Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonymi populacjami neuronów lub regionami mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne. Ostatecznym celem optogenetyki jest modulacja obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u zachowującego się zwierzęcia.

W przeciwieństwie do manipulacji farmakologicznych lub elektrycznych, optogenetyka pozwala na precyzyjną kontrolę określonych typów komórek w obwodach neuronalnych. Optogenetyka to doskonały sposób na celowanie w określone typy komórek w specjalnie zdefiniowanym regionie podczas zachowania oraz na badanie bezpośredniego wpływu zmian w takich mikroukładach. Przedstawimy teraz przewodnik krok po kroku, jak przygotować oraz posadzić i przeprowadzić optogenetykę u swobodnie poruszających się myszy.

W celu przygotowania implantu optycznego umieść ceramiczną skuwkę płaską stroną do góry w imadle stołowym. Usuń kod z włókna szklanego o średnicy 200 mikrometrów za pomocą narzędzia do zdejmowania izolacji z włókien i wytnij od dwóch do trzech centymetrów niekawałków za pomocą rysika z włókna ceramicznego. Umieść kawałek włókna szklanego w ceramicznej skuwce, a następnie umieść kroplę superglue na płaskiej stronie za pomocą kaniuli iniekcyjnej.

Po okrągłej stronie ceramicznej skuwki przytnij włókno szklane tak krótko, jak to możliwe i umieść preimplant w krążku polerskim do skuwki, aby wypolerować okrągłą stronę na czterech różnych papierach wydawniczych. Następnie przyciąć włókno szklane po płaskiej stronie ceramicznej skuwki na długość potrzebną do implantacji. Użyj atlasu mózgu myszy, aby obliczyć długość implantu.

Implant musi kończyć się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Przed implantacją stosuje się znieczulenie. Precyzyjna i estetyczna technika została opisana w rękopisie.

Gdy mysz osiągnie głęboki stan znieczulenia, umieść ją na płycie grzewczej i zamocuj głowę w ramce stereotaktycznej. Zamocuj nos i zęby z przodu, a uszy po obu stronach. Nałóż algezję z cuprofenem podskórnie na grzbiet myszy i nałóż nieprzezroczystą maść na oczy na oba oczy, aby chronić je przed wysuszeniem.

Zwilż włosy na skórze głowy mokrym ręcznikiem papierowym, a następnie odetnij je nożyczkami. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie luźne włosy mokrym ręcznikiem papierowym. Użyj bawełnianego patyczka, aby zdezynfekować skórę głowy nalewką zawierającą jod.

Podnieś skórę głowy wokół obszaru zainteresowania pęsetą i odetnij jeden centymetr wzdłuż linii środkowej. Aby zszorstkować czaszkę do implantacji, nałóż niewielką ilość kwasu fosforowego na bliznę i pozwól mu działać przez 15 sekund. Usuń cały kwas wacikiem i dwukrotnie spłucz bliznę chlorkiem sodu.

Aby zapewnić prawidłowe wstrzyknięcie, należy obliczyć współczynnik F dla poszczególnych współrzędnych. Umieść szklaną kangurkę w ramce stereoktatycznej i umieść ją bezpośrednio nad bregmą. Teraz wyzeruj układ współrzędnych i przesuń szklaną kaniulę do Lambda.

Oblicz współczynnik F za pomocą następującego wzoru. Bregma minus Lambda podzielona przez 4,2 równa się współczynnikowi F. Dokładne współrzędne są bardzo ważne w przypadku iniekcji i implantacji, ponieważ w przeciwnym razie, jeśli stymulowana jest niewłaściwa struktura, efekty behawioralne są niespecyficzne.

Wszystkie myszy mają minimalne odchylenia w wielkości czaszki, dlatego współczynnik jest absolutnie obowiązkowy. Użyj dostosowanych współrzędnych, aby znaleźć lokalizację na bliźnie bezpośrednio nad obiektem zainteresowania. Użyj kaniuli iniekcyjnej, aby wywiercić otwór w czaszce, obracając kaniulę w miejscu.

