Name: Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metody pomiaru toksyczności peptydów RAN u Caenorhabditis elegans za pomocą behawioralnych i komórkowych testów. Protokoły te umożliwiają badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych w prostym modelu organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R21NS107797

1. Generowanie zróżnicowanych kodonów konstrukcji ekspresji peptydów RAN
<ol>
	<li>Zaprojektuj indywidualną sekwencję kodującą peptyd RAN, wykorzystując synonimiczne kodony, aby wyeliminować podstawową powtarzalną strukturę DNA/RNA, ale zachować leżącą nad nią sekwencję aminokwasów.</li>
	<li>Zamów niestandardowe sekwencje kodonów komercyjnie o długości powtórzeń potrzebnej do badań (zwykle 5–100 powtórzeń). Uwzględnij miejsce restrykcyjne HindIII na końcu 5' i miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 3', aby ułatwić klonowanie do wektorów ekspresji C. elegans, takich jak pPD95.79. 
	UWAGA: Jeśli synteza większych konstruktów okaże się trudna, można zsyntetyzować mniejsze sekwencje bloków budulcowych, a następnie wbudować je w większe powtórzenia przy użyciu strategii ligacji kierunkowej17.</li>
	<li>Subklonować sekwencję peptydową do wektora ekspresji C. elegans przy użyciu standardowych metod ligacji T4.</li>
	<li>Subklonuj specyficzną dla typu komórki sekwencję promotora wygenerowaną przez PCR przed sekwencją peptydową RAN w celu sterowania specyficzną tkankowo ekspresją peptydu RAN-GFP.</li>
	<li>Mikrowstrzyknąć konstrukt peptydu RAN do gonady dzikiego typu C. elegans w celu wygenerowania transgenicznych szczepów zawierających macierze pozachromosomalne przy użyciu standardowych metod18. W przypadku markera do jednoczesnego wstrzyknięcia wykorzystano specyficzny dla mięśni reporter RFP (myo-3p::RFP (pCFJ104)), chociaż można również wykorzystać inne markery.</li>
	<li>Zintegruj stabilny transgen z genomem przy użyciu standardowych metod przesiewowych integracji C. elegans19.</li>
	<li>Jeśli peptyd RAN jest toksyczny, a zwierzęta transgeniczne nie przeżywają, karmić zwierzęta gfp(RNAi) wykazującymi ekspresję bakterii przed i po wstrzyknięciu, aby wyciszyć ekspresję toksycznego białka. 
	UWAGA: Usunięcie zwierząt z gfp(RNAi) umożliwia ekspresję peptydu RAN do analiz fenotypowych przy użyciu testów opisanych poniżej.</li>
</ol>
2. Pomiar toksyczności rozwojowej peptydów RAN po knockdownie genu opartego na RNAi: Protokół analizy prędkości wideo
<ol>
	<li>Standardowe pożywki do wzrostu nicieni (NGM) RNAi 24-dołkowe płytki zalać 1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 25 μg/ml karbenicyliny.</li>
	<li>Umieść klony żywiące się RNAi w bakteriach HT115 do przetestowania na płytkach agarowych Luria bulion (LB) + karbenicylina (25 μg/ml) i hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Uwzględnij pusty wektor (RNAi) jako pozytywną kontrolę toksyczności i gfp(RNAi) jako kontrolę negatywną.</li>
	<li>Dla każdego klonu wybierz pojedynczą kolonię na 1 ml płynnej pożywki LB + karbenicyliny i hoduj bakterie przez noc przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obrotów na minutę (RPM).</li>
	<li>Umieść cztery pojedyncze studzienki w dołkach NGM RNAI 24 z 20 μl następujących nocnych kultur bakteryjnych: kolumna 1 dołki = gfp(RNAi); kolumna 2 dołki = (EV)RNAi; kolumny 3–6 dołków = RNAi przeciwko genom, które mają być testowane. Pozwól bakteriom RNAi indukować produkcję dsRNA przez noc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Wyizoluj jaja od pierwszego dnia dorosłego C. elegans wykazującego ekspresję zintegrowanego transgenu peptydu RAN przy użyciu standardowej metody podchlorynu i wysiewaj jaja ~ 30 C. elegans do każdej studzienki płytki NGM RNAi 24 dołki.</li>
	<li>Inkubować 24 studzienki w temperaturze 20 °C przez 7 dni. 
