Name: Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Poznaj metodę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów w swobodnie poruszających się myszach. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wielkie podziękowania dla Prof Klaus-Armin Narve i Dr. Sandry Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Niemcy) za uprzejme dostarczenie myszy Nex-Cre. Dziękujemy również naszemu zespołowi filmowemu Yunusowi Dikici i Rubenowi Wiesnerowi za nagranie i przetworzenie filmu JoVE do tego artykułu. Ponadto wielkie podziękowania dla Kristin Claussen za jej głos i Kimberly Anne Go za korektę rękopisu.
Prezentowane wyniki uzyskano na Uniwersytecie Ruhry w Bochum, a film został nagrany na Uniwersytecie w Bremie.
Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Projektnummer 122679504 - SFB 874 i DFG MA 4692/3-2.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystanie światła do manipulowania sygnalizacją neuronalną jest metodą z wyboru już od prawie dekady. Od 2005 roku liczba opublikowanych artykułów na temat rozwoju nowych narzędzi optogenetycznych 4,6,8,14,49,50,51 oraz badań, w których takie narzędzia są wykorzystywane do badania obwodów mózgowych 21,23,40,43,52 , znacznie zwiększony. Z jednej strony, przy ogromnej różnorodności wstrzykiwanych narzędzi optogenetycznych, wariantów implantacji, transgenicznych linii myszy i eksperymentów behawioralnych, możliwości eksperymentów są wielorakie i nieograniczone. Z drugiej strony, możliwość popełnienia błędów w doborze warunków eksperymentalnych jest bardzo duża, a eksperymenty są na tyle specyficzne, że często trudno jest je porównać z innymi badaniami.
Kroki krytyczne Jednym z ważnych krytycznych kroków tego protokołu jest właściwe planowanie. Wybór narzędzia optogenetycznego powinien być zgodny z pytaniem naukowym. Czy konieczne jest tylko manipulowanie ogólną aktywnością neuronu lub synapsy? W takim razie dobrym wyborem są komercyjnie dostarczane narzędzia, takie jak ChR221,25,27 i Arch37. Ale poza tym, jeśli ma się manipulować jednym specjalnym układem neuroprzekaźników lub nawet pojedynczym receptorem, indywidualna chimera receptora jest często lepszym wyborem 3,6. Kilka chimer receptorowych z GPCR, tzw. Opto-XR, oraz wytyczne do ich wytwarzania są już dostępne 4,50. Oprócz wyboru narzędzi optogenetycznych, kluczowe znaczenie ma również linia myszy w połączeniu z eksperymentem behawioralnym. Różne szczepy tła, takie jak na przykład C57Bl/6 i BALB/cByJ, wykazują różne fenotypy behawioralne pod pewnymi względami53,54. Myszy C57Bl / 6 mają niski wyjściowy lęk i mogą być używane do manipulacji przeciwlękowej, podczas gdy BALB / cByJ wykazują wyższy poziom lęku i dlatego są bardziej wrażliwe na leki przeciwlękowe. Dodatkowo, transgeniczne warianty tych szczepów tła mogą również różnić się fenotypem48. Dzięki odpowiedniej kombinacji specyficznych promotorów w połączeniu z narzędziem optogenetycznym i transgeniczną linią myszy, prawie każda pożądana populacja komórek może być ukierunkowana.
Kluczowym krokiem podczas operacji jest celowanie we właściwe miejsce. Za pomocą atlasu mózgu myszy można ustalić właściwe współrzędne osi przednio-tylnej i przyśrodkowej-bocznej oraz głębokość struktury45. W rzeczywistości każda czaszka ma nieco inną formę i wielkość. Dlatego współczynnik F46 do regulacji współrzędnych stereotaktycznych jest bardzo ważny, podobnie jak prawidłowe mocowanie nosa i ucha podczas operacji stereotaktycznej. Jeśli głowa myszy jest przechylona, kaniula iniekcyjna nie będzie celować w żądany obszar zainteresowania.
Dodatkowo krytyczna jest również średnica kaniuli iniekcyjnej. Jeśli jest zbyt mały, żaden wirus nie może zostać uwolniony do tkanki, jeśli jest zbyt szeroki, kaniula wycieknie roztwór wirusa w drodze do obszaru zainteresowania. Jeśli wszczepiony światłowód kończy się bezpośrednio nad regionem docelowym, ekspresja wirusa w obszarach kory mózgowej powyżej nie ma znaczenia. Ale jeśli implant zostanie umieszczony nad innymi obszarami w celu stymulacji zakończeń aksonów, aksony górnych regionów kory również zostaną aktywowane przez światło i sfałszują uzyskane dane. Na przykład: Region IL i region przedlimbiczny (PrL) rzutują na ciało migdałowatepodstawy 55,56, ale mają zupełnie inne funkcje i role w modulacji lęku26,57. Jeśli implant zostanie umieszczony powyżej ciała migdałowatego w celu aktywacji zakończeń aksonów z obszaru IL, a podczas iniekcji roztwór wirusa został również umieszczony w PrL z powodu niewłaściwej kaniuli iniekcyjnej, ryzyko aktywacji również końcówek aksonów z PrL jest bardzo wysokie.
Podczas przygotowania czaszki do zamocowania implantu, rzadkie użycie podkładu i spoiwa ma kluczowe znaczenie dla niezawodnego i trwałego mocowania. Jeśli 2-składnikowy system adhezyjny nie zostanie nałożony cienko, cement dentystyczny może oderwać się od czaszki po kilku dniach lub tygodniach. Ponadto czaszka musi być całkowicie wysuszona przed zamocowaniem implantu, ponieważ w przeciwnym razie cement nie przylgnie prawidłowo do czaszki.
Krytyczne kroki istnieją również w behawioralnej części tego protokołu. Po pierwsze, bardzo ważna jest budowa labiryntu. W każdym układzie behawioralnym istnieje kilka wariantów w literaturze dotyczącej wielkości i formy, a także samej procedury 58,59,60. Ważne jest, aby wybrać wariant, który sprawi, że dane będą porównywalne i powtarzalne. Należy również wziąć pod uwagę specjalne wymagania dotyczące używanych linii myszy43,48. W danych reprezentatywnych dla EPM można zauważyć, że kilka myszy Nex-Cre wypadło z labiryntu lub kilkakrotnie się ześlizgnęło (ryc. 2b). Dla tych myszy lepszą alternatywą byłby labirynt z małym murkiem wokół otwartych ramion.
Po drugie, bardzo ważne jest, aby wszystkie warunki zewnętrzne w pomieszczeniu były stałe61, w przeciwnym razie różne grupy myszy nie byłyby w ogóle porównywalne. W związku z tym bardzo ważne jest, aby wybrać czas eksperymentu jako taki, w którym zestaw eksperymentalny jest wolny, a eksperymentator jest zawsze obecny. Ponadto należy wziąć pod uwagę zdarzenia w budynku, takie jak prace budowlane, testowanie jakichkolwiek systemów (alarm przeciwpożarowy) lub dzień sprzątania obiektu myszy, aby uniknąć ingerencji w uzyskane dane.
Wreszcie, warunki obsługi i przetrzymywania mają kluczowe znaczenie dla eksperymentów behawioralnych. Podczas implantacji myszy muszą być trzymane w jednym pomieszczeniu ze względu na ryzyko obrażeń spowodowanych przez inne myszy. Aby zapewnić dobrą porównywalność między grupami i niski poziom błędu w jednej grupie, każda mysz musi mieć ten sam rozmiar klatki i wzbogacenie. W przypadku eksperymentów związanych z lękiem, pojedyncze trzymanie ma pewne zalety, ponieważ samce myszy trzymane w jednym pomieszczeniu wykazują niższy wyjściowy poziom lęku, mniejszą zmienność poziomu lęku i mniej objawów depresyjnych15,16. Samce myszy trzymane w grupie mogą znacznie różnić się poziomem lęku ze względu na hierarchię wśród myszy. Oprócz pomieszczenia inwentarskiego ważne jest również stałe i równe obchodzenie się ze wszystkimi myszami i grupami. Chwytanie myszy w celu połączenia światłowodu na implancie jest bardzo stresujące. Dlatego ta procedura musi być taka sama dla każdej myszy, co oznacza tę samą technikę i tego samego eksperymentatora. Co więcej, czas przyzwyczajenia w klatce oczekiwania, który ma na celu uspokojenie myszy po stresującej procedurze łączenia, musi również mieć takie same warunki pod względem czasu trwania, śmieci i pozycji w labiryncie. Obsługa w obiekcie myszy ma również kluczowe znaczenie dla późniejszej wydajności behawioralnej. Zwierzęta doświadczalne i kontrolne nie powinny być czyszczone w różne dni lub przez różne osoby, ponieważ jest to również stresujące dla myszy. Ponadto dzień sprzątania nie powinien być dniem eksperymentalnym, aby uniknąć różnic w zachowaniu.
Rozwiązywanie problemów Istnieje kilka problemów, które mogą wystąpić podczas protokołu. Na przykład wiercenie w całości w czaszce podczas operacji stereotaktycznej może uszkodzić naczynia krwionośne. Zwykle występuje silne krwawienie, zwłaszcza powyżej bregmy i lambdy. Jeśli tak się stanie, nie próbuj zatamować krwawienia patyczkami kosmetycznymi, ponieważ mają one tendencję do jeszcze większego krwawienia z naczynia ze względu na ich chłonność, zamiast tego należy bezpośrednio spłukać NaCl.
Może się również zdarzyć, że wstrzyknięcie ciśnieniowe roztworu wirusa nie działa. W takim przypadku może się zdarzyć, że parafilm, strup z otworu zadziorowego lub tkanki mózgowej, zatyka końcówkę kaniuli. W takim przypadku należy powoli wyjąć kaniulę z mózgu bez zmiany osi x lub y i za pomocą pęsety usunąć 1-2 mm przedniej części końcówki kaniuli. Przed ponownym opuszczeniem kaniuli przetestuj funkcjonalność, wywierając niewielki nacisk, aby sprawdzić, czy wirus wydostaje się z końcówki kaniuli. Aby uniknąć zaparć, należy opuścić kaniulę ze stałą prędkością i nie przerywać ruchu, dopóki nie zostanie osiągnięta najgłębsza głębokość strony iniekcyjnej. Jeśli usunięta zostanie zbyt duża część końcówki kaniuli, a średnica będzie zbyt duża, kaniula uszkodzi tkankę, a ryzyko nałożenia wirusa na raz wzrośnie. Dlatego upewnij się, że tylko zatkana część końcówki została ostrożnie usunięta.