Aby pobrać roztwór wirusa do szklanej kaniuli połączonej ze strzykawką, umieść kroplę chlorku sodu na czaszce i kawałek pirofenu na wierzchu. Umieść kroplę dwóch mikrolitrów roztworu wirusa na pirofenie i opuść końcówkę szklanej kaniuli do wirusa. Zastosuj podciśnienie i poczekaj, aż roztwór wirusa zostanie wchłonięty przez kaniulę.

Zero do tej współrzędnej, gdy końcówka wirusa z kaniulą znajduje się na poziomie czaszki i powoli opuść ją do odwiertu do najniższej pozycji po stronie iniekcji. Zastosować niewielką ilość nadciśnienia za pomocą strzykawki, aż łąkotka zostanie obniżona. Pozwól wirusowi rozprzestrzeniać się przez dwie do trzech minut, zanim przesuniesz szklaną kaniulę w górę do następnej pozycji.

Szklaną kaniulę należy wyjmować bardzo powoli i wyrzucić ją po ostatnim wstrzyknięciu. Teraz przygotuj czaszkę do implantacji. Osusz czaszkę sprężonym powietrzem, nałóż podkład za pomocą odpowiedniego patyczka i pozostaw do wyschnięcia na 15 sekund.

Nałóż wiązanie tym samym patyczkiem i utwardź go przez 20 sekund światłem UV. Umieść implant w odpowiednim uchwycie i umieść końcówkę włókna szklanego bezpośrednio nad odwiertem i ostrożnie opuść. Przestań opuszczać implant, gdy pozostała zastawka superglue dotknie czaszki.

Implantacja światłowodów może być również wykonana dla struktur obustronnych, takich jak hipokamp. Umożliwia to lekką stymulację w obu półkulach jednocześnie lub pozwala na stymulację dwóch różnych struktur. Możliwe jest również wstrzyknięcie wirusa w inne miejsce niż implant światłowodowy.

Jeśli iniekcja i implantacja są wykonywane w różnych obszarach, wywierć wszystkie niezbędne otwory po nałożeniu kwasu fosforowego, ale przed przyleganiem dwóch składników. Sprawdź ponownie, czy czaszka jest nadal całkowicie sucha, a następnie nałóż płynny cement dentystyczny wokół implantu i w okolicy, a następnie utwardź przez 20 sekund światłem UV Nałóż jeszcze dwa mniejsze cementy w całkowicie wolnym od futra i wysuszonym obszarze czaszki. Utwardź każdą warstwę światłem UV.

Na zakończenie zabiegu nałóż namaszczenie jodem na całą ranę. Zwolnij mocowanie nosa i ucha, umieść mysz w nowej klatce i umieść ją pod lampą grzewczą, aby uniknąć utraty ciepła ciała. Sprawdzaj jego stan zdrowia co najmniej raz dziennie, a po operacji i algezji po trzech dniach, jeśli to konieczne, pojawi się po operacji

Po dwóch tygodniach rekonwalescencji myszy można wykorzystać do eksperymentów behawioralnych. Otwórz oprogramowanie Pulser i wybierz port COM USB, do którego podłączone jest źródło światła. Wybierz trzeci tryb pracy, aby umożliwić zewnętrznemu oprogramowaniu sterowanie źródłem światła.

Wybierz odpowiednią regulację dla stymulacji 20 Hz z pięciomilisekundowym impulsem świetlnym. Aby zlokalizować podział do komunikacji z pulserem, naciśnij sekwencję startową. Ten stan będzie obowiązywał do momentu zakończenia eksperymentów.

Teraz utwórz nowy eksperyment w EthoVision XT, przejdź do pliku, wybierz nowy z szablonu i wybierz zastosuj predefiniowany szablon. Wybierz śledzenie na żywo i wybierz kamerę ze źródłem i potwierdź podłączoną kamerę Puslar Gen-Eye. Wybierz mysz jako zwierzę, które ma zostać nagrane.

Wybierz szablon areny, pole otwarte kwadrat i szablon strefy środek, obramowanie, narożniki. Potwierdź jeden obiekt, który ma być śledzony i wybierz punkt środkowy, punkt nosowy i podstawę ogona. Upewnij się, że kolor zwierzęcia w porównaniu z tłem jest ciemniejszy i zalecana częstotliwość próbkowania, aby zakończyć krok.

