Name: Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę Acyl-RAC do wykrywania S-acylacji białek w różnych próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę wielu białek i regulacji procesów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health 5R01GM115446 i 1R01GM130840.

Myszy użyte w tym protokole zostały poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi NIH. Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston zatwierdził wszystkie prace związane ze zwierzętami.
1. Przygotowanie lizatów komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy zgodnie z opisem w Tabeli 1. Do 10 ml PBS dodać 0,1 g detergentu n-dodecyl β-D-maltozydu (DDM) i obrócić do rozpuszczenia. Dodać 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) i koktajlu inhibitorów proteazy (1x) i schłodzić bufor na lodzie przed użyciem.</li>
	<li>Przenieść wymagane podłoże zawierające komórki z inkubatora do stożkowych probówek o pojemności 15 ml lub 50 ml i wirować komórki przy 350 x g przez 5 minut i aspirować, aby pozbyć się wszelkich resztek komórek. 
	UWAGA: Użyliśmy 1 x 107 komórek do każdej reakcji acyl-RAC, która miała zostać przeprowadzona.</li>
	<li>Umyj granulkę, ponownie zawieszając ją w 5 ml PBS i wirując w temperaturze 350 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Wykonaj szybko krok 1.3, aby uniknąć lizy komórek z powodu przedłużonej inkubacji w PBS.</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu do lizy przygotowanego w kroku 1.1 do osadu i poddać go lizie przez wytrząsanie z prędkością 1500 obr./min w wytrząsarce termicznej przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Klarowne lizaty przez odwirowanie w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu granulowania materiałów nierozpuszczalnych w detergentach. Zbierz oczyszczony lizat we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i trzymaj je na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj test Bradforda/BCA, aby oszacować stężenie białka. Bardzo ważne jest, aby przed przeprowadzeniem eksperymentu zapewnić taką samą ilość białka w różnych próbkach. Zalecamy stosowanie co najmniej 500 μg białka na reakcję. 
	UWAGA: W opisanych eksperymentach wykorzystaliśmy hodowane komórki (Jurkat) i pierwotne splenocyty z tkanek myszy. Opisana powyżej metoda lizy może być również zastosowana do innych typów komórek. Średnie stężenie białka uzyskane dla wyżej wymienionych typów komórek wynosi około 500 μg na 1 x 107 komórek. Komórki Jurkata utrzymywano w pożywce RPMI-1640 zmodyfikowanej tak, aby zawierała 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 4500 mg/L glukozy i 1500 mg/L wodorowęglanu sodu uzupełnionego 10% FBS w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Użyliśmy 1 x 107 komórek Jurkata na reakcję. Pierwotne splenocyty wyizolowano z tkanki śledziony myszy zgodnie z opisem26. Krótko mówiąc, tkankę śledziony macerowano na lodzie, a następnie lizowano erytrocyty w roztworze hipotonicznym i oddzielano od limfocytów przez wirowanie. Użyliśmy 1 x 107 komórek pierwotnych na reakcję.</li>
</ol>
2. Acyl-RAC: Blokowanie wolnych grup tiolowych
UWAGA: Wszystkie kolejne kroki można wykonać w temperaturze pokojowej (RT).
<ol>
	<li>Przenieś lizat do świeżej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i wykonaj wytrącanie chloroformu i metanolu (CM), jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Dodać metanol (MeOH) i chloroform (CHCl 3) do lizatu w końcowym stosunku lizatu: MeOH: CHCl3 w stosunku 2:2:1 i energicznie wstrząsnąć, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut, aby uformować granulkę ("naleśnik") na styku faz wodnych i organicznych.</li>
		<li>Przechylić probówkę i odessać jak najwięcej rozpuszczalnika za pomocą igły lub końcówki do ładowania żelem.</li>
		<li>Wysuszyć granulkę białka na powietrzu przez kilka minut i delikatnie ją umyć, dodając 600 μl MeOH i delikatnie mieszając, aby uniknąć rozdrobnienia granulki</li>
		<li>Ostrożnie usuń pozostały MeOH i wysusz granulki białka na blacie przez około 5 minut.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Wykonaj dodatkowy etap wirowania, aby odwirować wszelkie połamane osady po umyciu MeOH, aby uniknąć utraty próbki. 