	UWAGA: Ten czas inkubacji dotyczy szczepów eksprymujących toksyczne dipeptydy RAN C9orf72, takie jak PR50 lub GR50. Inne szczepy mogą wymagać krótszego czasu inkubacji, aby zapobiec wyczerpaniu źródła pokarmu bakteryjnego i późniejszemu głodowi.</li>
	<li>Rejestruj filmy w świetle przechodzącym za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego Leica MZ16FA wyposażonego w DFC345FX monochromatyczną kamerę podłączoną do komputera kompatybilnego z systemem Windows z oprogramowaniem do akwizycji wideo Leica AF (wersja 2.6.0.7266).
	<ol>
		<li>Uzyskaj dwa filmy z dwóch oddzielnych dołków dla każdego warunku RNAi, korzystając ze spójnych ustawień akwizycji wideo między dołkami. Dla każdego filmu utrwal 10 sekund w rozdzielczości 800 x 600 pikseli i 13,16 klatkach na sekundę (wymiar woksela = 0,076 sekundy) przy użyciu powiększenia 18,6x (ustawienie zoomu 1,49 w oprogramowaniu AF). Ustaw czas naświetlania obrazu na 4 milisekundy. Natychmiast oznacz każdy film szczepem, stanem RNAi i numerem studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nie zwracaj uwagi na genotyp związany z każdym plikiem wideo, losowo dobierając kolejność filmów i zmieniając nazwy filmów na liczby. Zapisz tę grupę filmów jako nowy plik. Odślep eksperymentatora po zakończeniu analizy.</li>
	<li>Zmierz "przebytą odległość" i długość każdego zwierzęcia dla 20 różnych zwierząt z każdego filmu, badając w sumie ~40 robaków dla każdego stanu RNAi.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu wybierz przycisk narzędzi adnotacji, a następnie narzędzie do rysowania tekstu. Kliknij punkt w środku mierzonego robaka w pierwszej klatce filmu i oznacz go jako liczbę. Przewiń film do końca, wizualnie śledząc ścieżkę ruchu robaka. W ostatniej klatce kliknij punkt w środku mierzonego robaka i zaznacz następną odpowiednią liczbę. Następnie, za pomocą narzędzia rysowania podziałki liniowej, narysuj linię od pierwszej liczby do drugiej liczby, aby zapisać "przebytą odległość".</li>
		<li>"Przebyta odległość" oznacza odległość między dwoma punktami środka ciężkości. Odległość ta jest pokazana obok linii pomiarowej. Zapisz ten pomiar w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz ten pomiar dla 19 innych robaków na filmie, zachowując każdy pojedynczy pomiar w oknie analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj pomiary na zwierzętach wykazujących najbardziej dynamiczny ruch, aby uniknąć selekcji zwierząt nie wykazujących ruchu i stronniczości danych w kierunku paraliżu. Po zakończeniu pomiarów zrób migawkę ostatniej klatki wideo ilustrującej wszystkie linie pomiarowe, tak aby dane można było prześledzić wstecz do zwierzęcia, od którego pochodzą.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą czterokolumnowego arkusza kalkulacyjnego. Kolumna pierwsza to "identyfikator" robaka, kolumna druga to przebyta odległość / czas (prędkość).
	<ol>
		<li>Czas każdego filmu można znaleźć, klikając prawym przyciskiem myszy film w eksperymencie i przechodząc do właściwości filmu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj pomiar prędkości, znajdując długość każdego zwierzęcia, wybierając opcję Quantify, a następnie Statistics w oprogramowaniu. Kliknięcie na ikonę narzędzia adnotacji na ekranie wideo powinno pozwolić na użycie narzędzia "Narysuj polilinię". To narzędzie może być następnie używane do swobodnego śledzenia C. elegans od filmu od czubka głowy do czubka ogona. Długość linii będzie rejestrowana w statystykach.
