Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek
21 maja 2020
Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.
ICO, czyli ICO-seq to pierwsza adaptacja wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA do drobnoustrojów. W ramach tej metody oceniono funkcję drobnoustrojów w skali całego genomu. W przypadku mikroorganizmów zmodyfikowanych metoda ta może wyjaśnić, w jaki sposób zmiany w genomie drobnoustrojów mogą zaburzać jego funkcje.
Uzyskać drożdże z kultury zawiesinowej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu około 750 000 komórek na mililitr. Następnie wymieszaj agarozę o bardzo niskiej temperaturze topnienia z PBS i podgrzej mieszaninę w temperaturze 90 stopni Celsjusza, aż agaroza się rozpuści.
Załaduj mieszaninę agarozy do strzykawki z dołączonym filtrem 0,22 mikrona. Umieść pompę strzykawkową przed grzejnikiem ustawionym na 80 stopni Celsjusza i umieść strzykawkę w pompie. Napełnić drugą strzykawkę zawiesiną drożdży, a trzecią strzykawkę napełnić olejem fluorowanym z 2% jonowym środkiem fluoropowierzchniowo czynnym.
Załadować obie strzykawki do pomp strzykawkowych. Podłącz rurkę ze strzykawek do urządzenia A. Umieść 15-mililitrową stożkową rurkę w pojemniku na lód i wprowadź rurkę wylotową do stożkowej rurki. Ustaw natężenie przepływu dla każdej strzykawki i zbierz około jednego mililitra emulsji w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.
Po odczekaniu pięciu minut, aż agaroza w probówce stężeje, dodaj do emulsji równą objętość 20% perfluorooktanolu w oleju fluorowanym. Wymieszaj emulsję i perfluorooktanol, kilkakrotnie odwracając stożkową rurkę. Odwirować rozdrobnioną emulsję w temperaturze 2 000 razy G przez dwie minuty.
Upewnij się, że hydrożele są granulowane nad fazami oleju i PFO. Usuń fazy oleju i PFO. Dodać dwa mililitry buforu tet(W), aby ponownie zawiesić hydrożele.
Przenieś zawiesinę do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Ponownie odwirować probówkę w temperaturze 2 000 razy G przez dwie minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić hydrożele w tet(W).
Po odwirowaniu hydrożeli z prędkością 2 000 razy G przez dwie minuty, ponownie zawiesić hydrożele w dwóch mililitrach pożywki do hodowli drożdży. Inkubować probówkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając. Każda odmiana rośnie w innym tempie.
Wybór odpowiedniej pożywki i czasu inkubacji jest niezbędny, aby drożdże rosły w hydrożelu, ale nie przerosły, co prowadzi do ucieczki komórek do pożywki. Najpierw przenieś hydrożele do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Odwirować probówkę z prędkością 2 000 razy G przez dwie minuty.
Przemyć hydrożele dwukrotnie PBS, a następnie raz w buforze sferoplastycznym. Wykonać 40-krotne rozcieńczenie enzymu sferoplastycznego w buforze sferoplastycznym. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczonego enzymu do hydrożeli.
Inkubować probówkę z hydrożelami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Poddane obróbce drożdże będą wyglądać na bardziej przezroczyste. Z probówki zawierającej zawiesinę hydrożelową pobrać 0,8 mililitra zawiesiny z dna probówki i przenieść ją do jednomililitrowej strzykawki bez korka
.Umieść strzykawkę w uchwycie strzykawki wydrukowanym w 3D. Odwirować strzykawkę i uchwyt w temperaturze 2 000 razy G przez dwie minuty. Przed kontynuowaniem upewnij się, że hydrożele są szczelnie zapakowane na dnie strzykawki.
Umieść 240 000 kulek kroplowych w 15-mililitrowej stożkowej tubie. Odwirować probówkę o sile 1 000 razy G przez jedną minutę. Usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w dwóch mililitrach 0,9x buforu do lizy drożdży z 500 milimolowym chlorkiem sodu.
Włóż mieszadło i przenieś zawiesinę kulek do trzymililitrowej strzykawki. Przygotuj kolejną strzykawkę, zawierającą kilka mililitrów środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG w oleju fluorowanym. Zaopatrzyć się w wcześniej przygotowaną strzykawkę z hydrożelami zapakowanymi w klony drożdży.
Opróżnić głowicę przyzwolenia i zakręcić strzykawkę. Włożyć trzy strzykawki, hydrożele, zawiesinę kulek i olej do pompek strzykawkowych. Podłączyć strzykawki za pomocą rurki do urządzenia B, urządzenia do kapsułkowania.