		UWAGA: Eksperyment można przerwać po etapie wytrącania CM. Po uzyskaniu osadu można go przechowywać w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia.
		<ol>
			<li>Rozpuścić osad białkowy w 200 μl buforu 2SHB, wirując w temperaturze 42 °C/1500 obr./min w wytrząsarce termicznej, aż do rozpuszczenia osadu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>(Opcjonalnie) Inkubować przez dodatkowe 5–10 minut w sonikującej łaźni wodnej w celu rozpuszczenia osadu. 
		UWAGA: Długość sonikacji różni się w zależności od rozpuszczalności materiału. Jednak długotrwała sonikacja może powodować degradację białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 0,2% metanoetyosiulfonianu metylu (MMTS) (v/v) w 2SHB, dodając 2 μl MMTS do 998 μl buforu 2SHB. 
	UWAGA: Do każdego eksperymentu używaj świeżo przygotowanych 0,2% MMTS.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 0,2% MMTS w 2SHB do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% MMTS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 42 °C z wytrząsaniem przy 1500 obr./min w wytrząsarce termicznej.</li>
</ol>
3. Acyl-RAC: Rozszczepienie hydroksyloaminy (HAM) i wychwyt białek S-acylowanych
<ol>
	<li>Powtórz 3-4 opady CM, jak opisano powyżej, aby usunąć MMTS. Usunięcie MMTS można oszacować na podstawie braku wyraźnego zapachu MMTS. Po każdym wytrąceniu rozpuścić osad w 100 μl buforu 2SHB, wirując w temperaturze 42 °C/1500 obr./min w wytrząsarce termicznej, aż do rozpuszczenia osadu, a następnie rozcieńczyć 300 μl buforu A.</li>
	<li>Po końcowym wytrąceniu rozpuścić próbki w 200 μl buforu 2SHB, jak opisano powyżej, i rozcieńczyć 240 μl buforu A.</li>
	<li>W przypadku porównywania zmian w acylacji S w odpowiedzi na kilka warunków leczenia, należy ponownie zmierzyć stężenie białka i postępować z równą ilością białka dla każdego stanu.</li>
	<li>Zachować 40 μl z każdej próbki jako kontrolę wejściową.</li>
	<li>Podzielić próbki na dwie równe części po 200 μl i oznaczyć probówki jako "+ SZYNKA" i "- SZYNKA". Dodać 50 μl świeżo przygotowanej obojętnej 2 M HAM (pH 7,0-7,5) do końcowego stężenia 400 mM do jednej z probówek (+ szynka) i 50 μl obojętnego 2 M NaCl do drugiej probówki (- SZYNKA), która zostanie użyta jako kontrola ujemna. Przejdź do dodawania kulek tiopropylo-sefarozy (TS). 
	UWAGA: Eksperyment można przerwać po dowolnym etapie wytrącania CM. Po uzyskaniu osadu można go przechowywać w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia. Neutralne pH 2 M HAM zapewnia jego selektywność dla wiązania tioestrowego acylo-cysteiny i powinno być starannie dostosowane. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami w buforze 2SHB, aby uniknąć utraty próbki z powodu nadmiernego pienienia. Wszystkie poniższe kroki są identyczne dla próbek - HAM i + HAM.</li>
	<li>Dodać 30 μl zawiesiny perełkowej TS do każdej probówki i obracać probówki przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj koraliki TS 4x z 1% SDS w buforze A, aby usunąć resztki szynki.
	<ol>
		<li>Delikatnie odwirować wszystkie próbki kulek za pomocą mikrofugi przez 1 minutę i ostrożnie odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 500 μl 1% SDS w buforze A.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.7.1–3.7.2 trzy razy. 
		UWAGA: Aktywowana tiopropylo-sefaroza (TS) jest dostarczana w postaci liofilizowanej w obecności dodatków, które przed sprzęgnięciem należy zmyć przy neutralnym pH. Do pęcznienia i mycia zalecana jest woda destylowana. Odważyć 0,1 g kulek i ponownie zawiesić w 1 ml wody destylowanej i pozostawić do spęcznienia podczas obracania przez 30 min-1 godzinę w temperaturze suchej masy. Przemyć kulki 1x buforem A i przygotować zawiesinę z buforem A, w proporcji 50% osiadłego podłoża do 50% buforu. Spuchnięty TS może być przechowywany w neutralnym pH w obecności 20% etanolu w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Nie należy stosować azydku sodu jako środka bakteriostatycznego, ponieważ jony azydku reagują z grupami dwusiarczkowymi 2-pirydylu. Aby uzyskać wyższą wydajność, przygotuj świeże koraliki. Podczas obchodzenia się ze kulkami końcówkę końcówki do pipet P200 można lekko przeciąć, aby zapobiec uszkodzeniom. 
