Name: Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji in situ do wykrywania lokalizacji mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus. Technika umożliwia wizualizację ekspresji genu dmrt1 w komórkach trofoblastu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31801034), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian, Chiny (2016J01161), Fundusze Badań Naukowych Uniwersytetu Huaqiao (15BS306) oraz Fundusz Innowacyjnych Studiów Podyplomowych Uniwersytetu Huaqiao.

Procedura dotycząca zwierząt została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Huaqiao.
1. Przygotowanie rybosondy
<ol>
	<li>Wzór podkładu
	<ol>
		<li>Otwórz program Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Skopiuj sekwencję dmrt1 (GenBank: MK182259) do okna sekwencji.</li>
		<li>Ustaw długość podkładu (23-25 pz), temperaturę topnienia (55-60 °C) i zawartość G/C (40-60%). Kliknij opcję Pobierz podkłady. 
		UWAGA: Minimalny rozmiar wymagany dla sondy RNA to około 500 pz. Dłuższe sondy mają zwykle wyższą specyficzność.</li>
		<li>Dodaj sekwencję promotora polimerazy RNA T7 (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) do jednego z wybranych starterów. Sekwencje starterów dmrt1 dla ISH przedstawiono w tabeli 1. 
		UWAGA: W przypadku sond sensownych promotor polimerazy RNA T7 znajduje się na końcu 5' starterów do przodu. W przypadku sond antysensownych promotor polimerazy RNA T7 znajduje się na końcu 5' starterów odwrotnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR
	<ol>
		<li>Umieść probówki do mikrofuge na lodzie i przygotuj następującą mieszaninę reakcyjną (dla reakcji 50 μl): 1x mieszanina polimerazy DNA Taq, 1 μg cDNA (który jest przygotowywany ze 100 μl płynu celomicznego), 1 μM starter do przodu, 1 μM starter do tyłu i woda wolna od nukleaz.</li>
		<li>Wymieszać reakcję PCR przez pipetowanie i krótko odwirować.</li>
		<li>Umieścić probówkę reakcyjną w termocyklerze i uruchomić PCR w następujących warunkach: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie 36 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55–60 °C przez 30 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 minut 
		UWAGA: Temperaturę wyżarzania należy zoptymalizować zgodnie z podkładami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie i weryfikacja produktu metodą PCR
	<ol>
		<li>Załaduj 50 μl mieszaniny PCR bezpośrednio na 1% żel agarozowy. Uruchom żel agarozowy pod napięciem 150-180 V przez 10 minut w 0,5x TBE. Wyizolować określone fragmenty DNA z 1% żelu agarozowego. 
		UWAGA: DNA powinno pojawiać się jako pojedynczy prążek, a nie jako rozmaz.</li>
		<li>Oczyść fragmenty DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć ilościowo oczyszczone produkty za pomocą spektrofotometrii o długości fali 260 nm.</li>
		<li>Zweryfikuj autentyczność produktów PCR przez sekwencjonowanie. 
		UWAGA: (Punkt pauzy) Oczyszczone produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza rybosondy
	<ol>
		<li>Umieść probówki do mikrofug bez RNaz na lodzie i dodaj następujące składniki do probówki do mikrofuge (dla reakcji 10 μl): 1x mieszanka do znakowania RNA digoksygeniny, 1x bufor transkrypcyjny, 0,5 μl inhibitorów RNazy, 1 μl polimeraz RNA T7, 1 μg produktu PCR i woda wolna od RNaz. Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 2 μl DNazy I, wolnej od RNaz. Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 2 μl 0,2 M EDTA (pH 8,0). Wymieszać reakcję przez pipetowanie i krótko odwirować.</li>
		<li>Do powyższej reakcji dodać 2,5 μl 4 M LiCl i 75 μl wstępnie schłodzonego etanolu. Dobrze wymieszaj. Pozostawić na 30 minut w temperaturze -70 °C.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować etanol. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 70% etanolu (v/v) i przepłukać osad, delikatnie mieszając.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować 70% etanol i krótko wysuszyć osad w pobliżu lampy alkoholowej. Rozpuścić osad, dodając 30 μl wody wolnej od RNaz i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Załaduj 2 μl zsyntetyzowanego RNA na 1% żel agarozowy. Uruchom żel agarozowy pod napięciem 180 V przez 5-10 minut w 0,5x TBE. Zmierzyć stężenie znakowanego RNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm.
		<ol>
			<li>Używaj probówek do mikrofuge i końcówek filtrujących bez RNaz, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą. 
			UWAGA: (Punkt pauzy) Sondy znakowane digoksygeniną mogą być przechowywane w temperaturze -70 °C przez kilka miesięcy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie płynów celomicznego
<ol>
	<li>Zamocuj S. nudus na stole sekcyjnym za pomocą szpilek. Otwórz ciało S. nudus małymi autoklawowanymi nożyczkami. Wyizolować płyn celomiczny za pomocą pipety.</li>
	<li>Zebrać i przenieść 1 ml płynu celomicznego za pomocą pipety do szkiełek mikroskopowych poddanych działaniu poli-D-lizyny. Płyn celomiczny nanieść równomiernie za pomocą końcówki pipety. Szkiełka suszyć na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja in situ
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Ponownie uwodnić szkiełka w słoiku do barwienia szkiełek zawierającym 100 ml 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym poddanym pirowęglanem dietylu (DEPC-PBS). Ponownie nawodnić 3 razy za pomocą 1x DEPC-PBS, 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Rozmaz płynu celomicznego należy przesycić przez trawienie 10 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Inkubować szkiełka w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut, aby zatrzymać trawienie. Myć szkiełka w 1x DEPC-PBS z delikatnym mieszaniem przez 5 minut 3 razy.</li>
		<li>Dodać 50 μl mieszanki hybrydyzacyjnej (HM) zawierającej rybosondę sens/antysensowną na szkiełkach i dodać szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Dodaj bufor mokrego pudełka do mokrego pudełka. Włóż szkiełka do mokrego pudełka i dobrze uszczelnij folią parafinową. Hybrydyzować przez noc (co najmniej 16 godzin) w temperaturze 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Rozgrzej bufor do płukania w temperaturze 65 °C. Zanurz szkiełko w pojemniku do barwienia szkiełek zawierającym bufor do płukania i odstaw do momentu, aż szkiełko nakrywkowe zsunie się automatycznie. Zajmuje to około 5 minut.</li>
		<li>Umyć 2 razy buforem do płukania w temperaturze 65 °C, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przemyć 2 razy 0,2x roztworem cytrynianu soli fizjologicznej (SSC) w temperaturze 65 °C, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przemyć 2 razy buforem kwasu maleinowego zawierającym Tween 20 (MABT) w temperaturze pokojowej, 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Szkiełka należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 3–4 godziny w buforze blokującym. Inkubować szkiełka w 1 ml roztworu fragmentów anty-digoksygeniny-AP Fab rozcieńczonego w stosunku 1/5000 z buforem blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciał i krótko umyć szkiełka w MABT. Umyć 4 razy MABT w temperaturze pokojowej, 25 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z alkalicznym buforem fosfatazy w temperaturze pokojowej 3 razy po 5 minut na pranie. Usunąć bufor fosfatazy alkalicznej i dodać 1 ml roztworu barwiącego 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP)/nitro niebieskiego tetrazolu (NBT). Trzymaj slajdy w ciemności.</li>
		<li>Okresowo obserwuj reakcję barwy pod mikroskopem optymalnym. Gdy kolor jest w pełni rozwinięty (czas reakcji w zakresie 1-4 h), umyj szkiełka 2 razy MABT w temperaturze pokojowej, po 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Umyć 2 razy roztworem zatrzymującym w temperaturze pokojowej, 15 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Inkubować szkiełka w metanolu w celu usunięcia nadmiaru plam, w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W zależności od koloru tła, mycie metanolem można wykonać 2 lub 3 razy, a czas odbarwiania można wydłużyć.</li>
		<li>Umyć 2 razy MABT w temperaturze pokojowej, 5 minut na pranie z delikatnym mieszaniem. Przenieś szkiełka na świeżą bibułę filtracyjną. Dodać 50 μl glicerolu. Dodaj szkiełka nakrywkowe i obserwuj pod mikroskopem. 
		UWAGA: Skład roztworu przedstawiono w Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniejsze badania wykazały, że ISH nadaje się do wykrywania wielu docelowych RNA 16,17,18. W tym protokole opisaliśmy metodę ISH o wysokiej rozdzielczości do wykrywania mRNA w płynie celomicznym i podkreślenia zoptymalizowanych warunków hybrydyzacji w Sipunculus nudus. Oczywiste sygnały dmrt1, które zaobserwowaliśmy, wykazały skuteczne zastosowanie tego protokołu w wykrywaniu ekspresji genów (<strong class="...