	<ol>
		<li>Zrób migawkę ostatniej klatki wideo ilustrującej wszystkie polilinie użyte do wymiarowania C. elegans, tak aby dane można było prześledzić wstecz do zwierzęcia, od którego pochodzą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj dane, dodając dwie dodatkowe kolumny do arkusza kalkulacyjnego. Kolumna trzecia to "Długość zwierzęcia", a kolumna czwarta to "Prędkość znormalizowana" (prędkość/długość zwierzęcia). Analizuj znormalizowane dane dotyczące prędkości przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z testami post-hoc w porównaniu z pustym wektorem (RNAi).</li>
</ol>
3. Pomiar toksyczności rozwojowej peptydu RAN: Test wzrostu
<ol>
	<li>Wybierz ~ 30 ciężarnych zwierząt do 50 μl plamki roztworu podchlorynu (10 ml wybielacza, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) na gfp (RNAi), (EV) RNAi lub (specyficznej dla genu) 6 cm płytce RNAi.</li>
	<li>Po 24 godzinach przenieść sześć transgenicznych potomków, które wypełzły z miejsca roztworu podchlorynu, na nową 6 cm płytkę RNAi, identyczną z warunkami RNAi na płytce, na której zostały poddane działaniu roztworu podchlorynu. Umieścić to potomstwo (F1) w temperaturze 20 °C, aby rosło i rozmnażało się.</li>
	<li>Po 24–48 godzinach wybierz 10 transgenicznych zwierząt L4 na 6 cm RNAi pasujące do warunków RNAi, na których zwierzęta rosły. Pozwolić zwierzętom na pulsacyjne składanie jaj przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach należy usunąć dorosłe zwierzęta i wyrzucić je. Policz liczbę jaj i larw L1 złożonych w ciągu 24 godzin za pomocą mechanicznego licznika ręcznego. Jest to całkowita wielkość czerwiu.</li>
	<li>W ciągu następnych 72 godzin policz liczbę zwierząt, które osiągną poziom L4 lub starszy. Podczas liczenia każdego zwierzęcia wyjmij je z talerza.</li>
	<li>Określ ilościowo "procentowy wzrost" jako procent zwierząt, które osiągają stadium L4 lub starsze w stosunku do całkowitej wielkości lęgu.</li>
	<li>Wykonaj dokładny test Fishera 2 x 2 w porównaniu z pustym wektorem (RNAi), aby określić, czy procentowy wzrost jest statystycznie istotny. Kategorie do porównania to "Wzrost" (# zwierząt, które osiągnęły stadium L4 lub starsze w ciągu 72 godzin) i "Brak wzrostu" (całkowita wielkość lęgu minus liczba zwierząt osiągających stadium L4 lub starsze w ciągu 72 godzin).</li>
</ol>
4. Test porażenia peptydowego RAN
<ol>
	<li>Utrzymuj zintegrowane transgeniczne szczepy C. elegans eksprymujące peptyd RAN-GFP w mięśniach na gfp (RNAi), umieszczając 4-6 transgenicznych L4 na 6 cm płytce gfp (RNAi) i hoduj robaki w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Jeśli eksperyment wykorzystuje RNAi do testowania wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, przenieś 10 transgenicznych dorosłych gravidów z niegłodzonej płytki na każdy z dwóch 6 cm pustego wektora (RNAi) (pozytywna kontrola paraliżu, negatywna kontrola skutków genetycznych), gfp(RNAi) (negatywna kontrola paraliżu, pozytywna kontrola skutków genetycznych), specyficzny dla genu (RNAi) (tj. 10 ciężarnych dorosłych na 6 cm talerzu).</li>
	<li>Jeśli mutanty są używane do analizy wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, umieść 10 ciężarnych WT lub zmutowanych zwierząt wykazujących ekspresję tego samego transgenu RAN na każdej z dwóch 6 cm pustych płytek wektorowych (RNAi) lub gfp (RNAi). Hoduj robaki w temperaturze 20 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Wybierz 10 zestawów po 10 transgenicznych L4 z 6 cm płytek RNAi i umieść każdy zestaw na 3 cm płytce RNAi (tj. n = 100 zwierząt dla każdego genotypu). Upewnij się, że wszystkie L4 wybrane do testu mają powierzchownie normalną ruchliwość. Umieść talerze w torbie do przechowywania na zamek błyskawiczny, aby zatrzymać wilgoć.</li>
	<li>Umieścić zapakowane w worki płytki z L4 w inkubatorze o temperaturze 25 °C.</li>
	<li>24 godziny później należy wyjmować zwierzęta z inkubatora w temperaturze 25 °C, po jednym naturze na raz, aby zminimalizować czas przebywania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Postukaj w płytki mikroskopu preparacyjnego, aby sprawdzić ruch. Jeśli zwierzę porusza się na więcej niż długość ciała, policz zwierzę jako ruchome i przenieś je na nową 3-centymetrową płytkę RNAi. Użyj platynowego kilofa, aby postukać w pozostałe robaki na głowie lub ogonie. Jeśli zwierzę porusza się na więcej niż długość ciała, policz je jako ruchome i przenieś je na nową 3 cm płytkę RNAi. 
