Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans
30 kwietnia 2020
Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.
Peptydy RAN są cechą zaburzeń neurodegeneracyjnych o powtarzającej się ekspansji, takich jak choroba Huntingtona, stwardnienie zanikowe boczne i otępienie czołowo-skroniowe. Protokoły te stanowią ważne ustandaryzowane podejście do ilościowego określania toksyczności peptydu RAN w systemie modelowym C.elegans. Opisane techniki są łatwe do nauczenia i niedrogie, można je wykonać szybko i wykorzystują powtarzalne cechy systemu C.elegans, takie jak ruch i rozmnażanie.
Podczas prób zastosowania tego protokołu głównym wyzwaniem jest uzyskanie spójnej toksyczności i ekspresji peptydu RAN. Głównymi czynnikami, które należy kontrolować, są temperatura leku, czas zmian temperatury i przygotowanie płytek testowych. Ważne jest, aby eksperymentatorzy konsekwentnie klasyfikowali fenotypy zwierząt w tym zależnym od wieku teście procesu.
Wizualna demonstracja tej techniki pokazuje ich kryteria klasyfikacji. Zacznij od wlania standardowej pożywki hodowlanej nicieni z jednym milimolowym IPTG i 25 mikrogramami na mililitr karbenicyliny do 24-dołkowych płytek. Umieść klony odżywiające się RNAi w bakteriach HT115 na agarze karbenicylinowym LB i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię do jednego mililitra płynnego podłoża LB karbenicyliny i hoduj bakterie przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Znajdź cztery pojedyncze dołki 24-dołkowej płytki NGM RNAi z 20 mikrolitrami nocnych kultur bakteryjnych, jak opisano w manuskrypcie tekstowym i pozwól bakteriom RNAi indukować dwuniciową produkcję RNA przez noc. Zastosuj standardową metodę podchlorynu, aby wyizolować jaja od dorosłych C. elegans wykazujących ekspresję zintegrowanego transgenu peptydu RAN.
Następnie wysiewaj około 30 jaj do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubuj szalkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez siedem dni. Aby przeprowadzić analizę prędkości wideo, należy pobrać dwa filmy z dwóch oddzielnych studzienek dla każdego warunku RNAi za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w monochromatyczną kamerę. Upewnij się, że używasz spójnych ustawień akwizycji między odwiertami.
Dla każdego filmu ustaw czas trwania na 10 sekund i interwał czasu na 76 milisekund. Ustaw czas ekspozycji obrazu na cztery milisekundy i użyj ustawienia zoomu 1,49. Następnie wybierz binowanie dwa po dwóch.
Sprawdź, czy rozdzielczość wynosi 800 na 600 pikseli i rozpocznij nagrywanie. Po akwizycji natychmiast oznacz każdy film szczepem, stanem RNAi i numerem dołka. Następnie zmierz przebytą odległość i długość każdego zwierzęcia dla 20 różnych zwierząt na filmie, badając łącznie około 40 robaków dla każdego warunku RNAi.
W oprogramowaniu wybierz przycisk narzędzi adnotacji. Następnie narzędzie do rysowania tekstu. Kliknij punkt w środku mierzonego robaka w pierwszej klatce filmu i zaznacz go liczbą.
Przewiń film do końca, wizualnie śledząc robaka. Następnie kliknij na niego i zaznacz go następnym odpowiadającym mu numerem. Użyj narzędzia rysuj pasek podziałki, aby narysować linię od pierwszej do drugiej liczby i zapisać przebytą odległość w arkuszu kalkulacyjnym.
Powtórz ten pomiar dla 19 innych robaków na filmie, zachowując każdy pojedynczy pomiar w oknie analizy. Po zakończeniu pomiarów zrób migawkę ostatniej klatki wideo ilustrującej wszystkie linie pomiarowe, tak aby dane można było prześledzić wstecz do zwierzęcia, od którego pochodzą. Następnie przeanalizuj dane za pomocą czterokolumnowego arkusza kalkulacyjnego, w którym pierwsza kolumna to identyfikator robaka, a kolumna druga to szybkość.
Czas każdego filmu można znaleźć, klikając prawym przyciskiem myszy film w eksperymencie i przechodząc do właściwości. Aby znormalizować pomiar prędkości, znajdź długość każdego zwierzęcia. Użyj narzędzia do rysowania polilinii, aby swobodnie śledzić C.elegans od czubka głowy do czubka ogona.