ISH, wykorzystując znakowaną sondę kwasu nukleinowego do wykrywania interesującej nas sekwencji DNA lub RNA, jest użyteczną metodą do opisu przestrzennego wzorca ekspresji docelowych genów w morfologicznie zachowanych tkankach1,2,3. Zwykle sekwencja docelowa jest generowana przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), a następnie wykorzystywana jako matryca do syntezy sondy antysensownego / sensownego RNA znakowanej digoksygeniną urydyno-5'-trifosforanem. Próbki są utrwalane i przepuszczalne przed inkubacją za pomocą rybosondy. Po zmyciu nadmiaru sondy, hybrydyzacja jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii przy użyciu przeciwciała anty-digoksygeninowego, które jest sprzężone z fosfatazą alkaliczną3,4,5,6.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; rząd Sipunculida: Sipunculidae) to niesegmentowany, celomatowy i obustronnie symetryczny robak morski7,8. Sipunculus nudus to kosmopolityczny gatunek szeroko rozpowszechniony w tropikalnych i umiarkowanych wodach przybrzeżnych. Jest to również ważny morski zasób rybny w południowych Chinach ze względu na wysokie wartości odżywcze i lecznicze9,10. Jednak Sipunculus nudus w biologii molekularnej jest wciąż w powijakach. Aby w pełni zrozumieć biologiczną rolę genów, bardzo interesujące jest badanie wzorców ekspresji genów w rozdzielczości komórkowej. W niemodelowym organizmie Sipunculus nudus metoda ISH, która jest idealną metodą wykrywania wzorców ekspresji genów, nie została jeszcze ustalona. Jego płyn celomiczny zawiera kilka typów komórek, w tym granulocyty, komórki urnowe, komórki pęcherzykowe, komórki rozrodcze, erytrocyty itp11. Czynnik transkrypcyjny 1 związany z podwójną płcią/mab-3 (dmrt1), używany jako gen reprezentatywny w tej metodzie, jest wysoce konserwatywnym regulatorem transkrypcji determinacji i różnicowania płci u większości gatunków, od bezkręgowców po ssaki12,13. W wielu gatunkach (np. porgy itp.)14, dmrt1 został wyrażony w komórkach Sertoliego, otaczających komórki rozrodcze, których funkcja jest podobna do komórek trofoblastu Sipunculus nudus. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że dmrt1 Sipunculus nudus ulega ekspresji w komórkach trofoblastu plemników, a wynik metody ISH jednoznacznie potwierdził hipotezę.
Ten protokół po raz pierwszy opisuje ISH, z sondami mRNA znakowanymi digoksygeniną, w celu określenia wzorców ekspresji mRNA w rozmazie płynu celomicznego. Zapewnione są optymalne warunki reakcji, które pozwalają na bardzo czułą wizualizację ekspresji mRNA w wysokiej rozdzielczości. Opracowana metoda ISH może być potencjalnie zastosowana u większej liczby gatunków Sipunculida innych niż Sipunculus nudus.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anty-digoksygenina-AP Fragmenty Fab Roche</td><td></td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznej BCIP/NBT</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>cytrynowySinopharm Odczynnik chemiczny Co.</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy trisodowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Amresco</td><td>7.12.1975</td><td></td></tr><tr><td>Pirowęglan dietylu, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Substancja szkodliwa</td></tr><tr><td>Digoxigenina (DIG) Mieszanka do znakowania RNA Roche</td><td></td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, bez RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie żelowe do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do ekstrakcji żelu</td><td>Omega</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do elektroforezy żelowej</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>8/1/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny Co.</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny Co.</td><td>67-56-1</td><td>Szkodliwa substancja</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>folia parafinowa</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Szkodliwa substancja</td></tr><tr><td>Instrument PCR Life</td><td>Technology</td><td>Proflex</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Deli</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe poddane działaniu poli-D-lizyny</td><td>Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Słoik do barwienia szkiełek</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko do przechowywania szkiełek</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>Małe autoklawizowane nożyczki</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometry</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimerazy RNA</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq Mieszanka polimeraz DNA (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ dla sipunculus nudus płyn celomiczny