		UWAGA: Eksperyment można przerwać na dowolnym etapie po wytrąceniu CM. Granulat może być przechowywany w 500 μl MeOH w temperaturze -20 °C do tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Elucja i wykrywanie białek S-acylowanych
<ol>
	<li>Po ostatnim praniu delikatnie odkręć kulki zgodnie z powyższym opisem i odessaj jak najwięcej supernatantu, nie naruszając kulek.</li>
	<li>Odzyskaj białka z kulek za pomocą 4x buforu próbki SDS z naziemną telewizją cyfrową.
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl 4x buforu do próbki SDS do kulek i inkubować w temperaturze 80 °C, 1500 obr./min przez 15 minut w wytrząsarce termicznej. Niech rurki ostygną.</li>
		<li>Odwirować kulki o masie 5 000 x g przez 3 minuty, aby całkowicie zagnieździć kulki i przenieść wymyte białka do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki do ładowania żelem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom SDS-PAGE i przeanalizuj S-acylację interesujących białek za pomocą western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym przypadku z powodzeniem wykorzystaliśmy test acyl-RAC do wykrywania S-acylacji wybranych białek zarówno w hodowanych komórkach ludzkich, jak i komórkach pierwotnych pochodzących z tkanki myszy. Ta metoda jest prosta, czuła i może być łatwo wykonana przy minimalnych wymaganiach sprzętowych przy użyciu standardowych technik biochemicznych. Wykazano, że metoda ta z powodzeniem identyfikuje nowe białka S-acylowane, takie jak β-podjednostka systemu translokacji białek (Sec61b), białko rybosomalne S11 (Rps11) i mikrosoma...

S-acylacja to odwracalna modyfikacja potranslacyjna, polegająca na dodaniu tłuszczowego łańcucha acylowego do wewnętrznej reszty cysteiny na docelowym białku za pomocą labilnego wiązania tioestrowego1. Po raz pierwszy doniesiono o tym, że jest to modyfikacja białek z palmitynianem, nasyconym 16-węglowym kwasem tłuszczowym2, i dlatego ta modyfikacja jest często określana jako S-palmitoilacja. Oprócz palmitynianu, białka mogą być odwracalnie modyfikowane przez różne dłuższe i krótsze nasycone (mirystynian i stearynian), jednonienasycone (oleinian) i wielonienasycone (arachidonian i eikozapentanian) kwasy tłuszczowe3,4,5,6,7. W komórkach eukariotycznych acylacja S jest katalizowana przez rodzinę enzymów znanych jako acylotransferazy białek DHHC, a odwrotna reakcja deacylacji cysteiny jest katalizowana przez tioesterazy białkowe, z których większość nadal pozostaje enigmatyczna8.
Labilność wiązania tioestrowego sprawia, że ta modyfikacja lipidów jest odwracalna, co pozwala na dynamiczną regulację grupowania białek, lokalizacji błony plazmatycznej, transportu wewnątrzkomórkowego, interakcji białko-białko i stabilności białka9,10. W związku z tym S-acylacja została powiązana z kilkoma zaburzeniami, w tym z chorobą Huntingtona, chorobą Alzheimera i kilkoma rodzajami raka (prostata, żołądek, pęcherz moczowy, płuca, jelito grube), co wymaga opracowania niezawodnych metod wykrywania tej potranslacyjnej modyfikacji białka11.