	UWAGA: Nie przekraczaj 10 robaków na płytkę podczas przenoszenia. Należy uważać, aby nie przenosić potomstwa na nową płytkę RNAi, ponieważ test zależy tylko od obserwacji starszych zwierząt.</li>
	<li>Zgrupuj wszystkie nieruchome robaki razem, aby można było łatwo wykryć ruch większy niż długość ciała. Daj zwierzęciu co najmniej minutę na przemieszczenie się o więcej niż jedną długość ciała. Jeśli nadal się nie porusza, jest sparaliżowany, zapakowany w worki (tj. larwy wykluwają się wewnątrz matki) lub martwy.</li>
	<li>Cenzuruj zwierzęta, które wykazują worki, wysuszają się po bokach płytki, wykazują wyciśnięte jelita, zakopują się, gubią się lub umierają od testu w momencie wykrycia. Sparaliżowane robaki są liczone, pozostawiane na starej płytce RNAi i odrzucane.</li>
	<li>Oceniaj zwierzęta pod kątem paraliżu codziennie przez 5–7 dni, zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.9.</li>
	<li>Analizuj dane dotyczące paraliżu za pomocą testu logarytmicznego identycznego z tym, który jest używany do analizy długości życia. W tej analizie statystycznej poruszające się robaki są oceniane jako "żywe", sparaliżowane robaki są oceniane jako "martwe", a martwe, workowane, wytłaczane jelita, wysuszone, zagrzebane lub w inny sposób zagubione robaki są oceniane jako "ocenzurowane". 
	UWAGA: W tej analizie liczba "Procent życia" wskazuje "Procent poruszających się" zwierząt. Odwrotność reprezentuje "procent sparaliżowanych". Użyj narzędzia do analizy online OASIS (<a href="https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/" target="_blank">https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/</a>), aby przeprowadzić analizy statystyczne logarytmiczne.</li>
</ol>
5. Pomiar patologii neuronów: Test spoidła
<ol>
	<li>Generuj transgeniczne C. elegans eksprymujące peptyd RAN będący przedmiotem zainteresowania w neuronach GABA-ergicznych za pomocą promotora unc-47. Wyraź również unc-47p::GFP lub unc-47p::RFP, aby ujawnić morfologię komórkową neuronów GABA.</li>
	<li>Wybierz 50 transgenicznych zwierząt L4 i umieść je na 6 cm talerzu OP50 w temperaturze 25 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Przenieść 50 transgenicznych zwierząt na nową 6 cm płytkę OP50 w temperaturze 25 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Wykonaj podkładki agarozowe do obrazowania zwierząt pod mikroskopem szerokokątnym.
	<ol>
		<li>Umieść dwa kawałki taśmy na dwóch szkiełkach mikroskopowych. Umieść oczyszczony slajd bez taśmy na środku dwóch zaklejonych taśmą slajdów.</li>
		<li>Dozować ~100 μL (1 kropla z jednorazowej plastikowej pipety Pasteura) 3% stopionej agarozy na środkowe szkiełko za pomocą jednorazowej sterylnej pipety transferowej.</li>
		<li>Natychmiast umieść drugie czyste szkiełko w poprzek kropli stopionej agarozy, tak aby spoczywało na zaklejonych szkiełkach i tworzyło cienką i równą warstwę agarozy między szkiełkami.</li>
		<li>Po ostygnięciu i zestaleniu się agarozy ostrożnie usuń dwa szkiełka z warstwą agarozy między nimi, nie rozdzielając ich, i umieść je w plastikowej torbie z wilgotnym kawałkiem papieru pod nimi. Zrób jedno szkiełko na 10 robaków do zbadania wraz z trzema dodatkowymi szkiełkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć transgeniczne C. elegans z inkubatora w temperaturze 25 °C i pobrać 10 transgenicznych C. elegans do 100 μl kropli 10 mM lewamizolu w szklanym szkiełku wgłębieniowym. Inkubować przez 10 minut lub do momentu, gdy zwierzęta zostaną sparaliżowane.</li>
	<li>Wyjmij parę szkiełek z plastikowej torby i ostrożnie je oddziel. Oznacz szkiełko agarozą genotypem i dodaj 2 μl 10 mM lewamizolu do środka agarozy. Przenieś 10 zwierząt do lewamizolu na podkładce agarozowej. Przykryj zwierzęta szkiełkiem nakrywkowym o grubości #1.</li>
	<li>Wyobraź sobie zwierzęta, u których srom jest zorientowany w taki sposób, że znajduje się po prawej stronie zwierzęcia. Jeśli srom znajduje się po lewej stronie głowy, spoidła neuronów ruchowych będą znajdować się pod zwierzętami i nie będą tak wyraźnie widoczne, co utrudni dokładną kwantyfikację. Pomiń oznaczanie ilościowe w odniesieniu do tych zwierząt. W tej orientacji spoidła neuronów ruchowych znajdują się najbliżej szkiełka nakrywkowego i są wyraźnie widoczne w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu. Wizualizacja spoidła neuronów wyrażających GFP za pomocą odwróconego szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMI4000B z soczewką zanurzeniową olejową 63X 1,4X NA i zestawem filtrów Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Jeśli spoidła neuronów wyrażają RFP zamiast GFP, użyj zestawu filtrów RFP Leica TX2 (Ex560/40nm; Em645/75nm).