Nazwij eksperyment odpowiednim i wybierz lokalizację, którą chcesz zapisać. Dopóki nie znajdziesz ustawień areny, kamera automatycznie otworzy obraz tła. Dostosuj predefiniowane strefy do prawdziwej areny za pomocą strzałki i dwóch symboli po jej prawej stronie.

Jeśli niektóre strefy są niepotrzebne, usuń je. Naciśnij skalę rysowania, aby skalibrować i umieścić linię od jednego rogu labiryntu do drugiego. Wprowadź długość rzeczywistej odległości w centymetrach.

Powtórz to dla drugiej osi. Aby zdefiniować ustawienia kontroli próbnej, przygotuj główną regułę, dostosowując czas warunku do 20 minut. Warunkiem dla Star Trek powinno być, gdy obiekt znajduje się na arenie przez dwie sekundy, automatyczny status śledzenia, gdy mysz znajduje się na arenie.

Aby utworzyć regułę podrzędną dla stymulacji światłem, przejdź do struktur, więcej i wybierz regułę podrzędną. Umieść go poniżej głównej reguły i rozłóż dwa pudełka. Przejdź do warunków, czasu i nadaj mu nazwę, taką jak światło na jednym, dostosuj warunek zostanie spełniony po pięciu minutach.

Umieść pole bezpośrednio za polem początku reguły podrzędnej. Przejdź do akcji niestandardowego sprzętu i nazwij go światłem na jednym. Wybierz akcję, która ma zostać wykonana jako:Umieszczę jeden wysoki.

Umieść pudełko bezpośrednio za polem warunku. Powtórz kroki, aby zaprogramować wyłączanie światła na włączone światło. Teraz przejdź do struktur, odwołania do reguły podrzędnej i sprawdź, czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej.

Wybierz warunki początkowe jako bez opóźnienia i warunki początkowe jako wykonane raz na warunek początkowy. Umieść pole referencyjne między dodatkowymi księgami pierwszej i dwiema księgami warunków głównej reguły. Teraz zdefiniuj ustawienia wykrywania, aby pokazać systemowi, co powinien śledzić.

Umieść mile testowe na arenie i wybierz automatyczną konfigurację. Wybierz gryzonia jako typ zwierzęcia i użyj kursora myszy, aby narysować ramkę wokół myszy na arenie. Potwierdź wyniki pytania o opiekę za pomocą tak.

W przypadku eksperymentu na otwartym polu przyprowadź eksperymentalną mysz do pokoju zachowań tuż przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni poziom lęku. Połącz mysz ze szczeliną źródła światła, delikatnie dociskając ją do siatki klatki. Umieść go w klatce ze świeżą ściółką na 10 minut, aby zaaklimatyzował się do świetlnego.

Rozpocznij akwizycję, naciskając przycisk stop i przejdź do wizji XT. Przenieś mysz z czekającej klatki do lewego górnego rogu otwartego pola. Opuść pole widzenia myszy podczas eksperymentu i zachowaj spokój. Po 20 minutach, gdy eksperyment zostanie zakończony, wyjmij mysz z labiryntu, odłącz świetlny i włóż go z powrotem do własnej klatki.

Dzięki wizualizacji kontrolnej można bezpośrednio zobaczyć różnice w czasie środkowym między światłem wyłączonym a światłem na twarzach. Mysz spędza mniej czasu w środku, gdy światło jest włączone. W przypadku eksperymentu z labiryntem Barnesa przyprowadź wszystkie myszy eksperymentalne do pokoju zachowań na około godzinę przed eksperymentem.

Przygotuj labirynt Barnesa, zamykając wszystkie otwory z wyjątkiem jednego, a teraz umieszczono w nim skrzynkę ewakuacyjną. Podłącz jedną mysz do źródła światła przy obu implantach i umieść ją bezpośrednio w środku labiryntu Barnesa. Naciśnij start i musisz odwiedzić następny T i wyjąć pudełko kartonowe.

Przygotuj się na ręczne zatrzymanie wersji próbnej na wypadek, gdyby oprogramowanie nie rozpoznało całego przejścia. Wyjmij mysz z labiryntu i usuń połączenie z świetlnym. Podczas wykonywania, uczenia się i zapamiętywania badany jest nie tylko natychmiastowy efekt manipulacji, ale także długoterminowy efekt manipulacji podczas nabywania, utrwalania lub odzyskiwania.

W celu analizy danych należy znaleźć leczony lub kontrolowany stan leczenia, przejść do zagnieżdżania i wybrać stan kontroli próby. Wybierz interwał stanu od akcji elementu Star Trek do akcji żywiołu lampka włącza się jeden. Umieść skrzynkę lęgową między obróbką skrzynki filtra a odpowiednią skrzynką wyników.

Ten zdefiniowany interwał ma wartość jeden. Powtórz kroki dla interwałów na jednym z dwóch i na dwóch, a także dla grupy kontrolnej. Zdefiniuj również parametry do analizy w profilu analizy.

Wybierz zmienną zależną w strefie i wybierz środek strefy, punkt ciała, punkt środkowy i przejdź do statystyk próby. Wybierz częstotliwość, łączny czas trwania i pozwól tam, aby zobaczyć pierwszą. Dodaj również ruch odległości jako zmienną.

Dzięki temu profilowi dostępne są dane dotyczące czasu spędzonego w centrum, wpisów w środku i ruchu na odległość. Aby wyodrębnić dane z każdego podziału, przejdź do wyników i wybierz statystyki i wykresy, naciśnij oblicz, aby zobaczyć analizowane dane. Naciśnij przycisk eksportuj dane i wybierz statystyki badania oraz lokalizację do zapisania.

Wyeksportowane dane są zapisywane jako plik excel i z indywidualnymi wartościami dla każdej myszy. Dodatkowo przejdź do wizualizacji mapy cieplnej i naciśnij wykreśl mapy cieplne, wybierz próby po prawej stronie, aby zobaczyć indywidualne mapy cieplne dla każdej myszy i próby. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wyeksportuj mapy ciepła jako obrazy.

Później otwórz plik Excela na komputerze i oblicz średnią i standardową wartość euro SCM dla wszystkich czterech prób i każdej mierzonej grupy kondycjonowania. Aby wygenerować wykresy i wykres Sigma, skopiuj średnie i SCM w odpowiedniej kolejności z dodatkowego pliku do wykresu Sigma. Wiersze muszą zawierać dane dla wyłączonego jednego, na jeden, a kolumny zawierają herce próbne, średnie i SCM.

Zaznacz wszystkie trzy kolumny i przejdź do tworzenia wykresów. Zaznacz pole paska i wybierz niezgrupowane pole ze strzałką. Oznacz cały wykres, przejdź do strony głównej, wybierz pole wykresu i naciśnij eksport.

Wybierz folder docelowy i wybierz meta file jako format. Aby obliczyć statystyki dla uzyskanych danych, skopiuj dane z Xcel w prawo jeden na jednego i tak dalej, i tak dalej, oraz do pojedynczych kolumn wykresu Sigma. Zaznacz kolumny, które chcesz porównać i przejdź do analizy, wybierz T test i naciśnij uruchom.

Na koniec można pokazać dane behawioralne z podziałem na odpuszczone i próbne z dodatkową specjalizacją mapy cieplnej. W eksperymencie na otwartym polu, podczas stymulacji świetlnej rodopsyny kanałowej2 i neuronów piramidowych, czas trwania centrum jest skrócony, co wskazuje na zwiększony poziom lęku. Za pomocą immunohistochemii można określić miejsce wstrzyknięcia i ekspresję wirusa, a także zwalidować swoistość na specjalnej linii myszy zależnej od Cre.

Można wyraźnie zobaczyć, że stymulacja światłem rodopsyny kanałowej2 poprawia neurony umysłowe tego specyficznego regionu kory, zwiększa poziom lęku w porównaniu z lękiem wyjściowym przed tą stymulacją. Ten natychmiastowy wpływ manipulacji na zachowanie jest powodem, dla którego optogenetyka jest dziś używana do tak wielu pytań badawczych dotyczących zachowania. Procedura ta może być stosowana do modulacji optogenetycznej dowolnego pożądanego typu komórki lub obwodów neuronalnych w mózgu myszy.

Łącząc tę procedurę z odpowiednimi testami behawioralnymi do twoich badań, można uzyskać głębszy wgląd w obwody neuronalne zaangażowane w zachowania i choroby będące przedmiotem zainteresowania.