Name: Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę APEGS do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej w lizatach mózgu myszy. Ta technika nie wymaga oczyszczania afinicznego i wykorzystuje zmiany ruchliwości w żelu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują K. Woolfreyowi za rady i wkład w test APEGS. Badania te zostały sfinansowane z grantów badawczych dla E.D. z Whitehall Foundation i NIH-NIMH (1R01MH119347).

Wszystkie procedury dla zwierząt były zgodne z wytycznymi określonymi przez National Institutes of Health (NIH) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.
1. Przygotowanie błon mózgowych myszy
<ol>
	<li>Odciąć głowę myszy za pomocą aparatu gilotynowego i szybko wyciąć mózg (w <1 min, jeśli to możliwe, aby zminimalizować zmiany w palmitoilacji, które mogą wystąpić podczas procedury sekcji). Natychmiast homogenizować w 10 ml buforu homogenizacyjnego (Tabela 1) w szklanym homogenizatorze (~12 cykli) na lodzie.</li>
	<li>Odwirowywać lizaty przez 15 minut w temperaturze 1 400 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Zawiesić osad (~6 uderzeń) w równej objętości buforu homogenizacyjnego i odwirować przy 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Połączyć supernatanty z kroku 1.2 i odwirować przy 40 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant (frakcję cytozolową) i ponownie zawiesić granulowaną frakcję membranową (P2) w buforze homogenizacyjnym. 
	UWAGA: Próbki można błyskawicznie zamrażać i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić ilościowo poziom białka. W przypadku testu APEGS należy rozpocząć od ~100-200 mg białka (maksymalnie 250 mg) w objętości 470 μl buforu A (Tabela 1) w probówce o pojemności 1,5 ml. Sonikować i odwirowywać w temperaturze 13 000 x g > przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego białka. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
2. Test przesunięcia żelu z wymiennikiem acylo-pegylowym (APEGS)
<ol>
	<li>Rozbijaj wiązania dwusiarczkowe i blokuj wolne cysteiny.
	<ol>
		<li>Rozbijać wiązania dwusiarczkowe przez inkubację w 25 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP; 25 μl, dodanej z roztworu podstawowego; Tabela 1) przez 60 min w temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Blokować cysteiny wolne od 50 mM N-etylomaleimidem (NEM; 12,5 μl, dodanym z roztworu podstawowego; Tabela 1) w temperaturze pokojowej przez 3 h. 
		UWAGA: Reakcja może zostać przedłużona z dnia na dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić wytrącanie chloroformu metanolu (CM).
	<ol>
		<li>Przenieś roztwór białkowy z probówki o pojemności 1,5 ml do probówki z polipropylenu lub szkła, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym z niewielką prędkością. Idealna jest tubka o pojemności 5 ml. Dodać cztery objętości (2 ml) metanolu (MeOH) i krótko odmieszać.</li>
		<li>Dodać dwie objętości (1 ml) chloroformu i krótko przemieszać.</li>
		<li>Dodać trzy objętości (1,5 ml) dH2O i krótko odwirować.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę.</li>
		<li>Dodaj 3 objętości (1,5 ml) MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego.</li>
		<li>Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy, nie naruszając naleśnika białkowego.</li>
		<li>Ostrożnie spłucz osad 1 ml MeOH.</li>
		<li>Suszyć pelety na powietrzu przez co najmniej 10 minut. 
		UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać rozszczepienie wiązań palmitoilowo-tioestrowych za pomocą hydroksyloaminy (NH2OH, HAM).
	<ol>
		<li>Zawiesić osad białkowy w 125 μl buforu A i krótko wykonać sonikę. Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 375 μl buforu H (HAM+; Tabela 1) lub bufor T (HAM-; Tabela 1) i inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć opady CM opisane w kroku 2.2. 
	UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Dodaj mPEG do niezabezpieczonych cystein.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad w 100 μl buforu A zawierającego 10 mM TCEP. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: To normalne, że znaczna utrata białka nastąpiła podczas etapów wytrącania CM. Wszystkie kolejne kroki będą wykonywane w probówce o pojemności 1,5 ml, ograniczając objętość białka do maksymalnie ~120−130 μL. Zmniejszy to utratę białka podczas końcowego wytrącania CM.</li>
		<li>Dodać 20 mM mPEG-5k (25 μl, dodać z roztworu podstawowego; Tabela 1) do próbki białka i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 25 °C z obrotem od końca do końca.</li>
		<li>Aby usunąć nieinkorporowany mPEG-5k, należy przeprowadzić wytrącanie CM zgodnie z opisem w kroku 2.2, używając następujących dostosowanych objętości: 4 objętości MeOH (500 μL), 2 objętości chloroformu (250 μL) i 3 objętości dH2O (375 μL). Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego, kłaczkowatego naleśnika. Dodaj 1 ml MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml MeOH. Wirować w temperaturze 13 000 x g > przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Suche na powietrzu granulki. 
		UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Zawiesić wysuszony osad w 50 μl buforu A (bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego). Zarezerwuj 5 μl na ilościowe oznaczanie białka BCA. Po oznaczeniu ilościowym dodać odpowiednią ilość 4x buforu próbki Laemmli i, w zależności od interesującego białka, potencjalnie podgrzać próbkę do temperatury 70-100 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Gotowanie może spowodować agregację niektórych białek błonowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza Western blot białek pegylowanych
<ol>
	<li>Załaduj próbkę do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) gel13. 
	UWAGA: W tym protokole zastosowano 10% poliakrylamidu.</li>
	<li>Używaj standardowych protokołów separacji, transferu i wykrywania dla Western blotting14.</li>
	<li>Użyj densytometry14, aby określić względne ilości białek pegylowanych i niepegylowanych.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszej poprzedniej pracy wykorzystaliśmy test ABE, aby wykazać, że SynDIG1 jest palmitoilowany w dwóch konserwatywnych transbłonowych resztach Cys (znajdujących się we wszystkich białkach SynDIG) w sposób zależny od aktywności w celu regulacji stabilności, lokalizacji i funkcji6. Ograniczeniem jest to, że test ABE wymaga oczyszczenia z powinowactwa żywicami agarozowymi sprzężonymi z ugrupowaniami awidyny jako ostatniego etapu procedury, co powoduje znaczną utratę sygnału, co komplikuje analizę i...