	<ol>
		<li>Wizualizacja spoidła neuronów wyrażających GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego szerokokątnego z soczewką immersyjną olejową 63x 1,4x i zestawem filtrów GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Jeśli spoidła neuronów wyrażają RFP zamiast GFP, użyj zestawu filtrów z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyobraź sobie robaki w ciągu 45 minut od umieszczenia szkiełka nakrywkowego na robakach, aby zminimalizować toksyczność wynikającą z unieruchomienia.</li>
	<li>Dla każdego robaka policz liczbę widocznych spoideł. U zwierząt w typie dzikim widocznych jest 16 spoidł. Policz również liczbę spoidła, które mają duże kulki (tj. pęcherzyki) w spoidłach, a także liczbę spoidła, które są zepsute. Aby potwierdzić, że spoidło jest przerwane, postępuj zgodnie z spoidłem od rdzenia grzbietowego do sznura brzusznego, regulując płaszczyznę ogniskowej. 
	UWAGA: Spoidła, w których fluorescencja unc-47p::GFP wykazuje przerwę, są uważane za uszkodzone. Zepsute spoidło zazwyczaj ma pęcherzyk po obu stronach przerwy, co pomaga pokazać, że spoidło jest zepsute. Policz ilość blebbingu i przerw na 20 robaków.</li>
	<li>Obliczyć ułamek spoidła z pęcherzykami lub przerwami w stosunku do całkowitej liczby zaobserwowanych spoideł dla każdego zwierzęcia. Można również zmierzyć bezwzględną liczbę spoidła zliczonych na zwierzę (w tym zdarzenia typu dzikiego, wyblakłego i uszkodzonego).</li>
	<li>Dla każdej kategorii oblicz średnią ± SD i przeanalizuj statystycznie za pomocą testu t Studenta do porównania dwóch populacji lub jednoczynnikowej ANOVA do porównań między 3 lub więcej populacjami.</li>
</ol>

<ol><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+associated+non-ATG+%28RAN%29+translation%3A+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+address%2C+g.+h.+m.+h.+e.%2C+Genetic+Modifiers+of+Huntington%27s+Disease%2C+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington%27s+Disease+Onset%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li>
<li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length+of+Uninterrupted+CAG%2C+Independent+of+Polyglutamine+Size%2C+Results+in+Increased+Somatic+Instability%2C+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li>
<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-ATG+%28RAN%29+translation+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li>
<li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-AUG+%28RAN%29+translation%3A+insights+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li>
<li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+Translation+in+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li>
<li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li>
<li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877(2016).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly%2C+Dynamics%2C+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li>
<li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).</li>
<li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87(2011).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li>
<li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li>
<li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li>
<li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li>
<li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li>
<li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin-inducible+degradation+%28AID%29+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metody, które można wykorzystać do oznaczania toksyczności peptydu RAN modelowanego w mięśniach lub neuronach C. elegans. Podczas gdy białka neurodegeneracyjne mają fenotyp początkowy u ludzi z wiekiem, mogą również wykazywać toksyczność rozwojową, gdy są nadmiernie eksprymowane w systemach modelowych. Nadekspresja ma znaczące ograniczenia interpretacyjne, ale stanowi również potężny punkt wyjścia dla genetycznych lub farmakologicznych badań przesiewowych mających na celu identyfikacj...

Niewłaściwe rozszerzanie sekwencji powtórzeń DNA jest podstawą genetyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), otępienie czołowo-skroniowe (FTD) i choroba Huntingtona (HD)1. Chociaż istnieją ustalone modele komórkowe i zwierzęce tych chorób, mechanizmy leżące u podstaw tych stanów nie są dobrze zdefiniowane. Na przykład, choroba Huntingtona jest spowodowana ekspansją sekwencji powtórzeń CAG w sekwencji kodującej białko huntingtyny Htt2. Ponieważ CAG koduje aminokwas glutaminę, ekspansja powtórzeń CAG powoduje insercję sekwencji poliglutaminy lub polyQ w Htt. Ekspandowane białka polyQ tworzą zależne od długości i wieku agregaty białkowe, które są związane z toksycznością3,4. Co zaskakujące, dwa ostatnie badania sugerują, że długość sekwencji polyQ nie jest głównym czynnikiem powodującym wystąpienie choroby Huntingtona, co sugeruje, że czynniki niezależne od polyQ mogą również przyczyniać się do choroby5,6.