Podczas eksperymentu behawioralnego konfiguracja eksperymentu w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT) może powodować problemy. Jeśli na przykład strumień świetlny nie działa prawidłowo, może to wynikać z kilku powodów. Pulser musi zostać otwarty, zaprogramowany i uruchomiony przed otwarciem Ethovision XT. Sprzęt musi być poprawnie wybrany w "Konfiguracji eksperymentalnej" (krok 3.2.2.4). W przypadku wybrania niewłaściwego IO-Boxa lub czegokolwiek innego niż "Costume Hardware", urządzenie Pulser nie może być kontrolowane przez Ethovision. Jeśli test strumienia świetlnego zakończy się pomyślnie, ale zaprogramowany protokół świetlny w "Próbnych ustawieniach sterowania" nie działa podczas akwizycji, może to oznaczać, że podreguła lub odniesienie do podreguły są nieprawidłowo zlokalizowane lub warunki i działania są niejasne. Na przykład: czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej? Czy odniesienie jest poprawnie zaprogramowane (np. jak często wykonywana jest reguła podrzędna)?
Dodatkowo może się zdarzyć, że podczas "ustawień detekcji" zwierzę jest odpowiednio śledzone, ale podczas pozyskiwania pojawiają się próbki, w których nie znaleziono obiektu. W takim przypadku sprawdź, czy oświetlenie w pomieszczeniu eksperymentalnym zostało zmienione lub czy coś spowodowało niepożądane cienie w labiryncie. Całe dno labiryntu musi mieć ten sam kolor, ponieważ ustawienie będzie działać tylko dla jednej określonej kombinacji. Jeśli z jakichś powodów nie można uniknąć różnych kolorów lub cieni na dole, zdefiniuj ustawienie wykrywania w najciemniejszej części labiryntu.
Aby zmienić jakiekolwiek ustawienia po nabyciu pierwszych zwierząt, nie należy stosować tych zmian w już używanych ustawieniach. Zduplikuj je, aby je dostosować. Oznacza to również, że już zarejestrowane badanie nie jest już ważne do analizy danych. W takim przypadku nagraj wszystkie zwierzęta dla tej grupy eksperymentalnej z oryginalnymi ustawieniami, a następnie utwórz nowy eksperyment, w którym nagrane filmy są analizowane zamiast śledzenia na żywo. W tym eksperymencie "z wideo" do analizy można wykorzystać kilka ustawień bez utraty porównywalności między zwierzętami, a nawet danych.
Ograniczenia i przyszłe zastosowania Ta metoda manipulowania zachowaniem za pomocą optogenetyki u swobodnie poruszających się zwierząt również zawiera ograniczenia. Podczas zabiegu odległość dwóch implantów jest ograniczona. W przypadku podwójnej implantacji odległość między dwoma implantami musi być co najmniej równa szerokości aparatu, aby utrzymać implant. Aparat musi opuścić drugi implant do otworu w zadziorach, podczas gdy pierwsze implanty są już zamocowane. Rozwiązaniem tego problemu może być implantacja pod kątem, w której końcówki włókna szklanego mogą być bardzo blisko, podczas gdy ceramiczne ferule nad czaszką mają większą odległość 23,55,56,57,62,63. Wadą implantacji pod kątem jest rozchodzenie się światła. Gdy końcówka włókna jest nachylona, a nie od prostej góry, stymulowany obszar jest inny. W przypadku dwóch obszarów docelowych znajdujących się w bliskiej odległości należy wziąć pod uwagę zmienione położenie stymulacji świetlnej.
Podczas eksperymentu behawioralnego konstrukcja labiryntu może kolidować z kablem optycznym podłączonym do zwierzęcia. Niektóre testy behawioralne, takie jak jasno-ciemne pudełko, zawierają obszar wewnętrzny64,65, a inne labirynty zawierają przedziały, do których mysz musi wejść. Takich eksperymentów nie można przeprowadzić przy użyciu tej konfiguracji. Alternatywnie system bezprzewodowy może być opcją 22,26,66. Na szczęście niektóre labirynty, takie jak labirynt Barnesa, można urządzić w taki sposób, że myszy są w stanie wejść do odpowiednich przegródek67.
Oprócz tych z zamkniętymi strefami, zbyt szerokie labirynty również mogą sprawiać problemy. Im większa powierzchnia labiryntu, tym dłuższy musi być kabel, aby zwierzę mogło przejść do każdej pozycji w labiryncie. Należy uważać, aby zwierzę nie było w stanie nadepnąć na kabel lub złapać go i ugryźć. Rozwiązaniem tego problemu może być konstrukcja zwijająca redundantny kabel. Wadą jest to, że przeciąganie w celu rozwinięcia kabla jest trudne dla myszy. To rozwiązanie lepiej pasowałoby do szczurów. Inną możliwą opcją może być wykonanie stymulacji świetlnej z wyprzedzeniem, a nie w trakcie eksperymentu, oczywiście jest to wykonalne tylko wtedy, gdy wystąpi długotrwały efekt spowodowany stymulacją światłem23.
Porównanie z istniejącymi/alternatywnymi metodami Alternatywnymi metodami byłaby chemiczna lub elektryczna stymulacja podczas zachowania 8,18. Chemiczni agoniści lub antagoniści są w stanie aktywować lub wyciszać neurony za pośrednictwem określonych receptorów, a także mogą manipulować pojedynczymi systemami neuroprzekaźników38,68. Z jednej strony, swoistość receptorowa jest dość wysoka dla substancji chemicznych, ponieważ specyficzny agonista lub antagonista aktywuje tylko niektóre receptory39. Z drugiej strony, swoistość dla podtypów receptorów z tej samej grupy neuroprzekaźników jest często niewystarczająca. Większość substancji chemicznych wiąże się z co najmniej dwoma podtypami o różnym prawdopodobieństwie69. Ponadto substancje chemiczne nie mogą rozróżniać typów komórek neuronalnych, o ile mają te same typy receptorów. Poza tym rozdzielczość czasowa i przestrzenna jest słaba w przypadku manipulacji chemicznych w porównaniu z optogenetyką. Agoniści lub antagoniści są często podawani doustnie35 lub w postaci zastrzyków ogólnoustrojowych 57,70. Jeśli wlew chemiczny jest wykonywany bezpośrednio w tkance mózgowej, efekty pojawiają się szybciej niż w przypadku aplikacji doustnych, ale nadal w wolniejszym czasie niż w przypadku stymulacji światłem. Ponieważ podawane substancje chemiczne dyfundują w mózgu i nie są specyficzne dla typów neuronów lub regionów mózgu, manipulacja określonymi obwodami mózgu nie jest możliwa.
Stymulacja elektryczna ma wyższą rozdzielczość czasową niż stymulacja chemiczna 9,14. Rozprzestrzenianie się w tkance neuronalnej jest mniejsze niż w przypadku stymulacji chemicznej, a rozdzielczość przestrzenna jest lepsza niż w przypadku stymulacji chemicznej. Jednak stymulacja elektryczna nie ma możliwości specyficznego zajęcia się różnymi typami komórek neuronalnych lub typami receptorów, ponieważ każdy neuron znajdujący się w pobliżu elektrody będzie reagował na stymulację elektryczną.
Alternatywnymi metodami zachowania u swobodnie poruszających się myszy są na przykład zapisy elektrofizjologiczne w wycinkach mózgu, gdzie pojedyncze neurony lub aksony mogą być modulowane za pomocą optogenetyki, a wywołane efekty można mierzyć za pomocą elektrod rejestrujących 6,71. Eksperymenty in vitro dają możliwość zbadania molekularnych i komórkowych podstaw stymulacji optogenetycznej, ale mają ograniczenie polegające na tym, że brakuje wewnętrznej łączności i danych wejściowych z innych regionów mózgu. Inną opcją jest zastosowanie optogenetyki w połączeniu z obrazowaniem wielofotonowym 1,72. W tym przypadku myszy mają nieruchomą głowę i mogą być znieczulone lub obudzić się, aby rozwiązać proste zadania.
Aby przeprowadzić udany eksperyment optogenetyczny, obecnie dostępna jest szeroka gama narzędzi i aplikacji. Dobór narzędzi optogenetycznych i konfiguracji behawioralnej ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Jeśli zostanie wybrana odpowiednia kombinacja narzędzi i eksperymentów, optogenetyka pozwala na bezprecedensowe, dogłębne badanie obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Pomoże to zrozumieć i opracować nowe strategie terapeutyczne w chorobach psychicznych i poznawczych.

Modulacja obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym oraz ich skutki behawioralne są kluczowe dla zrozumienia funkcjonowania mózgu, szczególnie w kontekście chorób psychiatrycznych oraz zadań poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć. Dzięki optogenetyce możliwe jest modulowanie za pomocą światła pojedynczych komórek, populacji komórek, a nawet całych obwodów. Powszechnie stosowane narzędzia optogenetyczne, takie jak Channelrhodopsin2 (ChR2) lub Archaerhodopsin (Arch), pozwalają na aktywację lub wyciszenie neuronów, a także na zwiększenie lub zahamowanie uwalniania przekaźników w zakończeniach aksonów rzutujących do określonych obszarów mózgu1,2,3,4. Należy jednak ostrożnie stosować Arch, ponieważ wykazano, że jego aktywacja w zakończeniach presynaptycznych zwiększa spontaniczne uwalnianie przekaźników5. Arch jest pompą protonową o charakterze prostującym zewnętrznie, która zmienia wartość pH wewnątrz komórki. To zasadowe środowisko indukuje napływ wapnia i nasila uwalnianie przekaźników5. W celu specyficznej modulacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych można tworzyć chimery receptorowe składające się z aktywowanego światłem narzędzia optogenetycznego, takiego jak rodopsyna lub opsyna czopkowa, w połączeniu z odpowiednim receptorem sprzężonym z białkiem G6,7,8. Liczba i różnorodność dostępnych narzędzi optogenetycznych znacząco wzrosła w ciągu ostatniej dekady9.