S-palmitoilacja to odwracalna potranslacyjna modyfikacja docelowych białek, która reguluje stabilną asocjację błony, transport białek i interakcje białko-białko1. Polega na dodaniu ugrupowania palmitynianu 16-węgla do reszt cysteiny poprzez wiązanie tioestrowe katalizowane przez enzymy acylotransferazy palmitoilowej (PAT). Wiele białek synaptycznych w mózgu jest palmitoilowanych, w tym AMPA-Rs i PSD-95, w sposób zależny od aktywności, aby regulować stabilność, lokalizację i funkcję2,3,4. Zmiany w poziomach synaptycznych AMPAR w PSD poprzez interakcję czynników pomocniczych z rusztowaniami synaptycznymi, takimi jak PSD-95, leżą u podstaw plastyczności synaptycznej; W związku z tym metody określania stanu palmitoilacji białek synaptycznych dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów plastyczności synaptycznej.
Poprzednio zidentyfikowaliśmy rodzinę czterech genów SynDIG (SynDIG1-4) kodujących specyficzne dla mózgu białka transbłonowe, które kojarzą się z AMPARs5. Nadekspresja lub knockdown SynDIG1 w zdysocjowanych neuronach hipokampa szczura zwiększa lub zmniejsza odpowiednio rozmiar i liczbę synaps AMPA-R o ~50%, jak wykryto za pomocą immunocytochemii i elektrofizjologii5. Wykorzystaliśmy test wymiany acyl-biotyny (ABE), aby wykazać, że SynDIG1 jest palmitoilowany na dwóch konserwatywnych transbłonowych resztach Cys (znajdujących się we wszystkich białkach SynDIG) w sposób zależny od aktywności, aby regulować stabilność, lokalizację i funkcję6. Test ABE opiera się na wymianie biotyny na cysteiny chronione przez modyfikację i późniejsze oczyszczanie powinowactwa7. W tym miejscu opisujemy innowacyjne podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-PEGylowego (APEGS)8,9,10,11,12, który nie wymaga oczyszczania powinowactwa, a zamiast tego wykorzystuje zmiany w ruchliwości żelu do określenia liczby modyfikacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół jest opisany w celu zbadania endogennych białek błonowych z mózgu myszy, dla których dostępne są odpowiednie przeciwciała.

<table><tbody><tr><td>Hydroksyloamina (SZYNKA)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Metoksy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>lub równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>N-etylomalemid (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Silnie toksyczny.</td></tr><tr><td>Obrazownik optyczny do densytometrii</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>lub równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe z nasadką</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (szkło)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>lub równoważne wyposażenie</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>EMD Milipor</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Uważa się, że zależne od aktywności zmiany poziomów synaptycznych receptorów AMPA (AMPAR) w gęstości postsynaptycznej (PSD) reprezentują komórkowy mechanizm uczenia się i pamięci. Palmitoylacja reguluje lokalizację i funkcję wielu białek synaptycznych, w tym AMPA-R, czynników pomocniczych i rusztowań synaptycznych w sposób zależny od aktywności. Zidentyfikowaliśmy rodzinę czterech genów (SynDIG1-4) genów indukowanych różnicowaniem synaps (SynDIG) kodujących specyficzne dla mózgu białka transbłonowe, które łączą się z AMPAR i regulują siłę synaps. SynDIG1 jest palmitoilowany na dwóch resztach cysteiny znajdujących się w pozycjach 191 i 192 w regionie transbłonowym juxta, ważnym dla rozwoju synaps pobudzających zależnych od aktywności. W tym miejscu opisujemy innowacyjne podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania i wykazania jego użyteczności z rodziną białek SynDIG w lizatach mózgu myszy.

Immunoblotting z użyciem przeciwciał przeciwko białku zainteresowania ujawnia stan palmitoilacji (brak, jednokrotna, dwukrotna itp.) w lizatach mózgu myszy, określony na podstawie przesunięcia mobilności w porównaniu z próbkami, do których nie dodano HAM. Wcześniej wykazaliśmy, że SynDIG1 jest palmitoilowany w dwóch miejscach przy użyciu analizy ABE6; jednak nie byliśmy w stanie określić, czy oba te miejsca są modyfikowane w tkance mózgowej. Tutaj pokazujemy, że Sy...

Palmitoylacja polega na włączeniu 16-węglowego ugrupowania palmitynianowego do reszt cysteinowych docelowych białek w odwracalny sposób. W tym miejscu opisujemy podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w lizatach mózgu myszy.

Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Ta metoda biochemiczna pozwala na określenie stanu palmitoilacji dowolnego białka błonowego ulegającego ekspresji w mózgu, dla którego dostępne jest odpowiednie przeciwciało. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona oczyszczania powinowactwa, a zamiast tego wykorzystuje zmiany w ruchliwości żelu do określenia liczby modyfikacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Po wypreparowaniu mózgu należy go natychmiast homogenizować w 10 mililitrach buforu homogenizacyjnego w szklanym homogenizatorze na lodzie.Używając około 12 pociągnięć, odwiruj lizaty przez 15 minut w temperaturze 1400 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Zawiesić osad w 10 mililitrach buforu homogenizacyjnego.Homogenizuj go za pomocą około sześciu pociągnięć. Odwirować zawiesinę w temperaturze 710 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Połączyć supernatanty i odwirować je w temperaturze 40 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowaną frakcję membranową w buforze homogenizacyjnym, rozbijając osad końcówką pipety i pipetując w górę iw dół. Wykonaj test ABCA, aby określić ilościowo poziomy białka. Aby wykonać test APEGS, umieść 470 mikrolitrów buforu A w probówce o pojemności 1,5 mililitra i dodaj około 100 do 200 miligramów białka.Poddać probówkę działaniu sonikacji, a następnie oddzielić nierozpuszczalne białko poprzez odwirowanie probówki w temperaturze 25 stopni Celsjusza i minimum 13 000 razy G przez 10 minut. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Najpierw rozerwij wiązania dwusiarczkowe poprzez inkubację rozpuszczonego białka w 25 mikrolitrach TCEP przez 60 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza.Następnie zablokuj wolne cysteiny, inkubując roztwór z 12,5 mikrolitrami roztworu podstawowego NEM przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie rozpocznij proces wytrącania chloroformu metanolu. Przenieś roztwór białka z probówki o pojemności 1,5 mililitra do probówki polipropylenowej lub szklanej, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym z niewielką prędkością.Dodaj dwa mililitry metanolu i krótko wiruj. Dodaj jeden mililitr chloroformu i krótko wiruj. Następnie dodaj 1,5 mililitra wody dejonizowanej i ponownie krótko wiruj.W razie potrzeby odwróć rurkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Odwirować próbki w temperaturze 3000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 30 minut w kołyszącym się wirniku kubełkowym. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę roztworu do probówki.Dodaj 1,5 mililitra metanolu. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie poprzez delikatne odwrócenie tuby, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego. Odwirować próbkę w temperaturze 3000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut w kołyszącym się wirniku kubełkowym.Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy roztworu, nie naruszając naleśnika białkowego. Ostrożnie spłucz granulat jednym mililitrem metanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10 minut. Po zakończeniu wytrącania chloroformu metanolu rozpocznij rozszczepianie wiązań tioestrów palmitoilu poprzez ponowne zawieszenie osadu białkowego w 125 mikrolitrach buforu A. Przenieś do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Krótko poddać probówkę działaniu sonikacji, a następnie odwirować ją w temperaturze 13 000 razy G lub wyższej i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalny materiał. Przenieś rozpuszczone białko do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 375 mikrolitrów buforu H lub buforu T. Po inkubacji próbek przez 60 minut w temperaturze pokojowej powtórzyć wytrącanie chloroformu metanolu. Aby dodać m-PEG do niezabezpieczonych cystein, należy rozpocząć od ponownego zawieszenia osadu w 100 mikrolitrach buforu A zawierającego 10 mil lub więcej TCEP.Następnie przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej tuby. Dodać 25 mikrolitrów podstawowego roztworu m-PEG 5K i wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze pokojowej z obrotem od końca do końca.Po 60 minutach inkubacji usunąć niewbudowany m-PEG 5K, ponownie wytrącając chloroform metanolu. Wirować w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego, kłaczkowatego naleśnika.Dodaj jeden mililitr metanolu i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i przepłukać osad jednym mililitrem metanolu.Ponownie wirować w temperaturze większej niż 13 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po wysuszeniu granulatu na powietrzu należy go ponownie zawiesić w 50 mikrolitrach buforu A bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego. Zarezerwuj 5 mikrolitrów roztworu do ilościowego oznaczania białka BCA.Po oznaczeniu ilościowym dodać odpowiednią ilość 4x bufor do próbek Laemmli. Załaduj próbkę do żelu do stronicowania SDS. Stosuj standardowe protokoły separacji, transferu i wykrywania dla western blot.Aby zbadać stan palmitoilacji białek SynDIG, frakcje błony P2 z homogenizowanych mózgów myszy poddano testowi APEGS. Separacja i sondowanie przeciwciałami wykazało, że SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 i Prrt2 są palmitoilowane w mózgu myszy. Celem wytrącania metanolu chloroformowego jest zapobieżenie zakłóceniu przez jedną substancję chemiczną, taką jak NEM, następnego etapu protokołu.Odpowiednie wytrącanie chloroformu metanolu usunie niepożądane substancje chemiczne, jednocześnie minimalizując utratę białka. Metodę tę można zastosować do lizatów mózgowych myszy w różnym wieku lub z różnych regionów mózgu w celu zbadania przestrzenno-czasowych regulacji palmitoilacji.

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Film przedstawia analizę stanu palmitoilacji białek błony komórkowej wyizolowanych z tkanki mózgowej myszy. Proces ten polega na wystawieniu niepalmitoilowanych cystein i zablokowaniu ich, a następnie użyciu polimeru, który wiąże się z cysteinami palmitoilowanymi, pomagając w ocenie stanu palmitoilacji wyizolowanych białek.

Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Poznaj metodę APEGS do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej w lizatach mózgu myszy. Ta technika nie wymaga oczyszczania afinicznego i wykorzystuje zmiany ruchliwości w żelu.

Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

Przeglądaj więcej filmów