Umieść koniec rurki wylotowej w 50-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie. Ustawić natężenie przepływu dla każdej strzykawki. Zbierz około 1 000 mililitrów emulsji lub uruchom urządzenie, aż nie pozostaną żadne hydrożele.
Następnie postępuj zgodnie z protokołem drop-seq do syntezy cDNA, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Za pomocą urządzenia mikroprzepływowego komórki drożdży zamknięto w kropelkach o wielkości 160 mikrometrów. Ośmiokrotny rozdzielacz podzielił te kropelki na osiem kropel o średnicy 60 mikrometrów.
Nocna inkubacja doprowadziła do powstania izogenicznych kolonii drożdży w niektórych hydrożelach. Przed załadowaniem hydrożeli drożdżowych do drugiego urządzenia mikroprzepływowego, zostały one umyte i zanurzone w roztworze w celu strawienia ścian komórkowych. Prawidłowe trawienie zweryfikowano za pomocą mikroskopii, przy czym leczone komórki drożdży miały bardziej refleksyjną morfologię.
Strumień kulek wychwytujących mRNA w buforze do lizy zmieszano ze strumieniem ciasno upakowanych hydrożeli drożdżowych przed złączem kroplowym drugiego urządzenia mikroprzepływowego. W otrzymanej emulsji około 10% zebranych kropelek zawierało jedną kulkę z lizowaną kolonią. Ten proces sekwencjonowania izogenicznych kolonii został wykorzystany do analizy białej, nieprzezroczystej odpowiedzi przełączania C. albicans.
Główny składnik, PC, analiza i redukcja wymiarowości tSNE wykazały ogólną zgodność między próbkowanym zbiorem danych a referencyjnym zbiorem danych. Analiza TSNE ujawniła trzy klastry komórek. Podczas gdy klaster drugi składał się głównie z komórek z zestawu danych próby, klastry zero i jeden składały się z komórek z obu próbek.
Nakładanie ekspresji WH11 na tSNE wskazywało, że grupa pierwsza prawdopodobnie zawierała białe kolonie. Ekspresja STF2 wzrosła w klastrze pierwszym, co jest zgodne z wcześniej uzyskanymi danymi. W klastrach zero i 2 WH11 i STF2 były znacznie obniżone w porównaniu z klastrem pierwszym.
Drobnoustroje androgenowe mają coraz większy potencjał do masowej produkcji leków biologicznych do leczenia wielu różnych chorób. Po tej procedurze można zastosować różne narzędzia bioinformatyczne do dalszej analizy danych sekwencjonowania.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wysokoprzepustową metodę przesiewania szczepów w inżynierii mikrobowej, wykorzystującą w szczególności sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach do analizy komórek drożdży. Metoda ta umożliwia funkcjonalną ocenę zmodyfikowanych mikroorganizmów w skali całego genomu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria mikrobowa
- Przesiewy wysokoprzepustowe
- Sekwencjonowanie RNA
Wprowadzenie
- Przesiewanie funkcjonalne szczepów mikrobiologicznych jest często powolne i nieefektywne.
- Metody wysokoprzepustowe mogą znacząco zwiększyć szybkość tych ocen.
- Sekwencjonowanie RNA w kropelkach oferuje nowatorskie podejście do oceny funkcji mikrobiologicznych.
- Zrozumienie perturbacji genomu może pomóc w opracowaniu strategii inżynierii mikrobiologicznej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej metody przesiewowej szczepów drożdży z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA.
- Wyjaśnienie funkcjonalnych skutków zmian genomicznych w zmodyfikowanych mikrobach.
- Zwiększenie efektywności cyklu projektowanie-budowa-testowanie (design-build-test) w inżynierii mikrobiologicznej.
Zastosowane metody
- Komórki drożdży zostały wyhodowane i przygotowane w określonym stężeniu.
- W celu enkapsulacji komórek drożdży zastosowano mikroprzepływy oparte na kropelkach.
- W celu oceny ekspresji genów przeprowadzono sekwencjonowanie RNA enkapsulowanych komórek.
- Do analizy danych z sekwencjonowania wykorzystano narzędzia bioinformatyczne.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwoliła na pomyślną enkapsulację komórek drożdży w kropelkach w celu przeprowadzenia analiz wysokoprzepustowych.
- Wygenerowano kolonie izogeniczne, a następnie przeanalizowano wzorce ekspresji genów.
- Analiza głównych składowych wykazała wyraźne skupienia ekspresji genów.
- Wyniki wskazały na istotne różnice w ekspresji genów powiązane z morfologią kolonii.
Wnioski
- Ta wysokoprzepustowa metoda zwiększa możliwości efektywnego przesiewania szczepów mikrobialnych.
- Uzyskane informacje mogą posłużyć do przyszłej inżynierii drobnoustrojów w zastosowaniach biotechnologicznych.
- Opisane podejście jest możliwe do zastosowania w przypadku różnych gatunków drobnoustrojów poza drożdżami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przesiewy szczepów wysokoprzepustowe pozostają wąskim gardłem w inżynierii mikrobiologicznej, pomimo postępów w edycji genomu. Ta metoda sekwencjonowania RNA w kropelkach umożliwia funkcjonalną ocenę całego genomu zmodyfikowanych szczepów drożdży, bezpośrednio rozwiązując problem kompromisu między ilością generowanych informacji a przepustowością. Dzięki zapewnieniu wnioskowania fenotypowego na podstawie profili transkrypcyjnych, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w wyborze szczepów i przyspiesza cykl projektowania, budowy i testowania (design-build-test) w produkcji leków biologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie modyfikacji genomowych z fenotypami funkcjonalnymi za pomocą odczytów całego transkryptomu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe profilowanie ekspresji genów, które wyjaśnia wpływ edycji genetycznych na poziomie szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfelu poprzez identyfikację szczepów o pożądanych sygnaturach ekspresji związanych z docelowymi szlakami, co zmniejsza zależność od analiz o niskiej przepustowości.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane, zamknięte w kropelkach izogeniczne kolonie drożdży, odpowiednie do powtarzalnego screeningu fenotypowego opartego na RNA-seq.
- Skalowalność: Przetwarza tysiące genetycznie odrębnych szczepów równolegle, pokonując ograniczenia tradycyjnego wycinania kolonii oraz metod opartych na macierzach.
- Jakość danych: Dostarcza ilościowe, multipleksowe pomiary ekspresji genów, umożliwiające solidne porównania między bibliotekami szczepów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: zastosowanie w badaniu przełączania białego-nieprzezroczystego (white-opaque switching) u Candida albicans, który jest fenotypem związanym z wirulencją, co wykazuje użyteczność metody w charakteryzacji szczepów patogennych.
- Ciągłość translacyjna: łączy modyfikacje genetyczne z efektami fenotypowymi poprzez biomarkery ekspresji (np. WH11, STF2), co wspiera dobór szczepów w oparciu o biomarkery.
- Przedkliniczna redukcja ryzyka: umożliwia wczesną identyfikację szczepów niefunkcjonalnych lub aberrantnych, zmniejszając ryzyko niepowodzenia na późniejszych etapach rozwoju.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z przepływami pracy w inżynierii szczepów mikrobiologicznych – od konstruowania bibliotek po walidację funkcjonalną – umożliwiając priorytetyzację szczepów na podstawie transkryptomu przed identyfikacją wiodących kandydatów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, ujawniając, w jaki sposób zaburzenia genomiczne wpływają na globalną ekspresję genów w tłach izogenicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, zestandaryzowanych układów mikrobiologicznych z powtarzalnymi wynikami transkrypcyjnymi do testowania odpowiedzi na związki lub określone warunki.
- Analityka: Zapewnia klastry ekspresji wyprowadzone z PCA i tSNE oraz nakładki genów markerowych, które umożliwiają klasyfikację fenotypową i porównywanie szczepów.
- Badania translacyjne: Łączy genotypy szczepów ze stanami fenotypowymi za pomocą zachowanych markerów, wspierając ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania bibliotek szczepów drożdży i innych mikroorganizmów w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie zależności między szczepem a funkcją poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki danym o ekspresji w skali całego genomu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki enkapsulacji mikrofluidycznej i kontrolowanemu wzrostowi kolonii w hydrożelu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez umożliwienie szybkiej, wieloparametrowej oceny szczepów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postęp dostosowany do ryzyka poprzez wczesną identyfikację szczepów o profilach molekularnych wskazujących na pożądane fenotypy na etapie rozwoju.
Kwestie związane z implementacją
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrofluidyki, genetyki drożdży oraz przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
- Zależy od dostępu do urządzeń do generowania kropli, olejów fluorowanych, surfaktantów oraz infrastruktury do sekwencjonowania i bioinformatyki.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowywania hydrożeli, sferoplastowania i sprzęgania kulek pomiędzy zespołami w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wiąże się z optymalizacją czasu inkubacji i składu pożywki w celu zapobiegania nadmiernemu rozrostowi hydrożelu i ucieczce komórek, co jest zależne od szczepu.
- Ograniczone koniecznością posiadania biomarkerów transkrypcyjnych o znanych powiązaniach fenotypowych, aby umożliwić dokładną inferencję fenotypową z danych RNA-seq.