Celem optogenetyki jest manipulowanie obwodami neuronalnymi podczas zachowania. Optogenetyka umożliwia na przykład pomiar gwałtownych zmian behawioralnych, takich jak zmiany w zachowaniach lękowych. Narzędzia optogenetyczne są dostarczane do docelowych obszarów mózgu za pomocą wektorów wirusowych. Dzięki zastosowaniu specjalnych promotorów i enhancerów lub systemu Cre-loxP można zapewnić specyficzność typu komórek w ekspresji narzędzi optogenetycznych (Rycina 1A). Istnieje kilka genetycznie zmodyfikowanych linii myszy wykazujących ekspresję enzymu Cre-Recombinase wyłącznie w określonych typach komórek. Na przykład myszy Nex-Cre wykazują ekspresję Cre-Recombinase w neuronach piramidowych kory i hipokampa pod kontrolą promotora Nex10. Enzym ten jest zdolny do inwersji sekwencji DNA flankowanych przez miejsca loxP11. W konsekwencji sekwencja DNA podwójnie floxowanego narzędzia optogenetycznego, która jest odwrócona i flankowana przez miejsca loxP, może być transkrybowana wyłącznie przez neurony posiadające Cre-Recombinase, a nie przez inne typy neuronów12,13. W przypadku myszy Nex-Cre narzędzie optogenetyczne będzie eksprymowane wyłącznie w neuronach piramidowych. Stymulacja światłem określonych obszarów mózgu jest następnie realizowana poprzez chroniczną implantację światłowodów bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Zwierzęta mogą być następnie podłączone do odpowiedniego źródła światła i swobodnie przejawiać zachowania w niemal wszystkich rodzajach testów behawioralnych.
<img alt="Metoda optogenetyczna z iniekcją wirusową, konfiguracją światłowodową i schematem mózgu dla aktywacji neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Iniekcja i implantacja.A) System Cre-loxP dla ChR2-YFP. Podwójnie floksowane narzędzie optogenetyczne jest zapakowane w wirus adeno-zależny (AAV) w celu iniekcji do tkanki mózgowej. B) Widok strzałkowy iniekcji wirusa i implantacji optycznego interfejsu neuronalnego do/nad obszarem IL w mPFC. Iniekcja i implantacja zostały wykonane od góry. Przedstawiono wszystkie obszary zainteresowania: IL, BLA oraz DRN. C) Szczegółowy widok zaimplantowanego światłowodu, tulejki i źródła światła. D) Rozprzestrzenianie się stymulacji niebieskim i czerwonym światrem laserowym w tkance istoty szarej mózgu z włókna świetlnego 200 µm (Yizhar et al. 2011). Światło niebieskie rozprzestrzenia się maksymalnie na 0,5 mm w tkance, a światło czerwone na około 1 mm. Kodowanie kolorami: czerwony 50%, żółty 10%, zielony 5%, niebieski 1%, jeśli światło dociera do tego obszaru. E) Widok czołowy jednostronnej implantacji bezpośrednio nad lewym IL z użyciem światłowodu 200 µm. Obszar IL ma szerokość 0,25 mm w każdej półkuli i głębokość 0,2 mm. Niebieskie i czerwone obszary rozświetlenia wyznaczają granicę 5% rozprzestrzeniania się światła i zostały przeniesione z pracy Yizhar et al. w odpowiedniej skali. LoxP: locus of X-over P1; ChR2: kanałrodopsyna; YFP: żółte białko fluorescencyjne; dflox: podwójnie floksowane; IL: kora infralimbiczna; BLA: boczno-podstawowe jądro ciała migdałowatego; DRN: jądra szwu grzbietowego; PrL: obszar prelimbiczny. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Stosuje się podejścia optogenetyczne, ponieważ umożliwiają one zarówno wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną14, jak i modulację specyficzną dla danego typu komórek. Dodatkowo możliwe jest wielokrotne wykorzystanie wszczepionego urządzenia bez konieczności przeprowadzania dalszych zabiegów. Po zabiegu stereotaksyjnym, podczas którego wykonuje się wstrzyknięcie wirusa adeno-zależnego niosącego narzędzie optogenetyczne oraz implantację włókna optycznego, myszy mogą regenerować się przez dwa tygodnie. Wybrano czas rekonwalescencji wynoszący zaledwie 2 tygodnie, ponieważ jest to czas wystarczający na powrót do zdrowia po operacji oraz na ekspresję wirusa. Ponieważ po eksperymentach behawioralnych przeprowadza się immunohistochemię, należy dopilnować, aby myszy nie stały się zbyt stare w trakcie trwania badania; w przeciwnym razie jakość tkanki ulega pogorszeniu. Zwierzęta nie wykazują wyraźnych zaburzeń behawioralnych wynikających z implantacji i przejawiają typowe zachowania w klatce. Oczywiście implantacji towarzyszy znaczne uszkodzenie chirurgiczne, dlatego myszy są intensywnie monitorowane. Po operacji myszy muszą być przetrzymywane pojedynczo, ponieważ myszy w grupach mają tendencję do ranienia świeżych ran i implantów osobników współdzielących klatkę. Jednak warunki bytowe mają duży wpływ na poziom lęku u samców myszy, gdyż osobniki przetrzymywane pojedynczo wykazują niższy poziom lęku15 i ogólnie mniej objawów depresyjnych16.
Manipulacje chemiczne lub elektryczne obwodów mózgowych nie charakteryzują się tak wysoką specyficznością w odniesieniu do typów komórek jak optogenetyka oraz posiadają niższą rozdzielczość czasową i przestrzenną14,17,18. W zależności od postawionego pytania badawczego, stymulacja elektryczna lub chemiczna może oferować różne zalety. W sytuacjach, gdy konieczna jest stymulacja również przechodzących zakończeń włókien w konkretnym obszarze, najlepszą metodą jest stymulacja elektryczna. Stymulacja chemiczna jest właściwym wyborem, gdy agonistami należy aktywować receptory specyficzne dla konkretnego przekaźnika w całym obszarze. Kolejną istotną zaletą optogenetyki w porównaniu ze stymulacją chemiczną lub elektryczną jest fakt, że neurony w warunkach endogennych nie są wrażliwe na światło, co pozwala uniknąć wystąpienia efektów ubocznych19. Rzeczywiście, wysoka intensywność światła może wywoływać efekty cieplne8,20, jednak dzięki zastosowaniu odpowiednich grup kontrolnych, efekty behawioralne wynikające z manipulacji optogenetycznej mogą zostać wyeliminowane.
Badanie zachowania gryzoni, zwłaszcza w kontekście chorób psychiatrycznych, uległo znacznej poprawie dzięki zastosowaniu optogenetyki u zwierząt swobodnie poruszających się, ponieważ umożliwia ona bezpośrednią modulację pojedynczych receptorów, a także specyficznych populacji komórek21 i obwodów neuronalnych22. Możliwość pomiaru ostrych efektów takich modulacji, a także długofalowych skutków behawioralnych po określonym czasie23 lub po chronicznej stymulacji24, zapewnia dużą elastyczność projektowania eksperymentów i dostarcza bardzo szczegółowych informacji na temat obwodów mózgowych. Stymulacja światłem może być wykorzystana do modulacji neuronów zlokalizowanych w miejscu wstrzyknięcia narzędzia optogenetycznego. Gdy zarówno wstrzyknięcie, jak i implantacja dotyczą tego samego obszaru mózgu, możliwe jest celowanie w ciała komórek oraz aksony projekcyjne neuronów głównych i interneuronów w tym regionie3,6,8. Jednak światłowód może zostać zaimplantowany również w obszarze innym niż ten, do którego wstrzyknięto preparat. W takim przypadku stymulacja światłem może modulować uwalnianie przekaźników w zakończeniach aksonów w obszarach projekcyjnych wstrzykniętego regionu25,26,27.
W niniejszym badaniu optogenetyka jest wykorzystywana w połączeniu z eksperymentami do analizy zachowań związanych z lękiem. Choroby psychiatryczne związane z lękiem dotykają ponad jednej trzeciej populacji świata28,29,30 i generują wysokie obciążenia ekonomiczne31. Osoby dotknięte tymi schorzeniami cierpią z powodu uczucia pobudzenia, napięcia i niepokoju, którym towarzyszą zachowania unikowe32,33. Te przewlekle występujące negatywne emocje, koncentrujące się głównie na przyszłych zdarzeniach34, w znacznym stopniu zakłócają codzienne życie pacjentów. Powszechne metody leczenia, takie jak benzodiazepiny czy selektywne inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI), okazują się skuteczne tylko u części pacjentów. Znaczna liczba osób w ogóle nie reaguje na leczenie35, co wskazuje, że mechanizm leżący u podstaw takich chorób nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. Wiadomo, że przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) odgrywa ważną rolę w rozwoju i manifestacji lęku21,25,27,36,37,38. W szczególności nadaktywność regionu kory infralimbicznej (IL) w mPFC może być elementem zaburzeń lękowych39,40. Opisany tutaj przykładowy eksperyment może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób modulacje w regionie IL mPFC wpływają na zachowania lękowe. Ponadto może on potencjalnie wesprzeć opracowanie nowych strategii terapeutycznych w chorobach psychiatrycznych związanych z lękiem.
Do specyficznej ekspresji ChR2 w neuronach piramidowych w obrębie obszaru IL mPFC41 wykorzystuje się samce myszy Nex-Cre w wieku od 2 do 6 miesięcy. Myszy Nex-Cre mają tło genetyczne C57Bl/6 i wykazują specyficzną ekspresję enzymu rekombinazy Cre w neuronach piramidowych. Podczas zabiegu stereotaktycznego do obszaru IL wstrzykuje się podwójnie floksowany ChR2-DNA za pomocą wektorów wirusowych towarzyszących adenowirusom. Implant optyczny umieszcza się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania (Rysunek 1B), a następnie unieruchamia go za pomocą cementu stomatologicznego. Zwierzęta kontrolne otrzymują w tym samym obszarze wtrysk podwójnie floksowanego tdTomato-DNA w celu imitacji ekspresji specyficznej dla komórek.
Zwierzęta są utrzymywane w grupach do dnia operacji, a następnie w pojedynczych klatkach, aby uniknąć obrażeń spowodowanych przez inne myszy. Myszy są trzymane w szafach z indywidualnie wentylowanymi klatkami (IVC) w klatkach typu TypI-L przeznaczonych dla myszy trzymanych pojedynczo. Cykl światło-ciemność przebiega w rytmie 12:12 h, przy czym faza jasna rozpoczyna się o godzinie 10:00. Wszystkie eksperymenty behawioralne są przeprowadzane w fazie ciemnej, która odpowiada fazie aktywności gryzoni. Woda i standardowa karma w formie peletu są dostępne ad libitum. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji, co zapewnia wystarczającą ekspresję ChR2 w neuronach piramidalnych, myszy są wykorzystywane w eksperymentach behawioralnych.
Otwarte Pole (OF) to kwadratowy labirynt o wymiarach 50 cm x 50 cm z piaskowanymi ścianami o wysokości 40 cm. Podłoże jest podzielone na 16 kwadratów, z których 4 wewnętrzne stanowią centrum. Mierzone zachowania to: 1) czas spędzony w centrum, 2) liczba wejść do centrum oraz 3) całkowity dystans pokonany przez zwierzę. Podczas tego eksperymentu przeprowadzanych jest 4 prób o łącznym czasie 20 minut. W próbach 1 i 3 nie występuje stymulacja światłem, natomiast w próbach 2 i 4 wykonywana jest stymulacja o częstotliwości 20 Hz z impulsem świetlnym 5 ms i natężeniu światła 1 mW o długości fali 473 nm (Rycyna 2A). W późniejszych próbach uwzględniono habituację do obszaru testowego, a zastosowanie zwierząt kontrolnych po wstrzyknięciu pozorowanym (sham) wskazuje, w jaki sposób habituacja ta przejawia się w badaniu.
Labirynt Barnesa to eksperyment badający uczenie się i pamięć. Jest to okrągła platforma o średnicy 92 cm, w której obwodzie znajduje się 20 równomiernie rozmieszczonych otworów. 19 otworów jest zamkniętych, a pod jednym z nich znajduje się skrzynka ucieczkowa. Przez 4 kolejne dni myszy przechodzą 4 próby treningowe, aby nauczyć się lokalizacji skrzynki ucieczkowej. Piątegoth w tym dniu usuwa się skrzynkę ucieczkową i bada czas, jakiego myszy potrzebują na znalezienie właściwego otworu. Mierzone parametry behawioralne to: 1) czas do znalezienia skrzynki ucieczkowej/właściwego otworu, 2) liczba wejść do celu oraz liczba błędów oraz 3) dystans pokonany do momentu wejścia do skrzynki ucieczkowej. Stymulacja światłem w różnych grupach jest przeprowadzana albo podczas nabywania lub konsolidacji, które mają miejsce w dniach treningowych 1–4, albo podczas przypominania w dniu testowym, którym jest dzień 5 (Rycina 2D).
<img alt="Schematy testu otwartego pola, labiryntu podniesionego krzyża oraz labiryntu Barnesa szczegółowo przedstawiające sekwencje czasowe eksperymentów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Eksperymenty behawioralne z protokołami optogenetycznymi. A) Schematyczny rysunek eksperymentu w otwartym polu z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. C) Schematyczny rysunek eksperymentu w labiryncie podniesionego krzyża z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. D) Schematyczny rysunek eksperymentu w labiryncie Barnesa z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. EPM: labirynt podniesionego krzyża; OF: otwarte pole; BM: test labiryntu Barnesa. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
W przypadku stymulacji optogenetycznej natężenie i częstotliwość światła muszą być dostosowane do narzędzia optogenetycznego oraz badanego typu neuronów. Należy stosować jak najniższe natężenie światła, aby uniknąć uszkodzenia tkanki, ponieważ liczne badania wykazały możliwość wystąpienia efektów cieplnych przy dużym natężeniu światła8,20. Dla ChR2 powszechnie stosuje się stymulację o częstotliwości 20 Hz z impulsem świetlnym trwającym 5 ms2. Ze względu na wysoką światłoczułość ChR2 wystarczające jest natężenie światła 1 mW. Protokół stymulacji świetlnej polega na naprzemiennym przeprowadzaniu prób z włączonym i wyłączonym światłem, aby bezpośrednio zmierzyć zmiany w zachowaniu. Zewnętrzne warunki w pomieszczeniu podczas eksperymentów behawioralnych powinny pozostać stabilne dla całej grupy zwierząt. Ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są: hałas (należy pamiętać, że same urządzenia mogą generować dźwięki), zapach (układy behawioralne należy zawsze czyścić etanolem), natężenie światła oraz osoba przeprowadzająca badanie. Eksperymenty powinien zawsze przeprowadzać ta sama osoba. Ponadto pora dnia, w której odbywają się doświadczenia, powinna być taka sama dla wszystkich zwierząt w jednej grupie; preferowane jest kilka godzin po rozpoczęciu fazy ciemnej w pomieszczeniu dla zwierząt.
Celem niniejszego eksperymentu jest zwiększenie stosunku pobudzenia do hamowania (E/I) w obszarze IL poprzez silną aktywację pobudzających neuronów piramidowych. Wiadomo, że podwyższony stosunek E/I w tym szczególnym obszarze kory zwiększa poziom lęku u myszy40,42,43,44.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753-64</td><td>Anestasia</td></tr><tr><td>20 % Glukoza</td><td>AlleMan Pharma</td><td></td><td>Injection s.c. dla szybkiego powrotu do zdrowia</td></tr><tr><td>Labirynty behawioralne Kostium</td><td>wykonany</td><td></td><td>Zmierz niepokój</td></tr><tr><td>Bepanthen</td><td>Bayer</td><td></td><td>Maść okulistyczna</td></tr><tr><td>Betaisodona</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>Sterylant zawierający jod</td></tr><tr><td>Lornetka Betaisodona</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>Maść jodowa</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Okucia ceramiczne</td><td>Thorlabs</td><td>CFLC230-10</td><td>Implant</td></tr><tr><td>Rysownik z włókna ceramicznego</td><td>Thorlabs</td><td>CSW12.5</td><td>Cięcie włókna szklanego</td></tr><tr><td>Wirus rodopsyny kanałowej2-YFP</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 20298</td><td>Optogenetyczne narzędzie</td></tr><tr><td>Sprężone powietrze</td><td>Kontakt Chemie</td><td>Druckluft 67</td><td>Suszenie czaszki</td></tr><tr><td>Układ współrzędnych</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Współrzędne stereotaktyczne do operacji</td></tr><tr><td>Correl Draw</td><td></td><td></td><td>Graficzna wersja oprogramowania 13</td></tr><tr><td>Cryoslicer</td><td>MICROM</td><td>HM500OM</td><td>Produkcja wycinków mózgu do barwienia</td></tr><tr><td>Ethovision XT 14</td><td>Noldus</td><td></td><td>Oprogramowanie do śledzenia behawioralnego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>Exel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okucie Polerowanie krążka</td><td>Thorlabs</td><td>D50-F</td><td>Implanty polerskie okrągłe boki</td></tr><tr><td>Patchcord światłowodowy podwójny</td><td>Prizmatix</td><td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm</td><td>, które są połączone z dwoma implantami implantacji obustronnej</td></tr><tr><td>Patchcord światłowodowy pojedynczy</td><td>Prizmatix</td><td>Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm</td><td>, który jest połączony z implantem za pomocą tulei</td></tr><tr><td>Narzędzie do ściągania izolacji z włókien</td><td>Thorlabs</td><td>T06S13</td><td>Usuwanie izolacji z włókna szklanego do implantu</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>VWR European</td><td>516-0300</td><td>Pocięte na kawałki do testu karmienia z tłumieniem nowości</td></tr><tr><td>Granulki spożywcze</td><td>M&uuml; hle Dźwignie</td><td>H&ouml; veler Nagerfutter</td><td>Żywienie dla myszy</td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Aparat Harvard</td><td>GC150-10</td><td>Pipety iniekcyjne</td></tr><tr><td>Gradia direct-Flo</td><td>Henry Schein</td><td>103322</td><td>Płynny cement dentystyczny</td></tr><tr><td>Lampa grzewcza</td><td>efbe-Schott/Phillips</td><td>R95E</td><td>Zapobiegaj wychłodzeniu myszy po operacji</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Zintegrowany ze współrzędnymi System</td></tr><tr><td>Wtrysk kaniula</td><td>Braun</td><td>100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20</td><td>Wszystkie iniekcje i do wiercenia otworu w czaszce</td></tr><tr><td>Miot</td><td></td><td>T 1350</td><td>Uziemienie dla Nowości Stłumiony Test żywieniowy</td></tr><tr><td>Klatki dla myszy</td><td>Zoonlab</td><td>405 cm^2</td><td>Pojedyncza obudowa do eksperymentów</td></tr><tr><td>Optibond FL</td><td>Kerr</td><td>26684E</td><td>Przygotowanie czaszki do implantacji</td></tr><tr><td>Włókno szklane</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>Światłowód do implantu</td></tr><tr><td>Optogenetics-LED.STSI</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Optogenetyczny zestaw narzędzi do stymulacji światłem podczas eksperymentów behawioralnych</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td>Perfuzja myszy w celu usunięcia mózgu</td></tr><tr><td>Arkusz polerski 0,02 i mikro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LFCF</td><td>Implanty polerskie po stronie okrągłej</td></tr><tr><td>Arkusz polerski 1 i mikro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF1D</td><td>Implanty polerskie po okrągłej stronie</td></tr><tr><td>Arkusz polerski 30 i mikro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF30D</td><td>Implanty polerskie okrągłe boki</td></tr><tr><td>Arkusz polerski 6 i mikro; m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF6D</td><td>Implanty polerskie okrągłe boki</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Pulser</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania urządzeniami świetlnymi</td></tr><tr><td>Rimadyl-Carprofen</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Analgesia</td></tr><tr><td>Sigma Plot Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>do statystyk</td></tr><tr><td>Rękaw</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>Połączenie implantu i świetlnego</td></tr><tr><td>SodiumCloride ( NaCl)</td><td>Braun</td><td>3570410</td><td>Płukanie czaszki</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pattex Henkel</td><td></td><td>Aby naprawić włókno szklane w okuciu wirusa</td></tr><tr><td>td-Tomato</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 51503</td><td>Narzędzie optogenetyczne</td></tr><tr><td>Światło UV</td><td>KoQGHJ</td><td>bezprzewodowe, 1200 mW/cm^2</td><td>Lampa polimeryzacyjna do cementu dentystycznego</td></tr><tr><td>Xylavet-Xylazin</td><td>cp pharma</td><td></td><td>Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetyczna modulacja obwodów neuronalnych u swobodnie poruszających się myszy wpływa na ostre i długotrwałe zachowanie. Metoda ta jest w stanie wykonywać manipulacje pojedynczymi neuronami i uwalnianiem nadajnika specyficznego dla regionu, aż do całych obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i umożliwia bezpośredni pomiar wyników behawioralnych. Neurony wyrażają narzędzia optogenetyczne poprzez wstrzyknięcie wektorów wirusowych przenoszących wybrane DNA, takich jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2). Światło jest doprowadzane do określonych obszarów mózgu za pomocą przewlekłych implantów optycznych, które kończą się bezpośrednio nad obszarem docelowym. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji i prawidłowej ekspresji narzędzi, myszy mogą być wielokrotnie wykorzystywane do testów behawioralnych z optogenetyczną stymulacją interesujących neuronów.