Metaboliczne znakowanie radioaktywnym ([3H], [14C] lub [125I]) palmitynianem było jednym z pierwszych podejść opracowanych do oznaczania białka S-acylation12,13,14. Jednak metody oparte na radioznakowaniu stwarzają problemy zdrowotne, nie są zbyt czułe, czasochłonne i wykrywają lipidację tylko bardzo obfitych białek15. Szybszą i nieradioaktywną alternatywą dla znakowania radioaktywnego jest znakowanie metaboliczne za pomocą bioortogonalnych sond kwasów tłuszczowych, które jest rutynowo stosowane do oznaczania dynamiki białka S-acylation16. W tej metodzie kwas tłuszczowy z reporterem chemicznym (grupa alkinowa lub azydkowa) jest włączany do białka S-acylowanego przez acylotransferazę białkową. Reakcja cykloaddycji azydowo-alkinowej Huisgen (chemia kliknięć) może być następnie wykorzystana do przyłączenia funkcjonalizowanej grupy, takiej jak fluorofor lub biotyna, do zintegrowanego kwasu tłuszczowego, co pozwala na wykrycie białka S-acylowanego 17,18,19.
Wymiana acylo-biotyny (ABE) jest jedną z szeroko stosowanych metod biochemicznych do wychwytywania i identyfikacji białek S-acylowanych, która omija niektóre niedociągnięcia etykietowania metabolicznego, takie jak nieprzydatność dla próbek tkanek15. Metoda ta może być stosowana do analizy acylacji S-acylacji w różnorodnym zakresie próbek biologicznych, w tym tkanek i próbek zamrożonych komórek20,21. Metoda ta opiera się na selektywnym rozszczepieniu wiązania tioestrowego między grupą acylową a resztą cysteiny przez obojętną hydroksyloaminę. Uwolnione grupy tiolowe są następnie wychwytywane za pomocą reaktywnej tiolowo-pochodnej biotyny. Wygenerowane biotynylowane białka są następnie oczyszczane pod względem powinowactwa za pomocą agarozy streptawidyny i analizowane za pomocą immunoblottingu.
Alternatywne podejście zwane wychwytywaniem wspomaganym żywicą acylową (Acyl-RAC) zostało później wprowadzone w celu zastąpienia etapu biotynylacji bezpośrednią koniugacją wolnych cystein przez żywicę reagującą z tiolem22,23. Ta metoda składa się z mniejszej liczby etapów w porównaniu do ABE i podobnie może być stosowana do wykrywania S-acylacji białek w szerokim zakresie próbek1.
Acyl-RAC składa się z 4 głównych etapów (Rysunek 1), 
1. Blokowanie wolnych grup tiolowych; 
2. Selektywne rozszczepienie wiązania cysteina-acyl tioester z obojętną hydroksyloaminą (HAM) w celu odsłonięcia grup tiolowych cysteiny; 
3. Wychwytywanie lipidowanych cystein za pomocą żywicy reagującej z tiolami; 
4. Selektywne wzbogacanie białek S-acylowanych po elucji buforem redukującym.
Uchwycone białka mogą być następnie analizowane za pomocą immunoblottingu lub poddawane proteomice opartej na spektrometrii mas (MS) w celu oceny proteomu S-acylowanego w różnych gatunkach i tkankach22,24,25. Poszczególne miejsca acylacji S można również zidentyfikować poprzez trawienie trypsyną wychwyconych białek i analizę powstałych peptydów za pomocą LC-MS/MS22. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób acyl-RAC może być używany do jednoczesnego wykrywania S-acylacji wielu białek zarówno w linii komórkowej, jak i w próbce tkanki.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksyloamina (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Metanetylosulfonian metylu (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotator rurkowy</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl &beta;-D-maltozyd (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropylo-sefaroza 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwięki Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie s-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

S-acylacja białek, zwana również S-palmitoilacją, jest odwracalną potranslacyjną modyfikacją reszt cysteiny z długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi za pomocą labilnego wiązania tioestrowego. S-acylacja, która staje się powszechnym mechanizmem regulacyjnym, może modulować prawie wszystkie aspekty aktywności biologicznej białek, od tworzenia kompleksów po transport białek i stabilność białek. Niedawny postęp w zrozumieniu biologicznej funkcji acylacji białka S został osiągnięty w dużej mierze dzięki opracowaniu nowych narzędzi biochemicznych umożliwiających solidne i czułe wykrywanie acylacji białka S w różnych próbkach biologicznych. W tym miejscu opisujemy wychwytywanie wspomagane żywicą acylową (Acyl-RAC), niedawno opracowaną metodę opartą na selektywnym wychwytywaniu endogennych białek S-acylowanych przez reaktywne tiolowo kulki sefarozy. W porównaniu z istniejącymi podejściami, Acyl-RAC wymaga mniejszej liczby kroków i może dać bardziej wiarygodne wyniki w połączeniu ze spektrometrią mas w celu identyfikacji nowych celów acylacji S. Głównym ograniczeniem w tej technice jest brak możliwości rozróżnienia między gatunkami kwasów tłuszczowych przyłączonymi do cystein za pomocą tego samego wiązania tioestrowego.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, w pierwszej kolejności zastosowano acyl-RAC do jednoczesnego wykrywania S-acylacji kilku białek w komórkach Jurkat, unieśmiertelnionej linii komórkowej limfocytów T, pierwotnie pochodzącej z krwi obwodowej pacjenta z białaczką limfocytów T27. W celu zademonstrowania użyteczności tej metody wybrano białka limfocytów T regulatorowych, które wcześniej zidentyfikowano jako S-acylowane9,28,<sup ...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Wychwytywanie wspomagane żywicą acylową lub Acyl-RAC to czuła i niezawodna metoda, którą można wykorzystać do wykrywania S-acylacji białek w różnych próbkach biologicznych. Protokół ten omija niektóre ograniczenia znakowania metabolicznego i znakowania radiowego oraz umożliwia jednoczesne wykrywanie S-acylacji wielu białek. Nie tylko żywe komórki, ale także tkanki pierwotne i zamrożone próbki.S-acylacja może regulować różne procesy komórkowe, takie jak transport białek, celowanie w błonę plazmatyczną, transdukcja sygnału, transport żelaza i interakcje białko-białko. Ważne jest, aby do każdego eksperymentu używać świeżo przygotowanego roztworu hydroksyloaminy o starannie dostosowanym pH, aby zapewnić skuteczne i specyficzne rozszczepienie wiązania tioestrowego. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla etapów takich jak chloroform, wytrącanie metanolu.Z granulatem w kształcie naleśnika uzyskanym na tym etapie należy obchodzić się bardzo ostrożnie. Może być kruchy, a częściowa utrata próbki na tym etapie może prowadzić do nierównomiernego odzyskiwania próbki. Procedurę zademonstruje Savannah West, doktorantka z naszego laboratorium.Aby uzyskać lizaty komórkowe, zbierz interesujące komórki do stożkowej probówki wirówkowej. I usuń wszelkie resztki komórek przez odwirowanie. Umyj granulat w 5 mililitrach PBS.I natychmiast ponownie zawiesić komórki w 600 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu do lizy. Mieszać próbkę z prędkością 1 500 obrotów na minutę w wytrząsarce termicznej przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed oczyszczeniem lizatów, detergent w granulkach i materiał rozpuszczalny przez odwirowanie.Pod koniec wirowania zbierz oczyszczony lizat we wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej na lodzie. I wykonaj test kwasu Bradforda lub kwasu bicynkowego, aby oszacować stężenie białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Dodaj metanol i chloroform do lizatu w stosunku 2:1.Wstrząsnąć rygorystycznie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę i odwirować próbkę, aby zebrać osad białka na granicy faz wodnych i organicznych. Przechylając probówkę, użyj igły lub końcówki do ładowania żelem, aby zassać jak najwięcej rozpuszczalnika. Suszyć granulki białkowe na powietrzu przez kilka minut.Przed delikatnym wymieszaniem zawartości tubki z 600 mikrolitrami metanolu, uważając, aby nie rozbić granulki. Po ostrożnym usunięciu płukania metanolem wysusz granulki białka na blacie stołu przez około pięć minut. Następnie ponownie zawieś osad białka w 200 mikrolitrach buforu 2SHB.I wir w temperaturze 42 stopni Celsjusza i 1,500 obrotów na minutę w wytrząsarce termicznej. Gdy osad się rozpuści, dodaj do próbki 200 mikrolitrów 0,2% MMTS w 2SHB. I inkubować białko przez 15 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza i 1,500 obrotów na minutę w wytrząsarce termicznej.Pod koniec inkubacji przeprowadzić wytrącanie chloroformu i metanolu w stosunku 3:4, jak pokazano. Aby usunąć MMTS, rozpuść osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu 2SHB z wirowaniem. I rozcieńczyć próbkę 300 mikrolitrami buforu A po każdym wytrąceniu.Po końcowym wytrąceniu rozpuść próbki w 200 mikrolitrach buforu 2SHB i rozcieńcz 240 mikrolitrami buforu A. Ponownie zmierz stężenie białka i odłóż 40 mikrolitrów z każdej próbki jako kontrole wejściowe. Podziel próbki na dwie równe objętości po 200 mikrolitrów. I oznacz probówki jako plus hydroksyloamina i minus hydroksyloamina.Dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej obojętnej dwumolowej hydroksyloaminy do końcowego stężenia 400 milimolów do probówki z hydroksylaminą. I 50 mikrolitrów obojętnego dwumolowego chlorku sodu do kontroli ujemnej, probówki z minusem hydroksyloaminy. Następnie dodaj 30 mikrolitrów zawiesiny kulek TS do każdej tuby.I obracaj rurki przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć kulki czterokrotnie 1% SDS w buforze A w celu usunięcia pozostałości hydroksyloaminy. Po ostatnim myciu umyj wszystkie próbki kulek trzema delikatnymi, jednominutowymi mikrowirowaniami.Ostrożnie zasysając supernatanty i ponownie zawieszając kulki w 500 mikrolitrach 1% SDS w buforze A przy każdym myciu. Po ostatnim praniu delikatnie odkręć koraliki, jak pokazano. I odessać jak najwięcej supernatantu, nie naruszając koralików.Aby odzyskać białka z kulek, dodaj 50 mikrolitrów 4% buforu próbki SDS do każdej probówki i inkubuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza i 1500 obrotów na minutę przez 15 minut w wytrząsarce termicznej. Pod koniec inkubacji pozwól próbkom ostygnąć przed odwirowaniem, aby całkowicie otulić kulki. Następnie użyj końcówki ładującej żel, aby przenieść wymyte białka do nowych 1,5-mililitrowych probówek.I uruchom próbki na żelu SDS-PAGE, aby przeanalizować S-acylację interesujących białek za pomocą Western blot. Kinazę tyrozynową Lck można wykryć w lizatach traktowanych obojętną dwumolową hydroksyloaminą. w celu rozszczepienia wiązania tioestrowego między resztami cysteiny a ugrupowaniem kwasu tłuszczowego.Stripping i ponowne sondowanie przeciwciałami przeciwko białkom Fyn i LAT pokazuje, że test wychwytywania wspomagany żywicą acyylową może być stosowany do analizy S-acylacji wielu białek w tym samym czasie. Ponadto S-acylacja Lck, Fyn i LAT może być łatwo wykryta w pierwotnych splenocytach myszy. Wskazując, że ta modyfikacja jest zachowana między dwoma gatunkami.Oprócz identyfikacji nowych białek S-acylowanych, metoda ta może być również stosowana do oceny zmian w acylacji białek S w różnych warunkach biologicznych. Liczba nowo zidentyfikowanych białek S-acylowanych ogromnie wzrosła po tym, jak podwojenie oznaczało szybką i niezawodną technikę, taką jak Acyl-RAC. Oprócz identyfikacji nowych białek S-acylowanych, metoda ta może być również stosowana do oceny zmian w acylacji białek S w różnych warunkach biologicznych.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Ten protokół opisuje wymagane kroki do przeprowadzenia testów deacetylacji in vitro i in vivo w celu ustalenia roli białek jako specyficznych substratów deacetylacji dla sirtuin i dalszego badania roli odwracalnej acetylacji lizyny jako modyfikacji potranslacyjnej.

Testy deacetylacji w celu rozwikłania wzajemnych zależności między sirtuinami (SIRT2) a specyficznymi substratami białkowymi

Opisujemy metodę generowania indukowalnych stabilnych linii komórkowych oznaczonych znacznikami lokalizacji i powinowactwa (LAP) do badania funkcji białek, czasoprzestrzennej lokalizacji subkomórkowej i sieci interakcji białko-białko.

Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Poznaj metodę Acyl-RAC do wykrywania S-acylacji białek w różnych próbkach biologicznych. Technika ta umożliwia jednoczesną analizę wielu białek i regulacji procesów komórkowych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Przeglądaj więcej filmów