenotypach lokomotorycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki w pełni zautomatyzowanemu przetwarzaniu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie obiektywnych metryk chodu do walidacji modeli.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o normalizację chodu w modelach chorób.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie przepływów pracy uczenia maszynowego oraz analizy wideo.
- Wymaga infrastruktury kamer wysokiej prędkości i kontrolowanego oświetlenia.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie interpretacji danych i ustalania progów.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych gatunków owadów i wzorców chodu.
- Zależy od wystarczającej długości kroku i linii prostej trajektorii w celu zapewnienia dokładnego śledzenia.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
System Setup
1:05
Fly Preparation
1:47
Video Generation for Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT) Analysis
2:52
FLLIT Installation
3:50
Automated Leg Tracking
5:13
Data Processing and Video Generation
7:31
Conclusion
5:54
Representative Results: Automated Leg Movement Tracking in Freely-Moving Insects