Modulacja optogenetyczna ma wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną, którą można osiągnąć z wysoką specyficznością komórkową, w porównaniu do powszechnie stosowanych metod, takich jak stymulacja chemiczna lub elektryczna. Światło nie uszkadza tkanki neuronalnej i dlatego może być wykorzystywane do długotrwałych eksperymentów, a także do wielu eksperymentów behawioralnych na jednej myszy. Możliwości narzędzi optogenetycznych są niemal nieograniczone i umożliwiają aktywację lub wyciszenie całych neuronów, a nawet manipulowanie określonym typem receptora za pomocą światła.
Wyniki takich eksperymentów behawioralnych ze zintegrowaną stymulacją optogenetyczną bezpośrednio wizualizują zmiany w zachowaniu spowodowane manipulacją. Zachowanie tego samego zwierzęcia bez stymulacji świetlnej jako punktu odniesienia jest dobrą kontrolą dla wywołanych zmian. Pozwala to na szczegółowy przegląd typów neuronów lub systemów neuroprzekaźników zaangażowanych w określone zachowania, takie jak lęk. Plastyczność sieci neuronalnych można również bardzo szczegółowo badać poprzez długotrwałą stymulację lub obserwacje behawioralne po stymulacji optycznej. Optogenetyka pomoże oświecić sygnalizację neuronalną w kilku rodzajach chorób neurologicznych.

Celem niniejszego protokołu jest pomiar zmian w zachowaniu myszy modyfikowanych genetycznie podczas eksperymentu optogenetycznego. Manipulacja optogenetyczna jest przeprowadzana poprzez wstrzyknięcie wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom. Stymulacja światłem u swobodnie poruszających się myszy jest możliwa dzięki implantacji światłowodu bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.
Na Rysunku 4 przedstawiono wyniki eksperymentu optogenetycznego. Silna aktywacja pobudzających neuronów piramidowych w obszarze IL za pomocą ChR2 zwiększyła zachowania związane z lękiem w teście Open Field. ChR2 wstrzyknięto do obszaru IL w obrębie mPFC u myszy Nex-Cre w celu ekspresji w neuronach piramidowych (Rysunek 4A). Podczas dwóch testów lękowych: Open Field (Rysunek 4B,C) oraz testu Novelty-Suppressed Feeding (Rysunek 4F,G), ChR2 jest stymulowany niebieskim światłem, co aktywuje neurony piramidowe. W ramach kontroli inna grupa myszy otrzymała wstrzyknięcie fluoroforu tdTomato zamiast ChR2 (Rysunek 4D,G). W takim eksperymencie lęk definiuje się jako unikanie jaśniejszego obszaru centralnego. Myszy wykazują wrodzoną tendencję do unikania otwartych przestrzeni ze względu na lęk przed drapieżnikami.
W eksperymencie w otwartym polu (Open Field), przedstawionym na Rysunku 4B, myszy przeszły 4 próby po 5 minut każda. W próbach 1 i 3 nie stosowano stymulacji światłem (Off1,2), natomiast w próbach 2 i 4 przeprowadzono stymulację niebieskim światłem o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i natężeniu 1 mW (On1,2). Mapy ciepła pokazują, że w grupie eksperymentalnej czas przebywania w centrum różnił się pomiędzy próbami Off a On. Podczas stymulacji światłem myszy preferencyjnie pozostawały w strefie brzeżnej. Zwierzęta kontrolne również preferowały obrzeża, ale nie zmieniały swojego zachowania pod wpływem stymulacji światłem. Na Rysunku 4C przedstawiono główne pomiary behawioralne podczas eksperymentu w otwartym polu dla grupy eksperymentalnej. Jeśli dane przeszły test Shapiro-Wilka na normalność rozkładu, analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą niezależnego dwustronnego testu t. W przypadku braku normalności rozkładu zastosowano test sum rang Manna-Whitneya jako nieparametryczną alternatywę. W tego typu eksperymentach wybrano porównanie wewnątrzgrupową, aby zbadać, czy stymulacja światłem może bezpośrednio zmienić zachowania lękowe w czasie, niezależnie od wyjściowego poziomu lęku zwierząt w grupie eksperymentalnej i kontrolnej. Czas przebywania w centrum uległ znacznącemu skróceniu podczas obu prób stymulacji światłem, co wskazuje na zwiększony poziom lęku. Całkowity dystans nie uległ zmianie, co pokazuje, że zachowanie lokomotoryczne nie zostało zaburzone. Liczba wejść do centrum wzrosła, choć nie w sposób istotny. Na Rysunku 4D przedstawiono dane grupy kontrolnej. Zwierzęta kontrolne nie wykazały żadnych zmian behawioralnych pomiędzy próbami Off a On w żadnym z analizowanych parametrów, co dowodzi, że stymulacja światłem ani implantacja nie wywołały zaobserwowanych efektów. Podsumowując, test ten wykazuje zwiększony lęk podczas stymulacji światłem neuronów piramidalnych IL za pomocą ChR2.
Na Rysunku 5 przedstawiono dane z nieudanego eksperymentu optogenetycznego z wykorzystaniem krzyżowego labiryntu wzniesionego (Elevated-Plus Maze). Podczas eksperymentu w labiryncie, zaprezentowanego na Rysunku 5A, myszy przeszły 6 prób po 3 minuty każda. W próbach 1, 3 i 5 nie stosowano stymulacji światłem (Off1, Off2, Off3), a w próbach 2, 4 i 6 przeprowadzono stymulację światłem niebieskim o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i intensywności 1 mW (On1, On2, On3). W tych przykładowych wynikach długość protokołu optogenetycznego oraz sama konstrukcja labiryntu nie były odpowiednie dla zastosowanej linii myszy transgenicznych. Na Rysunku 5B widać, że kilka myszy ześlizgnęło się z labiryntu tylnymi łapami lub nawet z niego spadło. W takich przypadkach myszy otrzymywały drugą szansę na wykonanie próby w EPM dzień później. Jeśli spadły ponownie, były wykluczane z analizy. W sytuacjach, gdy myszy ześlizgiwały się kilkakrotnie, ale zdołały pozostać w labiryncie, dane analizowano w zwykły sposób. Niemniej jednak dane te muszą być interpretowane bardzo ostrożnie, a zwierzęta kontrolne nabierają większego znaczenia. Myszy Nex-Cre miały trudności motoryczne z utrzymaniem się na wąskich otwartych ramionach. Aby tego uniknąć, pomocne byłyby niskie ścianki o wysokości 1 cm, zapewniające pewniejszy chwyt tylnych łap na ramionach labiryntu. Zarówno mapy ciepła, jak i wykresy pokazują, że myszy doświadczalne oraz kontrolne zaczęły unikać otwartych ramion od próby 2 (On1) (Rysunek 5C-E). Czas spędzony na otwartych ramionach uległ znacznemu skróceniu w obu grupach, podobnie jak liczba wejść na otwarte ramiona. Analiza wyłącznie grupy doświadczalnej dostarczyła danych sugerujących silny efekt anksjogenny stymulacji światłem, ponieważ czas przebywania na otwartym ramieniu oraz liczba wejść na nie uległy znacznemu zmniejszeniu podczas próby On1. Jednakże po porównaniu tych danych z grupą kontrolną, która wykazała takie samo zachowanie, staje się jasne, że zaobserwowane zachowanie nie jest wywoływane przez stymulację optogenetyczną, lecz przez ogólne unikanie otwartych ramion wynikające z habituacji do labiryntu. Dane te podkreślają znaczenie odpowiedniej grupy kontrolnej w celu odróżnienia efektów behawioralnych wywołanych stymulacją optogenetyczną od możliwej adaptacji behawioralnej. Ponadto dane te rzucają światło na wagę właściwego dostosowania układu eksperymentalnego do konkretnej linii myszy i pytania badawczego.
Aby zweryfikować i wzmocnić zgromadzone dane behawioralne, po ostatnim eksperymencie pobiera się mózgi myszy w celu sprawdzenia poprawności iniekcji oraz implantacji (Rycina 6). Mózgi utrwala się w 4% paraformaldehydzie, a następnie usuwa z czaszki. Mózgi odwadnia się w 30% sacharozie przez 1-2 dni, po czym wykonuje się kriosekcje. Koronalne skrawki mózgu o grubości 40 µm są płukane i montowane na szkiełkach przedmiotowych superfrost przy użyciu medium montującego zawierającego DAPI, który barwi jądra komórkowe. Umożliwia to identyfikację obszarów docelowych w skrawkach koronalnych. Fluorescencja znacznika YFP lub samego tdTomato wskazuje miejsce iniekcji wirusa. Na Rycini 6B przedstawiono przykładowe miejsca iniekcji ChR2-YFP po lewej stronie (żółty) oraz tdTomato po prawej stronie (czerwony). Za pomocą szablonu opracowanego na podstawie atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin45 można zidentyfikować obszar IL. Na obu szkiełkach narzędzie optogenetyczne wykazuje ekspresję w obszarze IL, ale również w sąsiadujących obszarach mózgu. W celu prawidłowej interpretacji analizuje się rozchodzenie się niebieskiego światła w tkance mózgowej8 (Rycina 1D,E). Można zauważyć, że niebieskie światło dociera do obszaru DP poniżej IL z natężeniem wynoszącym mniej niż 5% początkowej wartości 1 mW na końcówce światłowodu (linia niebieska na Rycini 1D)8. Dodatkowo, ze względu na rozproszenie wsteczne, niewielka ilość światła może przedostać się w górę do obszaru PrL47. W związku z tym można stwierdzić, że obszar IL jest oświetlony najsilniej, jednak obszary sąsiadujące, takie jak DP i PrL, mogą być również lekko stymulowane. Zatem stymulacja specyficzna dla komórek IL nie jest gwarantowana i należy przeprowadzić analizę immunohistochemiczną sąsiednich obszarów, aby sprawdzić, czy aktywność komórek PrL i DP jest modulowana za pomocą światła. Na Rycini 6C pokazano kolejną ważną kontrolę: specyficzność linii myszy Nex-Cre. Dzięki barwieniu przeciwciałami przeciwko dwóm typom komórek w obszarze IL – neuronom głównym glutaminergicznym oraz interneuronom GABAergicznym – można zauważyć, że ekspresja ChR2-YFP występuje tylko w neuronach glutaminergicznych, a nie w GABAergicznych.
Podsumowując, nasze eksperymenty wykazują, że dzięki manipulacjom optogenetycznym podczas testów behawioralnych można zaobserwować zmiany w zachowaniach związanych z lękiem. Zastosowanie więcej niż jednego testu dla tego samego zachowania pozwala na wyciągnięcie wiarygodnych wniosków. Dodatkowo analiza immunohistochemiczna potwierdza uzyskane dane. Nasze eksperymenty sugerują, że specyficzna aktywacja neuronów piramidowych w korze podlimbicznej zwiększyła zachowania związane z lękiem w niektórych testach.
<img alt="Schemat eksperymentu optogenetycznego z iniekcją do mózgu myszy, wykresami analizy behawioralnej i mapami ciepła aktywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Optogenetyczna aktywacja neuronów piramidalnych IL zwiększa zachowania lękowe. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: 473 nm, 1 mW, stymulacja 20 Hz. A) Schemat miejsca iniekcji i implantacji ChR2-YFP lub tdTomato do IL. Podczas eksperymentu neurony piramidalne w obszarze IL mPFC są aktywowane przez ChR2. Przekroje mózgu w płaszczyźnie strzałkowej dostosowane do atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin, płaszczyzna strzałkowa: lateral 0,6. B) Labirynt Open Field z protokołem stymulacji światłem (20 min z 4x5 min naprzemiennych prób Off i On; po lewej) oraz mapy ciepła przykładowych myszy z iniekcją ChR2 (EXP) i tdTomato (CT) we wszystkich 4 próbach eksperymentu (po prawej). Zwierzęta EXP spędzają mniej czasu w centrum OF podczas stymulacji niebieskim światłem laserowym. W przypadku zwierząt CT czas spędzony w centrum nie różni się między próbami z wyłączonym (Off) i włączonym (On) światłem. C) Dane grupowe dla zwierząt EXP w OF, n=11. Myszy spędzają istotnie mniej czasu w centrum OF podczas stymulacji niebieskim światłem (Off1 39,49±6,9 s, On1 19,87±4,47 s, Off2 28,13±8,55 s, On2 23,42±9,32 s, Off1:On1, t-test, p = 0,033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Pokonany dystans nie uległ zmianie (Off1 2703,09±292,65 cm, On1 3113,4±491,15 cm, Off2 3331,86 ±482,62 cm, On2 3082,17±658,61 cm). Liczba wejść do centrum zmniejsza się z czasem, ale nie wykazuje istotnych różnic (Off 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) Dane grupowe dla zwierząt CT w OF, n=15. Czas spędzony przez myszy w centrum OF, pokonany dystans oraz liczba wejść do centrum nie zmieniają się między próbami z włączonym (On) i wyłączonym (Off) światłem (Czas w centrum Off1 16,73±2,65 s, On1 16,02±1,89 s, Off2 12,02±1,76 s, On2 13,04±2,58 s; Dystans Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; liczba wejść do centrum Off1 14,2±1,98, On1 13,6±2,02, Off2 10,8±1,88, On2 11,67±2,5). Myszy CT wykazują istotnie wyższy bazowy poziom lęku (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Wartości przedstawiono jako średnia±S.E.M. * oznacza istotne różnice (p≤0,05), ** oznacza istotne różnice (p≤0,01). t-test zawsze dwustronny, MWRS: test suma rang Manna-Whitneya; IL: kora infralimbiczna; BLA: jądro boczno-podstawne ciała migdałowatego; DRN: jądra szwu grzbietowego; OF: Open Field; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzęta eksperymentalne; L: światło. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One43 oraz Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat labiryntu z krzyżującymi się ramionami (EPM) oraz wykresy przedstawiające analizę behawioralną, procent ześlizgiwań i ruch zwierząt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Eksperyment EPM nie wykazał efektów behawioralnych u myszy Nex-Cre. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: 473 nm, 1 mW, stymulacja 20 Hz. A) Labirynt z krzyżującymi się ramionami (Elevated-Plus Maze) z protokołem stymulacji światłem (18 min, 6x3 min, naprzemienne próby Off i On). B) Dane grupowe uwzględniają myszy, które „ześlizgnęły się” z labiryntu, całkowite n=23. Myszy Nex-Cre miały tendencję do ześlizgiwania się tylnymi łapami z otwartego ramienia, niezależnie od grupy eksperymentalnej (lewo). W późniejszych analizach uwzględniono tylko myszy, które pozostały w labiryncie przez wszystkie 6 prób. Ześlizgnięcia w pierwszej fazie Off1 są przyczyną późniejszego unikania otwartych ramion (Off1 EXP 1,63±0,6, CT 2,2±0,79, Off2+3 EXP 0,125±0,125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0,625±0,26, CT 0,1±0,1). Wykres kołowy (prawo) pokazuje, że 42,42% myszy spadło z labiryntu w ciągu 18 min. Tylko 57,57% ukończyło eksperyment. C) Mapy ciepła dla przykładowych myszy EXP i CT we wszystkich 6 próbach eksperymentu. Obie grupy wykazują skrócenie czasu przebywania w otwartych ramionach po próbie Off1. D) Dane grupowe dla zwierząt EXP w EPM, n=12. Czas spędzony w otwartych ramionach uległ znacznemu skróceniu podczas dwóch pierwszych prób, a następnie malał stale (Off1 73,91±12,22 s, On1 36,15±14,65 s, Off2 15,61±6,23 s, On2 19,49±7,51 s, Off3 9,36±4,44 s, On3 7,96±3,47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Dystans pokonany nie uległ zmianie (Off1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Liczba wejść do otwartych ramion zmniejsza się znacząco od Off1 do On1, a następnie pozostaje stała (Off1 8,08±1,08, On1 3,33±0,76, Off2 2,16±0,69, On2 2,91±1,09, Off3 1,73±0,75, On3 1,73±0,66. Off1:On1, t-test, p=0,002, **). Czas spędzony w centrum EPM maleje w kolejnych próbach, ale nie wykazuje istotnych różnic między próbami Off a On (Off1 41,71±5,34 s, On1 31,2±4,59 s, Off2 19,8±3,44 s, On2 24,49±3,38 s, Off3 20,37±4,77 s, On3 18,85±4,07 s). E) Dane grupowe dla zwierząt CT w EPM, n=11. Dane CT wykazują te same istotne spadki co dane EXP, co wskazuje, że eksperyment nie przebiegł prawidłowo (Czas w otwartych ramionach Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18,01±11,61 s, On2 16,41±9,61 s, Off3 11,36±4,01 s, On3 5,43±2,07 s. Off1:On1, MWRS, p=0,009, **; Dystans Off1 705,11±88,36 cm, On1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Wejścia do otwartych ramion Off1 7,09±1, On1 3,72±1,17, Off2 1,45±0,47, On2 1,36±0,58, Off3 0,91±0,43, Off3 1,64±0,59. Off1:On1, MWRS, p=0,01, *; Czas spędzony w centrum Off1 35,89 s, On1 29,25±3,96 s, Off2 22,17±3,58 s, On2 15,9±2,57 s, Off3 13,86±4,2 s, On3 16,89±5,75 s). Wartości przedstawiono jako średnia ± S.E.M. * oznacza istotne różnice (p≤0,05), ** oznacza istotne różnice (p≤0,01). T-test jest zawsze dwustronny, MWRS: test sum rang Mann-Whitneya; EPM: labirynt z krzyżującymi się ramionami; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzęta eksperymentalne; OA: otwarte ramiona. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One43 oraz Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy mózgu myszy i mikroskopia; barwienia DAPI; obszary PrL, IL, DP; analiza obrazowania neuronowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Strona iniekcji ChR2 i tdTomato w obszarze IL oraz swoistość Nex-Cre. A) Schematyczny rysunek miejsca implantacji na koronarnych przekrojach mózgu przy AP + 1.66 mm, mL 0.3 mm, DV -1.8 mm, z jednostronną iniekcją i implantacją (adaptacja z atlasu mózgu myszy, Paxinos i Franklin, Bregma +1.54 mm). B) Przykładowe miejsca iniekcji ChR2-YFP (lewo, żółty) i tdTomato (prawo, czerwony) nałożone na jądra komórkowe barwione DAPI (niebieski) u myszy Nex-Cre. Pasek skali 1 mm. Wstawki przedstawiają duże powiększenie obszaru IL. Pasek skali 150 µm. Białe ramki wskazują położenie wstawek. C) Górny rząd: obrazy konfokalne lewego obszaru IL myszy Nex-Cre barwionej CamKII jako markerem neuronów glutaminergicznych (niebieski) oraz ChR2-YFP (żółty) lub Gad67 jako markerem neuronów GABAergicznych (zielony). Dolny rząd: kolokalizacja ChR2-YFP (żółty) z CamKII (lewo, niebieski), ale nie z Gad67 (prawo, zielony), co wykazuje swoistość myszy Nex-Cre względem neuronów glutaminergicznych. Pasek skali 50 µm. PrL: kora prelimbiczna; IL: kora infralimbiczna; DP: grzbietowa kora peduńczykowa. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One43 oraz Berg 201948. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonymi populacjami neuronów lub regionami mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne. Ostatecznym celem optogenetyki jest modulacja obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u zachowującego się zwierzęcia.W przeciwieństwie do manipulacji farmakologicznych lub elektrycznych, optogenetyka pozwala na precyzyjną kontrolę określonych typów komórek w obwodach neuronalnych. Optogenetyka to doskonały sposób na celowanie w określone typy komórek w specjalnie zdefiniowanym regionie podczas zachowania oraz na badanie bezpośredniego wpływu zmian w takich mikroukładach. Przedstawimy teraz przewodnik krok po kroku, jak przygotować oraz posadzić i przeprowadzić optogenetykę u swobodnie poruszających się myszy.W celu przygotowania implantu optycznego umieść ceramiczną skuwkę płaską stroną do góry w imadle stołowym. Usuń kod z włókna szklanego o średnicy 200 mikrometrów za pomocą narzędzia do zdejmowania izolacji z włókien i wytnij od dwóch do trzech centymetrów niekawałków za pomocą rysika z włókna ceramicznego. Umieść kawałek włókna szklanego w ceramicznej skuwce, a następnie umieść kroplę superglue na płaskiej stronie za pomocą kaniuli iniekcyjnej.Po okrągłej stronie ceramicznej skuwki przytnij włókno szklane tak krótko, jak to możliwe i umieść preimplant w krążku polerskim do skuwki, aby wypolerować okrągłą stronę na czterech różnych papierach wydawniczych. Następnie przyciąć włókno szklane po płaskiej stronie ceramicznej skuwki na długość potrzebną do implantacji. Użyj atlasu mózgu myszy, aby obliczyć długość implantu.Implant musi kończyć się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Przed implantacją stosuje się znieczulenie. Precyzyjna i estetyczna technika została opisana w rękopisie.Gdy mysz osiągnie głęboki stan znieczulenia, umieść ją na płycie grzewczej i zamocuj głowę w ramce stereotaktycznej. Zamocuj nos i zęby z przodu, a uszy po obu stronach. Nałóż algezję z cuprofenem podskórnie na grzbiet myszy i nałóż nieprzezroczystą maść na oczy na oba oczy, aby chronić je przed wysuszeniem.Zwilż włosy na skórze głowy mokrym ręcznikiem papierowym, a następnie odetnij je nożyczkami. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie luźne włosy mokrym ręcznikiem papierowym. Użyj bawełnianego patyczka, aby zdezynfekować skórę głowy nalewką zawierającą jod.Podnieś skórę głowy wokół obszaru zainteresowania pęsetą i odetnij jeden centymetr wzdłuż linii środkowej. Aby zszorstkować czaszkę do implantacji, nałóż niewielką ilość kwasu fosforowego na bliznę i pozwól mu działać przez 15 sekund. Usuń cały kwas wacikiem i dwukrotnie spłucz bliznę chlorkiem sodu.Aby zapewnić prawidłowe wstrzyknięcie, należy obliczyć współczynnik F dla poszczególnych współrzędnych. Umieść szklaną kangurkę w ramce stereoktatycznej i umieść ją bezpośrednio nad bregmą. Teraz wyzeruj układ współrzędnych i przesuń szklaną kaniulę do Lambda.Oblicz współczynnik F za pomocą następującego wzoru. Bregma minus Lambda podzielona przez 4,2 równa się współczynnikowi F. Dokładne współrzędne są bardzo ważne w przypadku iniekcji i implantacji, ponieważ w przeciwnym razie, jeśli stymulowana jest niewłaściwa struktura, efekty behawioralne są niespecyficzne.Wszystkie myszy mają minimalne odchylenia w wielkości czaszki, dlatego współczynnik jest absolutnie obowiązkowy. Użyj dostosowanych współrzędnych, aby znaleźć lokalizację na bliźnie bezpośrednio nad obiektem zainteresowania. Użyj kaniuli iniekcyjnej, aby wywiercić otwór w czaszce, obracając kaniulę w miejscu.Aby pobrać roztwór wirusa do szklanej kaniuli połączonej ze strzykawką, umieść kroplę chlorku sodu na czaszce i kawałek pirofenu na wierzchu. Umieść kroplę dwóch mikrolitrów roztworu wirusa na pirofenie i opuść końcówkę szklanej kaniuli do wirusa. Zastosuj podciśnienie i poczekaj, aż roztwór wirusa zostanie wchłonięty przez kaniulę.Zero do tej współrzędnej, gdy końcówka wirusa z kaniulą znajduje się na poziomie czaszki i powoli opuść ją do odwiertu do najniższej pozycji po stronie iniekcji. Zastosować niewielką ilość nadciśnienia za pomocą strzykawki, aż łąkotka zostanie obniżona. Pozwól wirusowi rozprzestrzeniać się przez dwie do trzech minut, zanim przesuniesz szklaną kaniulę w górę do następnej pozycji.Szklaną kaniulę należy wyjmować bardzo powoli i wyrzucić ją po ostatnim wstrzyknięciu. Teraz przygotuj czaszkę do implantacji. Osusz czaszkę sprężonym powietrzem, nałóż podkład za pomocą odpowiedniego patyczka i pozostaw do wyschnięcia na 15 sekund.Nałóż wiązanie tym samym patyczkiem i utwardź go przez 20 sekund światłem UV. Umieść implant w odpowiednim uchwycie i umieść końcówkę włókna szklanego bezpośrednio nad odwiertem i ostrożnie opuść. Przestań opuszczać implant, gdy pozostała zastawka superglue dotknie czaszki.Implantacja światłowodów może być również wykonana dla struktur obustronnych, takich jak hipokamp. Umożliwia to lekką stymulację w obu półkulach jednocześnie lub pozwala na stymulację dwóch różnych struktur. Możliwe jest również wstrzyknięcie wirusa w inne miejsce niż implant światłowodowy.Jeśli iniekcja i implantacja są wykonywane w różnych obszarach, wywierć wszystkie niezbędne otwory po nałożeniu kwasu fosforowego, ale przed przyleganiem dwóch składników. Sprawdź ponownie, czy czaszka jest nadal całkowicie sucha, a następnie nałóż płynny cement dentystyczny wokół implantu i w okolicy, a następnie utwardź przez 20 sekund światłem UV Nałóż jeszcze dwa mniejsze cementy w całkowicie wolnym od futra i wysuszonym obszarze czaszki. Utwardź każdą warstwę światłem UV.Na zakończenie zabiegu nałóż namaszczenie jodem na całą ranę. Zwolnij mocowanie nosa i ucha, umieść mysz w nowej klatce i umieść ją pod lampą grzewczą, aby uniknąć utraty ciepła ciała. Sprawdzaj jego stan zdrowia co najmniej raz dziennie, a po operacji i algezji po trzech dniach, jeśli to konieczne, pojawi się po operacji.Po dwóch tygodniach rekonwalescencji myszy można wykorzystać do eksperymentów behawioralnych. Otwórz oprogramowanie Pulser i wybierz port COM USB, do którego podłączone jest źródło światła. Wybierz trzeci tryb pracy, aby umożliwić zewnętrznemu oprogramowaniu sterowanie źródłem światła.Wybierz odpowiednią regulację dla stymulacji 20 Hz z pięciomilisekundowym impulsem świetlnym. Aby zlokalizować podział do komunikacji z pulserem, naciśnij sekwencję startową. Ten stan będzie obowiązywał do momentu zakończenia eksperymentów.Teraz utwórz nowy eksperyment w EthoVision XT, przejdź do pliku, wybierz nowy z szablonu i wybierz zastosuj predefiniowany szablon. Wybierz śledzenie na żywo i wybierz kamerę ze źródłem i potwierdź podłączoną kamerę Puslar Gen-Eye. Wybierz mysz jako zwierzę, które ma zostać nagrane.Wybierz szablon areny, pole otwarte kwadrat i szablon strefy środek, obramowanie, narożniki. Potwierdź jeden obiekt, który ma być śledzony i wybierz punkt środkowy, punkt nosowy i podstawę ogona. Upewnij się, że kolor zwierzęcia w porównaniu z tłem jest ciemniejszy i zalecana częstotliwość próbkowania, aby zakończyć krok.Nazwij eksperyment odpowiednim i wybierz lokalizację, którą chcesz zapisać. Dopóki nie znajdziesz ustawień areny, kamera automatycznie otworzy obraz tła. Dostosuj predefiniowane strefy do prawdziwej areny za pomocą strzałki i dwóch symboli po jej prawej stronie.Jeśli niektóre strefy są niepotrzebne, usuń je. Naciśnij skalę rysowania, aby skalibrować i umieścić linię od jednego rogu labiryntu do drugiego. Wprowadź długość rzeczywistej odległości w centymetrach.Powtórz to dla drugiej osi. Aby zdefiniować ustawienia kontroli próbnej, przygotuj główną regułę, dostosowując czas warunku do 20 minut. Warunkiem dla Star Trek powinno być, gdy obiekt znajduje się na arenie przez dwie sekundy, automatyczny status śledzenia, gdy mysz znajduje się na arenie.Aby utworzyć regułę podrzędną dla stymulacji światłem, przejdź do struktur, więcej i wybierz regułę podrzędną. Umieść go poniżej głównej reguły i rozłóż dwa pudełka. Przejdź do warunków, czasu i nadaj mu nazwę, taką jak światło na jednym, dostosuj warunek zostanie spełniony po pięciu minutach.Umieść pole bezpośrednio za polem początku reguły podrzędnej. Przejdź do akcji niestandardowego sprzętu i nazwij go światłem na jednym. Wybierz akcję, która ma zostać wykonana jako:Umieszczę jeden wysoki.Umieść pudełko bezpośrednio za polem warunku. Powtórz kroki, aby zaprogramować wyłączanie światła na włączone światło. Teraz przejdź do struktur, odwołania do reguły podrzędnej i sprawdź, czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej.Wybierz warunki początkowe jako bez opóźnienia i warunki początkowe jako wykonane raz na warunek początkowy. Umieść pole referencyjne między dodatkowymi księgami pierwszej i dwiema księgami warunków głównej reguły. Teraz zdefiniuj ustawienia wykrywania, aby pokazać systemowi, co powinien śledzić.Umieść mile testowe na arenie i wybierz automatyczną konfigurację. Wybierz gryzonia jako typ zwierzęcia i użyj kursora myszy, aby narysować ramkę wokół myszy na arenie. Potwierdź wyniki pytania o opiekę za pomocą tak.W przypadku eksperymentu na otwartym polu przyprowadź eksperymentalną mysz do pokoju zachowań tuż przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni poziom lęku. Połącz mysz ze szczeliną źródła światła, delikatnie dociskając ją do siatki klatki. Umieść go w klatce ze świeżą ściółką na 10 minut, aby zaaklimatyzował się do świetlnego.Rozpocznij akwizycję, naciskając przycisk stop i przejdź do wizji XT. Przenieś mysz z czekającej klatki do lewego górnego rogu otwartego pola. Opuść pole widzenia myszy podczas eksperymentu i zachowaj spokój. Po 20 minutach, gdy eksperyment zostanie zakończony, wyjmij mysz z labiryntu, odłącz świetlny i włóż go z powrotem do własnej klatki.Dzięki wizualizacji kontrolnej można bezpośrednio zobaczyć różnice w czasie środkowym między światłem wyłączonym a światłem na twarzach. Mysz spędza mniej czasu w środku, gdy światło jest włączone. W przypadku eksperymentu z labiryntem Barnesa przyprowadź wszystkie myszy eksperymentalne do pokoju zachowań na około godzinę przed eksperymentem.Przygotuj labirynt Barnesa, zamykając wszystkie otwory z wyjątkiem jednego, a teraz umieszczono w nim skrzynkę ewakuacyjną. Podłącz jedną mysz do źródła światła przy obu implantach i umieść ją bezpośrednio w środku labiryntu Barnesa. Naciśnij start i musisz odwiedzić następny T i wyjąć pudełko kartonowe.Przygotuj się na ręczne zatrzymanie wersji próbnej na wypadek, gdyby oprogramowanie nie rozpoznało całego przejścia. Wyjmij mysz z labiryntu i usuń połączenie z świetlnym. Podczas wykonywania, uczenia się i zapamiętywania badany jest nie tylko natychmiastowy efekt manipulacji, ale także długoterminowy efekt manipulacji podczas nabywania, utrwalania lub odzyskiwania.W celu analizy danych należy znaleźć leczony lub kontrolowany stan leczenia, przejść do zagnieżdżania i wybrać stan kontroli próby. Wybierz interwał stanu od akcji elementu Star Trek do akcji żywiołu lampka włącza się jeden. Umieść skrzynkę lęgową między obróbką skrzynki filtra a odpowiednią skrzynką wyników.Ten zdefiniowany interwał ma wartość jeden. Powtórz kroki dla interwałów na jednym z dwóch i na dwóch, a także dla grupy kontrolnej. Zdefiniuj również parametry do analizy w profilu analizy.Wybierz zmienną zależną w strefie i wybierz środek strefy, punkt ciała, punkt środkowy i przejdź do statystyk próby. Wybierz częstotliwość, łączny czas trwania i pozwól tam, aby zobaczyć pierwszą. Dodaj również ruch odległości jako zmienną.Dzięki temu profilowi dostępne są dane dotyczące czasu spędzonego w centrum, wpisów w środku i ruchu na odległość. Aby wyodrębnić dane z każdego podziału, przejdź do wyników i wybierz statystyki i wykresy, naciśnij oblicz, aby zobaczyć analizowane dane. Naciśnij przycisk eksportuj dane i wybierz statystyki badania oraz lokalizację do zapisania.Wyeksportowane dane są zapisywane jako plik excel i z indywidualnymi wartościami dla każdej myszy. Dodatkowo przejdź do wizualizacji mapy cieplnej i naciśnij wykreśl mapy cieplne, wybierz próby po prawej stronie, aby zobaczyć indywidualne mapy cieplne dla każdej myszy i próby. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wyeksportuj mapy ciepła jako obrazy.Później otwórz plik Excela na komputerze i oblicz średnią i standardową wartość euro SCM dla wszystkich czterech prób i każdej mierzonej grupy kondycjonowania. Aby wygenerować wykresy i wykres Sigma, skopiuj średnie i SCM w odpowiedniej kolejności z dodatkowego pliku do wykresu Sigma. Wiersze muszą zawierać dane dla wyłączonego jednego, na jeden, a kolumny zawierają herce próbne, średnie i SCM.Zaznacz wszystkie trzy kolumny i przejdź do tworzenia wykresów. Zaznacz pole paska i wybierz niezgrupowane pole ze strzałką. Oznacz cały wykres, przejdź do strony głównej, wybierz pole wykresu i naciśnij eksport.Wybierz folder docelowy i wybierz meta file jako format. Aby obliczyć statystyki dla uzyskanych danych, skopiuj dane z Xcel w prawo jeden na jednego i tak dalej, i tak dalej, oraz do pojedynczych kolumn wykresu Sigma. Zaznacz kolumny, które chcesz porównać i przejdź do analizy, wybierz T test i naciśnij uruchom.Na koniec można pokazać dane behawioralne z podziałem na odpuszczone i próbne z dodatkową specjalizacją mapy cieplnej. W eksperymencie na otwartym polu, podczas stymulacji świetlnej rodopsyny kanałowej2 i neuronów piramidowych, czas trwania centrum jest skrócony, co wskazuje na zwiększony poziom lęku. Za pomocą immunohistochemii można określić miejsce wstrzyknięcia i ekspresję wirusa, a także zwalidować swoistość na specjalnej linii myszy zależnej od Cre.Można wyraźnie zobaczyć, że stymulacja światłem rodopsyny kanałowej2 poprawia neurony umysłowe tego specyficznego regionu kory, zwiększa poziom lęku w porównaniu z lękiem wyjściowym przed tą stymulacją. Ten natychmiastowy wpływ manipulacji na zachowanie jest powodem, dla którego optogenetyka jest dziś używana do tak wielu pytań badawczych dotyczących zachowania. Procedura ta może być stosowana do modulacji optogenetycznej dowolnego pożądanego typu komórki lub obwodów neuronalnych w mózgu myszy.Łącząc tę procedurę z odpowiednimi testami behawioralnymi do twoich badań, można uzyskać głębszy wgląd w obwody neuronalne zaangażowane w zachowania i choroby będące przedmiotem zainteresowania.

optogenetic-manipulation-neuronal-activity-to-modulate-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w...

Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Ten film demonstruje protokół modulacji oscylacji theta w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z światłoczułymi kanałami jonowymi w neuronach przegrody przyśrodkowej GABA-ergiczne. Dostarczając impulsy świetlne do hipokampa, protokół ma na celu synchronizację aktywności neuronalnej i generowanie oscylacji theta, które są rejestrowane jako lokalne potencjały pola.

Selektywna manipulacja oscylacjami theta w modelu mysim

Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Opisujemy użycie optogenetyki i zapisów elektrofizjologicznych do selektywnych manipulacji oscylacjami theta hipokampa (5-10 Hz) u zachowujących się myszy. Skuteczność porywania rytmu jest monitorowana za pomocą lokalnego potencjału pola. Połączenie inhibicji opto- i farmakogenetycznej rozwiązuje eferentny odczyt synchronizacji hipokampa.

Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Tutaj prezentujemy dwa łatwe do naśladowania protokoły krok po kroku dla paradygmatów preferencji miejsca z wykorzystaniem optogenetyki u myszy. Korzystając z tych dwóch różnych konfiguracji, zachowania związane z preferencjami i unikaniem mogą być solidnie oceniane w ramach tego samego aparatu z wysoką selektywnością przestrzenną i czasową oraz w prosty sposób.

Dwa różne paradygmaty preferencji miejsca w czasie rzeczywistym wykorzystujące optogenetykę w brzusznym obszarze nakrywki myszy

Obecny protokół opisuje, jak korzystać z bezprzewodowej optogenetyki w połączeniu z szybką wideografią w jednym zadaniu typu "sięgnij do uchwytu" w celu scharakteryzowania obwodów neuronowych zaangażowanych w realizację umiejętnego zachowania motorycznego u swobodnie poruszających się myszy.

In vivo (in vivo) Bezprzewodowa kontrola optogenetyczna wykwalifikowanych zachowań motorycznych

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów w swobodnie poruszających się myszach. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Przeglądaj więcej filmów