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Hybrydyzacja in situ (ISH) jest bardzo pouczającą techniką prezentowania wzorców dystrybucji komórkowej określonych genów (np. mRNA i ncRNA) w tkankach. Sipunculus nudus jest kluczowym zasobem rybnym, ponieważ ma wysokie wartości odżywcze i lecznicze. Obecnie badania nad biologią molekularną Sipunculus nudus są wciąż w powijakach. Celem artykułu jest opracowanie czułej metody lokalizacji specyficznego mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus. Protokół zawiera szczegółowe etapy ISH, w tym przygotowanie antysensowności i rybosondy znakowanej digoksygeniną, pobieranie płynu celomicznego i przygotowanie sekcji, hybrydyzację specyficznej rybosondy, inkubację przeciwciał, barwienie i zabiegi po barwieniu. Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z udanego eksperymentu przy użyciu tej metody. Protokół powinien mieć zastosowanie również do innych gatunków Sipuncula.

Podsumowanie etapów przeprowadzania ISH przedstawiono na Rysunku 1. Antysensowne i odpowiadające im sensowne sondy rybo- dla dmrt1 zsyntezowano z produktów PCR amplifikowanych z cDNA płynu w jamie ciała. Autentyczność produktów PCR zweryfikowano poprzez sekwencjonowanie bezpośrednie. Sondy rybo- zsyntezowano przy użyciu polimeraz RNA T7 zgodnie z protokołami producenta oraz wcześniejszym raportem4 z niewielkimi modyfikacjami. Reprezentatywne sygnały ISH przed...