Następnie zrób migawkę końcowej klatki wideo ilustrującej wszystkie polilinie. Długość linii będzie rejestrowana w statystykach. Dodaj dwie kolumny do arkusza kalkulacyjnego, jedną dla długości zwierzęcia i jedną dla znormalizowanej prędkości.
Na koniec przeanalizuj znormalizowane dane dotyczące prędkości za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testami post-hoc w porównaniu z pustym wektorem RNAi. Umieść cztery do sześciu transgenicznych L4 C.elegans eksprymujących peptyd RAN GFP na sześciocentymetrowej płytce RNAi GFP i hoduj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Jeśli eksperyment wykorzystuje RNAi do testowania wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, przenieś 10 transgenicznych dorosłych grawitujących na każdą z dwóch pustych płytek RNAi RNAi GFP lub RNAi specyficznych dla genu.
Jeśli mutanty są używane do analizy wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, umieść 10 ciężkich dzikich lub zmutowanych zwierząt wykazujących ekspresję tego samego transgenu RAN na każdej z dwóch pustych płytek wektorowych RNAi lub GFP RNAi. Uprawiaj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Wybierz 10 zestawów po 10 transgenicznych L4 z płytek RNAi i umieść każdy zestaw na trzycentymetrowej płytce RNAi.
Upewnij się, że wszystkie robaki wybrane do testu mają powierzchownie normalną ruchliwość. Umieść płytki w plastikowej torbie, aby zatrzymać wilgoć i inkubuj je w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach przeanalizuj zwierzęta pod kątem mobilności, stukając w płytki mikroskopu preparacyjnego i sprawdzając ruch.
Jeśli robak porusza się na więcej niż długość ciała, policz go jako ruchliwy i przenieś na nową, trzycentymetrową płytkę RNAi. Użyj platynowego kilofa, aby postukać w pozostałe robaki na głowie i ogonie. Jeśli zwierzę porusza się na więcej niż długość ciała, policz je jako mobilne i przenieś je na nową, trzycentymetrową płytkę RNAi.
Jeśli do drugiego dnia nie zaobserwuje się znacznego paraliżu w kontroli pustego wektora, należy zakończyć test i zacząć od nowa. Zgrupuj wszystkie nieruchome robaki razem, aby można było łatwo wykryć ruch większy niż długość ciała. Policz wszystkie sparaliżowane, zapakowane w worki lub martwe robaki i wyrzuć talerz.
Kontynuuj ocenianie zwierząt pod kątem paraliżu codziennie przez pięć do siedmiu dni. Test wzrostu wykorzystano do zmierzenia wpływu hamowania genów na toksyczność dipeptydów RAN, które występują u pacjentów z ALS z ekspansją powtórzeń G4C2. Sama ekspresja PR50 GFP spowodowała całkowite zatrzymanie wzrostu, ale wyłączenie kilku genów stłumiło toksyczność rozwojową.
Wpływ specyficznych knockdownów genów na ruchliwość rozwojową zwierząt wykazujących ekspresję PR50 mierzono za pomocą metody analizy prędkości wideo. Zgodnie z oczekiwaniami, zahamowanie ekspresji PR50 GFP spowodowało duży wzrost ruchliwości w porównaniu z pustym wektorem RNAi. Co więcej, RNAi przeciwko podjednostce proteasomu RPN7 spowodowało znaczny wzrost ruchliwości PR50.
Kiedy dorosłe fenotypy analizowano za pomocą testu paraliżu zależnego od wieku, PR50 GFP wykazywał do 80% paraliżu do piątego dnia życia. Jednak RNAi skierowane na gen cul-6 znacznie opóźniło paraliż, co sugeruje, że cul-6 jest wymagany do toksyczności PR50 GFP. Aby ustalić, czy białka RAN powodują neuropatologię, gdy ulegają ekspresji w neuronach C. elegans, zbadano toksyczność specyficzną dla neuronów za pomocą testu spoidła.
W drugim dniu dorośli ekspresja PR50 GFP w neuronach ruchowych doprowadziła do znacznego wzrostu pęcherzyków neuronów ruchowych. Ta neuropatologia została znacznie stłumiona przez mutację w homologu genu receptora insuliny IGF DAF-2, która opóźnia toksyczne właściwości kilku białek neurodegeneracyjnych. W przypadku testu behawioralnego ważne jest, aby peptydy RAN wytwarzały wysoce penetrujący fenotyp.
Takie geny lub leki mogą dostarczyć nowych biomarkerów lub opcji terapeutycznych dla chorób peptydowych RAN. Korzystając z tych testów, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe RNAi całego genomu pod kątem supresorów związanego z C9ORF72 peptydu RAN proliny-argininy. Geny zidentyfikowane na tym ekranie obejmują wiele nowych i konserwatywnych genów, które będą przedmiotem przyszłych badań mechanistycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada toksyczność peptydów związanych z powtórzeniami, niezależnych od ATG (RAN), które są powiązane z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, przy użyciu organizmu modelowego C. elegans. Badania opisują protokół ilościowego określania toksyczności peptydów RAN za pomocą testów behawioralnych i komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Zaburzenia neurodegeneracyjne
- Toksyczność peptydów RAN
- Wykorzystanie C. elegans jako systemu modelowego
Tło
- Peptydy RAN są związane z chorobami takimi jak choroba Huntingtona, ALS i otępienie czołowo-skroniowe.
- Celem badania jest standaryzacja podejść do ilościowego określania toksyczności peptydów.
- Zrozumienie mechanizmów toksyczności jest kluczowe dla potencjalnych strategii terapeutycznych.
Stosowane metody
- Testy behawioralne do pomiaru ruchliwości i reprodukcji C. elegans
- Testy komórkowe do oceny ekspresji i toksyczności peptydów RAN
- Analiza prędkości wideo do pomiaru ruchu robaków
Główne wyniki
- Zcharakteryzowano fenotypy C. elegans w odpowiedzi na peptydy RAN
- Zidentyfikowano kluczowe zmienne wpływające na toksyczność peptydów RAN
- Zwalidowano metody testowe w celu zapewnienia spójności obserwacji
Wnioski
- Badanie przedstawia solidne metody do badania toksyczności peptydów RAN.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans provides a scalable, cost-effective platform for early-stage target validation in repeat expansion neurodegenerative diseases. The assay suite enables mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological interventions to quantifiable phenotypic outputs such as motility, growth, and neuronal morphology. This supports predictive confidence in lead identification and portfolio triage for ALS, Huntington’s disease, and related disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking gene knockdowns to suppression of RAN peptide-induced developmental toxicity and motility defects.
- Operational Value: Uses standardized RNAi feeding in C. elegans to systematically assess genetic modifiers of peptide toxicity across the genome.
- Predictive Value: Identifies suppressors of RAN peptide toxicity (e.g., cul-6, DAF-2) that inform target prioritization and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, normalized speed and length metrics from video analysis to enable reproducible, high-content assessment of compound or genetic effects on RAN peptide toxicity.
- Operational Value: Leverages the reproducibility of C. elegans locomotion and reproduction for low-cost, rapid screening in 24-well plate formats compatible with automation.
- Assay Readiness: Establishes Z-score–compatible readouts (e.g., normalized speed) suitable for large-scale genetic or small molecule screens to identify disease-modifying targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses neuron-specific commissure assay to model RAN peptide-induced neuropathology (e.g., motor neuron blebbing) in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Links toxicity modulation to conserved pathways (e.g., insulin/IGF signaling via DAF-2) with known relevance to human neurodegenerative disease mechanisms.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating targets across developmental, age-dependent, and cellular toxicity assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing phenotypic validation of targets identified from human genetics or CRISPR screens in repeat expansion disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how genetic perturbations affect RAN peptide toxicity in a multicellular organism.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative outputs via video-based motility analysis, facilitating reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Generates normalized speed and length data suitable for statistical comparison (e.g., one-way ANOVA with post-hoc testing) to evaluate hit significance.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through neuron morphology assays that model subcellular neuropathology relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple RAN peptide diseases (e.g., ALS, Huntington’s) using the same transgenic readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing toxic RAN peptide species and linking them to specific genetic or environmental modifiers.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined RNAi induction, temperature control, and blinded phenotypic scoring protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, in vivo evidence of target modulation on peptide toxicity, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance across developmental, age-dependent, and neurotoxicity assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi feeding, and transgenic strain maintenance.
- Dependent on standardized instrumentation for video acquisition (stereo dissecting microscope, monochrome camera) and analysis software for motion tracking.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions (e.g., temperature shifts, plate preparation, worm staging) to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending assays to different RAN peptide sequences or neuronal subtypes beyond motor neurons.
- Limited by the need for consistent RAN peptide expression and toxicity, which depends on precise control of induction timing and bacterial RNAi quality.