Jednym z możliwych mechanizmów niezależnych od polyQ jest nowo odkryty typ translacji białek, określany jako Repeat Askojarzony Nzależny od AUG (RAN) translacja7. Jak sama nazwa wskazuje, translacja RAN występuje tylko wtedy, gdy obecna jest rozszerzona sekwencja powtórzeń i nie wymaga kanonicznego kodonu startowego. W związku z tym translacja RAN zachodzi we wszystkich trzech ramkach odczytu powtórzenia, tworząc trzy odrębne polipeptydy. Ponadto, ponieważ wiele genów wytwarza również transkrypt antysensowny, który zawiera odwrotne uzupełnienie rozszerzonej sekwencji powtórzeń, translacja RAN zachodzi również we wszystkich trzech ramkach odczytu transkryptu antysensownego. Łącznie, translacja RAN zwiększa liczbę białek wytwarzanych z rozszerzonej sekwencji DNA zawierającej powtórzenia z jednego peptydu do sześciu peptydów. Do tej pory translację RAN zaobserwowano w co najmniej ośmiu różnych zaburzeniach powtarzania ekspansji8. Peptydy RAN obserwuje się w próbkach pobranych pośmiertnie od pacjentów i tylko w przypadkach, gdy pacjent jest nosicielem rozszerzonego repeat9,10. Chociaż peptydy te są wyraźnie obecne w komórkach pacjentów, ich wkład w patofizjologię choroby jest niejasny.
Aby lepiej zdefiniować potencjalną toksyczność związaną z peptydami RAN, kilka grup wyraziło każdy peptyd w różnych systemach modelowych, takich jak drożdże, muchy, myszy i komórki hodowli tkankowej11,12,13,14,15,16. Zamiast wykorzystywać sekwencję powtórzeń do ekspresji, modele te wykorzystują podejście wariacji kodonów, w którym sekwencja powtórzeń jest eliminowana, ale sekwencja aminokwasów jest zachowywana. Inicjacja translacji następuje poprzez kanoniczny ATG, a peptyd jest zwykle łączony z białkiem fluorescencyjnym na końcu N lub C, z których żadne nie wydaje się zakłócać toksyczności peptydu RAN. W związku z tym każdy konstrukt wykazuje nadekspresję pojedynczego peptydu RAN. Modelowanie różnych produktów RAN w organizmie wielokomórkowym za pomocą prostych testów do pomiaru toksyczności peptydów RAN jest niezwykle ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób różne produkty RAN z każdej powodującej chorobę powtórnej ekspansji przyczyniają się do dysfunkcji komórkowej i neurodegeneracji.
Podobnie jak inne systemy modelowe, C. elegans dostarcza elastyczną i efektywną platformę eksperymentalną, która umożliwia badania nowych mechanizmów chorobowych, takich jak toksyczność peptydów RAN. Robaki oferują kilka unikalnych cech eksperymentalnych, które nie są obecnie dostępne w innych modelach toksyczności peptydów RAN. Po pierwsze, C. elegans są optycznie przezroczyste od urodzenia aż do śmierci. Pozwala to na prostą wizualizację ekspresji i lokalizacji peptydu RAN, a także analizę in vivo neurodegeneracji u żywych zwierząt. Po drugie, transgeniczne metody generowania modeli ekspresji peptydów RAN są niedrogie i szybkie. Biorąc pod uwagę krótki, trzydniowy cykl życiowy C. elegans, stabilne linie transgeniczne wyrażające dowolny peptyd RAN w sposób specyficzny dla typu komórki mogą zostać wytworzone w czasie krótszym niż tydzień. Po trzecie, proste wyniki fenotypowe można połączyć z genetycznymi metodami przesiewowymi, takimi jak mutageneza chemiczna lub badania przesiewowe RNAi, w celu szybkiej identyfikacji genów niezbędnych do toksyczności peptydów RAN. Wreszcie, krótka żywotność C. elegans (~ 20 dni) pozwala badaczom określić, w jaki sposób starzenie się, które jest największym czynnikiem ryzyka większości powtarzających się chorób ekspansji, wpływa na toksyczność peptydu RAN. Razem, ta kombinacja cech eksperymentalnych nie ma sobie równych w żadnym innym systemie modelowym i stanowi potężną platformę do badania toksyczności peptydów RAN.