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

Hybrydyzacja in situ jest bardzo pouczającą techniką przedstawiania wzorców ekspresji mRNA i IncRNA określonych genów w tkankach. Celem naszego artykułu jest opracowanie czułej metody wykrywania specyficznej lokalizacji mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus, który jest kluczowym zasobem rybnym. Przedstawiliśmy reprezentatywne wyniki uzyskane z naszych udanych eksperymentów przy użyciu tej metody.Mamy nadzieję, że nasza metoda zostanie zastosowana do innych gatunków Sipuncula do identyfikacji wzorców ekspresji specyficznego mRNA i IncRNA w płynie celomicznym. Napraw Sipunculus nudus na stole sekcyjnym. Otwórz ciało Sipunculus nudus małymi autoklawowanymi nożyczkami.Następnie zebrać i przenieść płyn celomiczny za pomocą pipety do szkiełek mikroskopowych poddanych działaniu poli-D-lizyny, delikatnie rozprowadzając. Suszyć szkiełka na powietrzu przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Myć szkiełka preparatem DEPC-PBS trzy razy po pięć minut na mycie, delikatnie mieszając.Odcedź PBS, dodaj roztwór proteinazy K na szkiełka przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór proteinazy K. Dodaj roztwór PFA na szkiełka przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Opróżnij roztwór PFA. Myć szkiełka preparatem DEPC-PBS trzy razy po pięć minut na mycie, delikatnie mieszając. Opróżnij PBS.Dodaj 50 mikrolitrów rybosondy. Dodaj szkiełko nakrywkowe. Włóż szkiełka do mokrego pudełka i dobrze uszczelnij folią parafinową.Hybrydyzuj przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Zanurz szkiełka w buforze do płukania i odstaw, aż szkiełko nakrywkowe zsunie się automatycznie. Umyć szkiełka podgrzanym buforem myjącym dwa razy w temperaturze 65 stopni Celsjusza, 30 minut na mycie z delikatnym mieszaniem.Umyć szkiełka podgrzanym roztworem SSC dwa razy w temperaturze 65 stopni Celsjusza, 30 minut na mycie z delikatnym mieszaniem. Umyć szkiełka roztworem MABT dwa razy w temperaturze pokojowej. 30 minut na pranie z delikatnym mieszaniem.Opróżnij MABT. Dodaj bufor blokujący. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech godzin.Opróżnij bufor blokujący. Dodaj przeciwciało, inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Spuść roztwór przeciwciała.Myć szkiełka roztworem MABT cztery razy po 25 minut na mycie, delikatnie mieszając. Opróżnij MABT. Dodaj bufor fosfatazy alkalicznej trzy razy po pięć minut na inkubację.Usuń bufor fosfatazy alkalicznej. Dodaj roztwór barwiący BCIP-NBT. Trzymaj slajdy w ciemności.Czas barwienia waha się od minut do godzin, nawet w nocy, co zależy od intensywności sygnału. Stan barwienia należy sprawdzać częściej na początku barwienia. Na przykład w odstępie kilku minut, a najpóźniej kilka godzin barwienia.Czas sprawdzania powinien być jak najkrótszy, aby uniknąć wprowadzenia wysokiej sygnalizacji tła z powodu ekspozycji na światło. Pokazano reprezentatywne sygnały hybrydyzacji in situ. Hybrydyzacja in situ płynu celomicznego Sipunculus nudus z rybosondą antysensowną, która jest ukierunkowana na dmrt1, wskazuje na fioletowe barwienie skoncentrowane w komórkach trofoblastu spermatozeugmata, figura 2A i B.Rybosonda Sense dla dmrt1 nie wykryła żadnego sygnału hybrydyzacji, figura 2C.Po obejrzeniu tego filmu miałbyś bardzo dobre zrozumienie, jak wizualizować wzorce ekspresji docelowego mRNA lub IncRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

in-situ-hybridization-for-sipunculus-nudus-coelomic-fluid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji komórek proliferujących podobnych do macierzystych u meduzy Cladonema. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z pełnym montowaniem z markerem komórek macierzystych pozwala na wykrycie komórek macierzystych, a znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną umożliwia identyfikację komórek proliferujących. Razem można wykryć aktywnie proliferujące komórki macierzyste.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny komórek macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum

Poznaj metodę hybrydyzacji in situ do wykrywania lokalizacji mRNA w płynie celomicznym Sipunculus nudus. Technika umożliwia wizualizację ekspresji genu dmrt1 w komórkach trofoblastu.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

Przeglądaj więcej filmów