Tutaj opisujemy kilka testów, które wykorzystują eksperymentalne zalety C. elegans do pomiaru toksyczności peptydów RAN i identyfikacji genetycznych modyfikatorów tej toksyczności. Zróżnicowane kodonem peptydy RAN inicjowane przez ATG są znakowane GFP i wyrażane indywidualnie w komórkach mięśniowych pod promotorem myo-3 lub w neuronach ruchowych GABA-ergiczny pod promotorem unc-47. Dla ekspresji w komórkach mięśniowych ważne jest, aby toksyczne peptydy RAN były oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub innym znacznikiem białka fluorescencyjnego (FP), które może być celem wektora żywieniowego RNAi. Dzieje się tak, ponieważ toksyczna ekspresja peptydu RAN zwykle blokuje wzrost, czyniąc takie szczepy nieżywotnymi. Zastosowanie gfp(RNAi) warunkowo dezaktywuje ekspresję peptydu RAN i umożliwia utrzymanie szczepu, krzyżowanie genetyczne itp. Do testów zwierzęta te są usuwane z gfp (RNAi), co umożliwia ekspresję peptydu RAN i powstałych fenotypów. Oprócz strategii molekularnej do projektowania zróżnicowanych kodonami konstruktów ekspresji peptydu RAN, opisujemy testy do pomiaru toksyczności rozwojowej (test ruchliwości larw i wzrostu), porozwojowej toksyczności związanej z wiekiem (test paraliżu) i defektów morfologicznych neuronów (test spoidła).

<table><tbody><tr><td>35mm x 10mm szalka Petriego, sterylna</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>50-202-036</td><td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr><tr><td>AGAR GRANULOWANE 2KILOGRAMOWE</td><td>SYSTEMY DIAGNOSTYCZNE BD</td><td></td> DF0145070 <td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr><tr><td>AGAROZA ULTRAPURE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 16500500 <td>Mikroiniekcja do generowania peptydu RAN szczepy transgeniczne</td></tr><tr><td>KARBENICYLINA 5G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP26485</td><td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr><tr><td>OKULARY NAKRYWKOWE NR 1 22MM 1OZ/PK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12542B</td><td>Obrazowanie do testu spoidła</td></tr><tr><td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td></td> E5242952008 <td>Mikroiniekcja do generowania peptydów RAN szczepy transgeniczne</td></tr><tr><td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>125485C</td><td>Mikroiniekcja do generowania transgenicznych szczepów peptydu RAN</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12-550-15</td><td>Obrazowanie do testu spoidła</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Bacto Pepton&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>DF0118-17-0</td><td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr><tr><td>OLEJ HALOCARBON 700</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>H8898-50ML</td><td>Mikroiniekcja do generowania szczepów transgenicznych peptydu RAN</td></tr><tr><td>IPTG BIOTECH 10G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td></td> BP162010 <td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr><tr><td>Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego Leica</td><td>Microsystems</td><td>LAS-AF</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu do analizy prędkości wideo i testu spoidła</td></tr><tr><td>Leica Immersion type N (Oil)</td><td>W NUHSBAUM INC</td><td></td> NC9547002 <td>Obrazowanie do testu spoidła</td></tr><tr><td>CHLOROWODOREK LEWAIZOLU 10GR</td><td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td> AC187870100 <td></td><td>Obrazowanie do testu spoidła</td></tr><tr><td>KOŃCÓWKI MIKROŁADOWARKI 2 X 96 SZT</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td></td> <td>E5242956003Mikroiniekcja do generowania transgenicznych szczepów peptydu RAN</td></tr><tr><td> SZALKA PETRI, 60X15MM, 500/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td> FB0875713A <td></td><td>Płytki wzrostu nicieni i PŁYTKA KULTU TKANKOWEGO RNAi</td></tr><tr><td>24WEL 50/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td><td>87721</td><td>Płytki wzrostu nicieni i RNAi</td></tr></tbody></table>

pomiar toksyczności peptydów ran u c. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans jest powszechnie używany do modelowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem spowodowanych powtarzającymi się mutacjami ekspansji, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Huntingtona. Niedawno wykazano, że RNA zawierające wielokrotną ekspansję jest substratem dla nowego rodzaju translacji białek zwanej translacją niezależną od AUG (RAN) związaną z powtórzeniami. W przeciwieństwie do translacji kanonicznej, translacja RAN nie wymaga kodonu start i występuje tylko wtedy, gdy powtórzenia przekraczają długość progową. Ponieważ nie ma kodonu startowego do określenia ramki odczytu, translacja RAN zachodzi we wszystkich ramkach odczytu zarówno z matryc RNA sensownych, jak i antysensownych, które zawierają powtarzającą się sekwencję ekspansji. W związku z tym translacja RAN zwiększa liczbę możliwych toksycznych peptydów związanych z chorobą z jednego do sześciu. Do tej pory translacja RAN została udokumentowana w ośmiu różnych chorobach neurodegeneracyjnych i nerwowo-mięśniowych opartych na powtarzającej się ekspansji. W każdym przypadku rozszyfrowanie, które produkty RAN są toksyczne, a także ich mechanizmy toksyczności, jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia, w jaki sposób peptydy te przyczyniają się do patofizjologii choroby. W artykule przedstawiono strategie pomiaru toksyczności peptydów RAN w układzie modelowym C. elegans. Po pierwsze, opisujemy procedury pomiaru toksyczności peptydu RAN na wzrost i ruchliwość rozwijającego się C. elegans. Po drugie, szczegółowo opisujemy test do pomiaru porozwojowego, zależnego od wieku wpływu peptydów RAN na ruchliwość. Na koniec opisujemy test neurotoksyczności do oceny wpływu peptydów RAN na morfologię neuronów. Testy te zapewniają szeroką ocenę toksyczności peptydów RAN i mogą być przydatne do wykonywania badań genetycznych na dużą skalę lub badań przesiewowych małych cząsteczek w celu identyfikacji mechanizmów chorobowych lub terapii.

Opisane tutaj testy wykorzystaliśmy do oceny wpływu inhibicji różnych genów na toksyczność dipeptydów RAN, które występują u pacjentów z ALS z ekspansją powtórzeń G4C2. Wykorzystując test wzrostu do pomiaru toksyczności rozwojowej, przeanalizowaliśmy efekty kilku genetycznych mutantów z nokautem, zidentyfikowanych w ogólnogenomowym screeningu RNAi pod kątem supresorów toksyczności PR50-GFP eksprymowanego w mięśniach. Podczas gdy sama ekspresja PR50-GFP prowadziła do całkowicie penetrującego zatrzyma...

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Peptydy RAN są cechą zaburzeń neurodegeneracyjnych o powtarzającej się ekspansji, takich jak choroba Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne i otępienie czołowo-skroniowe. Protokoły te stanowią ważne ustandaryzowane podejście do ilościowego określania toksyczności peptydu RAN w systemie modelowym C.elegans. Opisane techniki są łatwe do nauczenia i niedrogie, można je wykonać szybko i wykorzystują powtarzalne cechy systemu C.elegans, takie jak ruch i rozmnażanie.Podczas prób zastosowania tego protokołu głównym wyzwaniem jest uzyskanie spójnej toksyczności i ekspresji peptydu RAN. Głównymi czynnikami, które należy kontrolować, są temperatura leku, czas zmian temperatury i przygotowanie płytek testowych. Ważne jest, aby eksperymentatorzy konsekwentnie klasyfikowali fenotypy zwierząt w tym zależnym od wieku teście procesu.Wizualna demonstracja tej techniki pokazuje ich kryteria klasyfikacji. Zacznij od wlania standardowej pożywki hodowlanej nicieni z jednym milimolowym IPTG i 25 mikrogramami na mililitr karbenicyliny do 24-dołkowych płytek. Umieść klony odżywiające się RNAi w bakteriach HT115 na agarze karbenicylinowym LB i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny

measuring-ran-peptide-toxicity-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Ten film przedstawia test krótkoterminowego przeżycia, który testuje leczenie ostrej toksyczności lub testuje szczep genetyczny pod kątem odporności na stan toksyczny. Przykładowy protokół pokazuje przykładowy test przeżycia, w którym robaki są testowane pod kątem ich odporności na stres oksydacyjny wywołany przez parakmet (PQ).

C. elegans (C. elegans) Test przeżycia: test toksyczności krótkoterminowej

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Poznaj metody pomiaru toksyczności peptydów RAN u Caenorhabditis elegans za pomocą behawioralnych i komórkowych testów. Protokoły te umożliwiają badanie mechanizmów neurodegeneracyjnych w prostym modelu organizmu.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów