Name: Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę RT-LAMP do szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake w tkankach ryb. Ta technika izotermicznej amplifikacji oferuje prostszą i szybszą alternatywę dla RT-PCR, wspierając kontrolę chorób w akwakulturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt jest finansowany finansowo przez grant Tajlandzkiego Funduszu Badawczego (TRF) numer RDG6050078 oraz Centrum Zaawansowanych Studiów nad Rolnictwem i Żywnością, Instytut Studiów Zaawansowanych, Uniwersytet Kasetsart, Bangkok, Tajlandia w ramach Projektu Promocji Badań Naukowych Szkolnictwa Wyższego i Narodowego Uniwersytetu Badawczego Tajlandii, Biuro Komisji Szkolnictwa Wyższego, Ministerstwo Edukacji, Tajlandia. Badania są częściowo wspierane przez stypendium Graduate Program Scholarship ze Szkoły Podyplomowej Uniwersytetu Kasetsart. Autorzy chcieliby podziękować dr Kwanrawee Sirikanchana za narrację mówiącą o filmie oraz Piyawatcharze Sikarin za montaż filmu.

Ten eksperyment, który obejmował użycie tkanek zwierzęcych, został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kasetsart, Bangkok, Tajlandia (numer protokołu ACKU61-VET-009).
1. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Eutanazja ryb tilapia przy użyciu przedawkowania olejku goździkowego (tj. więcej niż 3 ml / l). Metanosulfonian trikainy może być stosowany jako alternatywa dla olejku goździkowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczyków majonezowych rozciąć brzuch pośmiertnej tilapii i wyciąć około 30–50 mg tkanki wątroby lub za pomocą szkła mikroskopowego zebrać 100 μl śluzu, zeskrobując warstwę skóry ryby wzdłużnie (od przodu do tyłu) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Natychmiast przejść do etapu ekstrakcji RNA lub utrzymać pobraną próbkę w temperaturze -80 °C do czasu zakończenia eksperymentu. Ponieważ nienaruszone RNA jest bardziej wrażliwe niż DNA, podczas ekstrakcji RNA należy używać materiałów i odczynników wolnych od RNaz.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Aby wyekstrahować RNA z tkanki wątroby, dodaj 30-50 mg tkanki tilapii do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej 600-1,000 μl odczynnika do ekstrakcji kwasu guanidynowego i fenolu (tabela materiałów) i sproszkowaj próbkę do uzyskania jednorodności za pomocą ręcznego homogenizatora tkankowego. Próbki tkanek wymagają około 10% odczynnika do ekstrakcji kwasem guanidyny i fenolem. Do próbek śluzu należy użyć tylko 300 μl odczynnika do ekstrakcji fenolem kwasu guanidynowego (3:1). 
	UWAGA: Odczynnik do ekstrakcji kwasu guanidyny-fenolu jest toksyczny; W związku z tym obchodzenie się z nimi należy zachować ostrożność. Należy nosić sprzęt ochronny, taki jak okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną próbkę o masie 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i przenieść supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj równą objętość 95% etanolu do probówki i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Przenieść roztwór do kolumny wirowej (tabela materiałów) umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływ i przenieść kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 400 μl odczynnika RNA do płukania wstępnego (tabela materiałów) do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej przed odrzuceniem przepływu. Powtórz ten krok jeszcze raz. 
	UWAGA: Aby przygotować RNA Pre-Wash, dodaj 10 ml 95% etanolu do 40 ml koncentratu RNA Pre-Wash.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego RNA (tabela materiałów) do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść kolumnę do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Aby przygotować RNA Wash Buffer, dodaj 52 ml 95% etanolu do 12 ml koncentratu RNA Wash Buffer.</li>
	<li>Eluować próbkę RNA uchwyconą w matrycy kolumny wirowej za pomocą 100 μl wody wolnej od nukleaz i wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i rozcieńczyć RNA do żądanego stężenia za pomocą wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Kwalifikowana wartość absorbancji OD260/OD280 waha się od 1,6 do 1,9, co wskazuje na dopuszczalną czystość RNA dla testu RT-LAMP.</li>
	<li>Natychmiast przejść do następnego etapu lub przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Projekt podkładu
<ol>
	<li>Użyj Primer Explorer w wersji 4, aby zaprojektować konkretne podkłady dla RT-LAMP. Wejdź na stronę internetową, https://primerexplorer.jp/e/ i kliknij przycisk PrimerExplorer V4.</li>
	<li>Wybierz plik zawierający sekwencje segmentu 3 TiLV w formacie FASTA, a następnie kliknij przycisk Projekt podkładu. 
	UWAGA: Pobierz sekwencje w formacie FASTA z numeru dostępu KX631923 GenBank, który reprezentuje wirusa jeziora tilapia TV1 segment 31.</li>
	<li>Aby zaprojektować podkłady, wprowadź następujące podstawowe parametry: 
	- Zawartość GC 40%–60% 
	- Amplikon ≥280 par zasad (bp) 
	- Podobna temperatura topnienia (Tm) wśród podkładów z maksymalną różnicą 5 °C 
	UWAGA: Podkłady nie mogą się wzajemnie uzupełniać
	<ol>
		<li>Unikaj regionów sekwencji podatnych na tworzenie struktur drugorzędowych.</li>
		<li>Wybierz analizę starterów dimerowych z minimum -3,5, aby uzyskać optymalny projekt dla największego ΔG, i wybierz końce starterów z maksimum -4, aby uzyskać optymalny projekt dla mniejszego ΔG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk Generuj. 
	UWAGA: Po tym, jak oprogramowanie zakończy przetwarzanie danych wejściowych, zostaną wyświetlone wyniki startera (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Test RT-LAMP
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową RT-LAMP zawierającą 2,5 μL 1x buforu reakcyjnego SD II, 3 μL 6 mM MgSO4, 1,4 μL zestawu 1,4 mM dNTP, 4 μL 0,8 M betainy, 1,3 μL 0,052 mM mieszaniny kalceiny, 1 μL 1,6 μM startera TiLV-F3, 1 μl 1,6 μM startera TiLV-B3, 1 μL 0,2 μM startera TiLV-BIP, 1 μL 0,2 μM startera TiLV-FIP, 1 μL 0,3 μM polimerazy DNA Bst, 1 μL 0,1 U odwrotnej transkryptazy AMV i 3,8 μl wody wolnej od nukleaz na reakcję. 
	UWAGA: Przygotować nadmiar mieszanki wzorcowej stanowiący co najmniej 10% całkowitej objętości reakcji.</li>
	<li>Dozować 22 μl mieszanki wzorcowej RT-LAMP do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 litra.</li>
	<li>Dodać 3 μl wyekstrahowanego RNA do probówki reakcyjnej i wymieszać próbkę przez wirowanie. Do kontroli ujemnej należy użyć wody destylowanej zamiast materiałów RNA.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 65 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 80 °C przez 10 minut w celu zakończenia reakcji.</li>
	<li>Po inkubacji obserwuj wzrokowo zmiany kolorymetryczne gołym okiem. Pozytywny wynik pojawi się jako fluorescencyjny zielony kolor.</li>
</ol>
5. Elektroforeza w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Przygotuj 1,5% w/v żelu agarozowego, zawieszając 0,6 g proszku agarozy w 40 ml 1x buforu TAE. Rozpuść mieszaninę, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej przez 3–5 minut, aż agaroza całkowicie się rozpuści i zamieszaj, aby wymieszać.</li>
	<li>Pozwól agarozie ostygnąć, aż temperatura osiągnie 65 °C. Wlej 40 ml roztworu agarozy na tackę na żel i dodaj grzebień do formy żelowej.</li>
	<li>Pozostaw żel agarozowy do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 20–30 minut, aż całkowicie zastygnie. Następnie wyjmij grzebień i umieść żel w zbiorniku żelu.</li>
	<li>Dodaj bufor do biegania, aby pokryć powierzchnię żelu w zbiorniku żelu.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 10 μl próbki RT-LAMP i 2 μl 6-krotnego buforu ładującego żel. Dodać 5 μl drabinki DNA o wielkości 1 kb do toru odniesienia.</li>
	<li>Podłącz pokrywę przymocowaną do katody i anodę podłączoną do zasilacza. Włącz zasilanie, ustaw je na stałe 100 V i uruchom przez 40 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu oddzielania żelu wyjmij żel z tacki na żel. Następnie odsączony żel należy wybarwić bromkiem etydyny (EtBr) w stężeniu 10 mg/ml przez 7 minut i ponownie umieścić w wodzie destylowanej przez 5 min. 
	UWAGA: EtBr jest toksyczny i uważany za czynnik rakotwórczy; Dlatego należy zachować ostrożność podczas stosowania tego środka.</li>
	<li>Wystaw żel na działanie promieni UV za pomocą systemu dokumentacji żelu, w którym pojawiają się paski, i zrób zdjęcie żelu.</li>
</ol>
6. Komplementarna synteza DNA (cDNA)
<ol>
	<li>Przygotować główną mieszaninę syntezy cDNA zawierającą 2 μl 5x buforu RT, 0,5 μl mieszaniny starterów, 0,5 μl enzymu RT i 2 μl wody wolnej od nukleaz na reakcję. 
	UWAGA: Przygotować nadmiar mieszanki wzorcowej zawierający 1 x więcej niż reakcja spowodowana utratą potencjału podczas pipetowania.</li>
	<li>Dozować 5 μl mieszanki wzorcowej do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 100 ng rozcieńczonego wyekstrahowanego RNA (otrzymanego z kroku 2.8) do probówki reakcyjnej, wymieszać i odwirować, aby przesunąć całą mieszaninę na dno naczynia.</li>
	<li>Inkubować reakcje w temperaturze 42 °C przez 60 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 5 minut w maszynie do PCR. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
7. RT-qPCR
<ol>
	<li>Przygotować główną mieszaninę TiLV qPCR zawierającą 0,3 μl 10 μM startera odwrotnego, 0,3 μl startera 10 μM do przodu, 5 μl 2x polimerazy SYBR Green DNA i 0,4 μl wody wolnej od nukleaz na reakcję. Użyj następujących starterów i kontrolek: 
	Starter do przodu (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3' 
	Podkład odwrotny (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3'</li>
	<li>Dozować 6 μl głównej mieszanki TiLV qPCR do każdej studzienki paska qPCR zgodnego z zastosowanym termocyklerem działającym w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Dodaj 4 μl matrycy cDNA, kontroli ujemnej (woda wolna od nukleaz), kontroli pozytywnej (10 pg/μL) i pTiLV (plazmidu) 10 lub seryjnie rozcieńczonego plazmidu TiLV do studzienki i wymieszaj każdą próbkę, trzepiąc. Każdą próbkę należy pobrać w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Umieść reakcje qPCR w zaprogramowanym termocyklerze w czasie rzeczywistym. Ustawić program qPCR tak, aby przeprowadzał inkubację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s przed krokiem krzywej topnienia, w którym temperatura musi wzrosnąć z 65 °C do 95 °C w krokach co 0,5 °C/5 s.</li>
	<li>Przeprowadź analizę danych, oceniając krzywe amplifikacji i topnienia, a następnie oblicz liczbę kopii TiLV przy użyciu krzywej standardowej uzyskanej z danych przy użyciu seryjnie rozcieńczanych plazmidów.</li>
</ol>

<ol><li>Surachetpong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+Tilapia+Lake+Virus+Infection%2C+Thailand%2C+2015-2016%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).</li>
<li>Eyngor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+RNA+virus+lethal+to+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).</li>
<li>Adams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+to+taxonomy+and+the+International+Code+of+Virus+Classification+and+Nomenclature+ratified+by+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses+%282017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017).</a> Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).</li>
<li>Bacharach, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Novel+Orthomyxo-like+Virus+Causing+Mass+Die-Offs+of+Tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia.</a> MBio. 7 (2), 00431(2016).</li>
<li>Jaemwimol, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+important+warm+water+fish+species+to+tilapia+lake+virus+%28TiLV%29+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection.</a> Aquaculture. 497, 462-468 (2018).</li>
<li>Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiews%2C+F+%22Food+and+Agriculture+Organization+of+the+United+Nations%22">Food and Agriculture Organization of the United Nations</a>. , Rome, Italy. (2017).</li>
<li>Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Genome+Sequence+of+a+Tilapia+Lake+Virus+Isolate+Obtained+from+Nile+Tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus).</a> Genome Announcements. 6 (26), (2018).</li>
<li>Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+risk+of+tilapia+lake+virus+transmission+via+frozen+tilapia+fillets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).</li>
<li>Fathi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Tilapia+Lake+Virus+in+Egypt+in+Nile+tilapia+affected+by+%27summer+mortality%27+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome.</a> Aquaculture. 473, 430-432 (2017).</li>
<li>Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+reverse+transcription+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+tilapia+lake+virus+detection+in+clinical+samples+and+experimentally+challenged+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish.</a> Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).</li>
<li>Waiyamitra, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TaqMan+RT-qPCR+assay+for+tilapia+lake+virus+%28TiLV%29+detection+in+tilapia%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia.</a> Aquaculture. 497, 184-188 (2018).</li>
<li>Kembou Tsofack, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Tilapia+Lake+Virus+in+Clinical+Samples+by+Culturing+and+Nested+Reverse+Transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).</li>
<li>Dong, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+tilapia+lake+virus+in+Thailand+and+an+alternative+semi-nested+RT-PCR+for+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection.</a> Aquaculture. 476, 111-118 (2017).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+a+rapid%2C+accurate%2C+and+cost-effective+diagnostic+method+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+a+fish+iridovirus+using+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).</li>
<li>Soliman, H., El-Matbouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+and+rapid+diagnostic+method+of+Koi+Herpesvirus+%28KHV%29+infection+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification.</a> Virology Journal. 2, 83(2005).</li>
<li>Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+koi+herpesvirus+in+common+carp%2C+Cyprinus+carpio+L.%2C+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).</li>
<li>Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop+mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+method+for+detection+of+infectious+hematopoietic+necrosis+virus+%28IHNV%29+in+rainbow+trout+%28Oncorhynchus+mykiss%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).</a> Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).</li>
<li>Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+white+spot+syndrome+virus+in+shrimp+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).</li>
<li>Soliman, H., El-Matbouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+for+rapid+detection+of+viral+hemorrhagic+septicaemia+virus+%28VHS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS).</a> Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).</li>
<li>Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+rapid+detection+of+channel+catfish+Ictalurus+punctatus+important+bacterial+pathogen+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).</li>
<li>Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+Flavobacterium+columnare+in+channel+catfish+Ictalurus+punctatus+by+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method.</a> Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).</li>
<li>Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+infectious+hypodermal+and+hematopoietic+necrosis+virus+%28IHHNV%29+in+shrimps+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).</li>
<li>Shivappa, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+spring+viraemia+of+carp+virus+%28SVCV%29+by+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+in+koi+carp%2C+Cyprinus+carpio+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L.</a> Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).</li>
<li>Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+detection+of+Aeromonas+caviae+in+stool+samples+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).</li>
<li>Chinabut, S., Puttinaowarat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+disease+control+strategies+to+secure+international+market+access+for+aquaculture+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products.</a> Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).</li>
<li>Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Tilapia+Lake+Virus+to+buffered+Povidone-iodine+complex+and+chlorine%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine.</a> Aquaculture. 512, 734342(2019).</li>
<li>Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virucidal+effects+of+common+disinfectants+against+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).</li>
<li>Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tilapia+lake+virus%3A+a+threat+to+the+global+tilapia+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry.</a> Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+rapid+reverse+transcription-loopmediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+assay+for+sensitive+detection+of+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).</li>
<li>Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+an+emerging+technology+for+detection+of+fish+and+shellfish+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens.</a> Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).</li>
<li>Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+tilapia+lake+virus+using+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.</a> Aquaculture. 507, 35-39 (2019).</li>
<li>Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+sampling+for+Tilapia+Lake+Virus+detection+by+RT-qPCR+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture.</a> Aquaculture. 486, 75-80 (2018).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+and+rapid+reverse+transcription-loopmediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+assay+for+sensitive+detection+of+tilapia+lake+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus.</a> Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).</li>
<li>Khan, R. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+infectious+bursal+disease+by+loop-mediated+isothermal+amplification+for+field+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis.</a> Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+amplicon+length+on+real-time+PCR+results%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%2C+Agronomy%2C+Society+and+Environment%22%5BJournal%5D)">The influence of amplicon length on real-time PCR results.</a> Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Branża akwakultury jest stale zagrożona infekcjami wirusowymi, które powodują znaczne straty ekonomiczne 9,23,28. Na przykład pojawiający się TiLV stanowi poważne zagrożenie dla krajów produkujących tilapię w wielu częściach świata 1,6,9. Do tej pory nie było dostępnych specyficznych terapii zapobiegających TiLVD. Chociaż prace nad szcz...

Choroba wirusowa jeziora Tilapia (TiLVD) jest chorobą wirusową tilapii (Oreochromis spp.), która podobno powoduje zgony tilapii w wielu regionach świata, w tym w Azji1,2, Afryce i Ameryce. Choroba została po raz pierwszy rozpoznana podczas masowej śmiertelności tilapii w 2009 roku w Izraelu, gdzie liczba dzikich tilapii w jeziorze Kinneret gwałtownie spadła z 257 do 8 ton rocznie2. Choroba jest wywoływana przez wirusa jeziora tilapii (TiLV), który został przypisany do rodziny Amnoonviridae jako nowy rodzaj Tilapinevirus i nowy gatunek Tilapia tilapinevirus3. Charakterystyka genetyczna TiLV wykazała, że wirus jest nowym otoczkowym, jednoniciowym wirusem RNA, który ma 10 segmentów kodujących 10 białek1,2,4. Wykazano, że różne gatunki tilapii z rodzaju Sarotherodon, Oreochromis i Tilapine oraz inne ryby ciepłowodne (np. gigantyczne gourami (Osphronemus goramy)) są podatne na TiLV2,5. Obecnie wirus ten nadal rozprzestrzenia się na całym świecie, prawdopodobnie poprzez przemieszczanie się zakażonych żywych ryb6,7, podczas gdy ryzyko przeniesienia wirusa przez zamrożoną tilapię lub jej produkt jest ograniczone8. Znaczna śmiertelność z powodu zakażenia TiLV może mieć znacznie szkodliwy wpływ ekonomiczny na przemysł tilapii. Na przykład wpływ ekonomiczny syndromu letniej śmiertelności w Egipcie związanego z zakażeniem TiLV obliczono na 100 milionów USD9. W związku z tym ważne jest opracowanie szybkiej i właściwej metody diagnostycznej, aby ułatwić zwalczanie tej choroby w gospodarstwach rybnych.
Do tej pory diagnoza TiLVD opierała się na testach molekularnych, izolacji wirusa i histopatologii. Opracowano różne protokoły PCR i startery do diagnozowania TiLV10,11. Na przykład opracowano i zwalidowano metodę SYBR z zieloną metodą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) o czułości pozwalającej na wykrycie zaledwie dwóch kopii/μl wirusa, która została zatwierdzona i zwalidowana pod kątem wykrywania TiLV10. Inne metody PCR do wykrywania TiLV obejmują ilościowe metody wykrywania TiLV TaqMan ilościowe PCR11, RT-PCR2, zagnieżdżone RT-PCR12 i częściowo zagnieżdżone RT-PCR13. Jednak metody te wymagają zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego i stosunkowo długiego czasu na uzyskanie wyników ze względu na złożoność reakcji, co sprawia, że nie nadają się do zastosowań w terenie.
Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jest szybkim, prostym i praktycznym zastosowaniem w terenie14,15. Technika ta wykorzystuje zasadę reakcji przemieszczenia nici, podczas gdy reakcja amplifikacji przebiega w warunkach izotermicznych bez wyrafinowanego i drogiego termocyklera14,15. W związku z tym wzmocnione produkty LAMP lub produkty RT-LAMP są analizowane w pasmach przypominających drabinki przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym z barwnikiem fluorescencyjnym w celu bezpiecznej wizualizacji DNA lub RNA14 lub obserwacji gołym okiem pod kątem obecności zmętnienia lub białego osadu16,17,18. Z tych powodów technika ta została wykorzystana do wykrywania na miejscu różnych patogenów ryb17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Celem tego badania było ustanowienie szybkiego, czułego i dokładnego testu RT-LAMP do wykrywania TiLV. Test RT-LAMP umożliwia badanie przesiewowe w kierunku TiLV w próbkach ryb w ciągu 30 minut. Technika ta może być stosowana do diagnozowania i monitorowania TiLVD.

<table><tbody><tr><td> Kolekcja tkanek: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olejek goździkowy</td><td>Better Pharma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Alternatywna opcja dla ekstrakcji RNA olejku goździkowego</td></tr><tr><td>:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kwaśny odczynnik na bazie guanidyny-fenolu (odczynnik TRIzol)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>Odczynnik na bazie kwaśnego guanidyny-fenolu (odczynnik GENEzol)</td> <td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Direct-zol RNA:</td> <td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>- Bezpośrednie mycie RNA PreWash</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Bufor</td><td></td><td></td><td></td> do płukania RNA</tr>- <tr><td>Woda wolna</td><td></td><td></td><td></td> od DNazy/RNazów</tr><tr><td>- Kolumny</td> <td>Zymo-spin IIICG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Probówki zbiorcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RT-LAMP:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x bufor reakcyjny SD II</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>zestaw dNTP</td><td>Bioline</td><td>BIO-39053</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2629</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina kalceiny</td><td>Merck</td><td>1461-15-0</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Bst</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>odwrotna transkryptaza AMV</td><td>Promega</td><td>M510A</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td></td> Inkubator do suchej kąpieli <td>Invitrogen</td> 10320995 <td></td></tr><tr><td>Elite, pojedyncza jednostka</td><td>Major Science</td><td>EL-01-220</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza żelowa:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC0701-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor tris-boranowo-EDTA (TBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0062</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-octowo-EDTA (TAE):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Tris</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PR0612-1KG</td><td></td></tr><tr><td>- Kwas octowy (lodowaty), EMSURE</td><td>Merck Millipore</td><td></td> 1000632500-disodowy <td></td></tr><tr><td>etylenodiaminotetraoctan dwuwodny (EDTA), Vetec</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800170-500G</td><td></td></tr><tr><td>Neogreen</td><td>NeoScience Co., Ltd.</td><td>GR107</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6X)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka i markery DNA</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC701-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ready Sub-Cell GT (system elektroforezy poziomej)</td><td>Zasilacz Bio-Rad</td><td>1704487</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Tacka na próbki UV</td><td>Bio-Rad</td><td>1708271</td><td></td></tr><tr><td>N&alfa; Obrazowanie BI</td><td>Neogene Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cSynteza cDNA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Kit</td><td>Toyobo</td><td>FSQ-101</td><td></td></tr><tr><td>Viva cDNA Synthesis Kit</td><td>Vivantis Technologies</td><td>cDSK01</td><td>Alternatywna opcja syntezy cDNA</td></tr><tr><td>NanoDrop2000 (spektrofotometr mikroobjętościowy)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725120</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz, sterylna MultiCell</td><td></td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>8-tubkowe paski PCR, białe</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0851</td><td></td></tr><tr><td>Płaska tuba do PCR 8 pasków, optyczna</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Ogólne wyposażenie i materiały:</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo Nożyczki</td><td></td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Vortex Genie 2 (mieszalnik wirów)</td><td>Naukowy Branże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka LM-60</td><td>LioFuge</td><td>CM610</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE mini mikrowirówka</td><td>Corning</td><td>6765</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Rainin</td><td>Pipete-Lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>QSP z filtrem Końcówki do pipet</td> Jakość <td>Scientific Plastics</td><td>Seria</td><td></td>TF</tr><tr><td>Końcówki filtrowane Corning Isotip</td> Seria <td></td><td></td><td>Merck CLS</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml bez nukleaz, NEST</td><td>Wuxi NEST Biotechnology</td><td>615601</td><td></td></tr></tbody></table>

test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (rt-lamp) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa tilapia lake

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

Choroba wirusa jeziora Tilapia (TiLVD), pojawiająca się choroba wirusowa w tilapii wywołana przez wirusa jeziora tilapia (TiLV), jest stałym wyzwaniem w branży akwakultury, które doprowadziło do masowej zachorowalności i śmiertelności tilapii w wielu częściach świata. Skuteczny, szybki i dokładny test diagnostyczny w kierunku zakażenia TiLV jest zatem niezbędny do wykrycia początkowej infekcji i zapobieżenia rozprzestrzenianiu się choroby w hodowli akwakultury. W niniejszej pracy przedstawiono wysoce czułą i praktyczną metodę amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) w celu wykrycia wirusa jeziora tilapia w tkance ryb. Porównanie testów RT-qPCR i RT-LAMP zakażonych próbek wykazało pozytywne wyniki odpowiednio w 63 (100%) i 51 (80,95%) próbkach. Co więcej, analiza niezakażonych próbek wykazała, że wszystkie 63 niezakażone tkanki dały negatywne wyniki zarówno w testach RT-qPCR, jak i RT-LAMP. Reaktywność krzyżową z pięcioma patogenami tilapii oceniono za pomocą RT-LAMP, a wszystkie testy wykazały wyniki negatywne. Zarówno próbki wątroby, jak i śluzu uzyskane od zakażonych ryb wykazały porównywalne wyniki przy użyciu metody RT-LAMP, co sugeruje, że śluz może być stosowany w RT-LAMP jako test nieletalny, aby uniknąć zabijania ryb. Podsumowując, uzyskane wyniki wykazały, że zaprezentowany test RT-LAMP stanowi skuteczną metodę wykrywania TiLV w tkance tilapii w ciągu 1 godziny. Metoda ta jest zatem zalecana jako narzędzie przesiewowe w gospodarstwach rolnych w celu szybkiej diagnozy TiLV.

W niniejszym badaniu opracowano test RT-LAMP w celu wykrywania zakażenia TiLV u tilapii. Badane próbki pobrano z 14 farm zlokalizowanych w różnych częściach Tajlandii w latach 2015–2016. Ryby zakażone i niezakażone pogrupowano pierwotnie na podstawie diagnozy fizycznej oraz wystąpienia objawów TiLVD. Zakażenie TiLV potwierdzono następnie za pomocą RT-PCR po procesie pobierania próbek. Jako metody oceny produktów amplifikacji LAMP wybrano elektroforezę w żelu agarozowym oraz detekcję luminescencyjnego zielonego koloru (<s...

Prezentujemy test RT-LAMP do wykrywania TiLV u ryb tilapia za pomocą prostych narzędzi w stosunkowo krótkim okresie czasu w porównaniu do konwencjonalnych technik RT-PCR. Protokół ten może pomóc w kontrolowaniu rozprzestrzeniania się epidemii TiLVD, zwłaszcza w krajach rozwijających się.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

Wirus jeziora Tilapia jest nowym wirusem i zakaźnymi patogenami, które powodują wysoką śmiertelność tilapii i jej gatunków hybrydowych. Ponieważ tilapia jest głównym źródłem białka dla wielu krajów rozwijających się, nowa infekcja wirusowa ma ogromny wpływ na akwakulturę tilapii, a także zagraża światowemu bezpieczeństwu żywnościowemu. Opracowanie szybkiej, dokładnej i czułej metody wykrywania wirusa w tkance ryb pomoże w kontroli choroby i zmniejszeniu wpływu wirusa.W tym filmie pokażemy amplifikację izotermiczną za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji lub test RT-LAMP do szybkiego wykrywania wirusa jeziora tilapia w próbkach ryb. Część druga, ekstrakcja RNA. Najpierw dodaj 3250 miligramów tkanki wątroby do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, zawierającej od 600 do 1000 mikrolitrów odczynnika na bazie kwasowej guanidyny-fenolu i zmiel do uzyskania jednorodności.Wirować przy 10 000 RCF przez 30 sekund i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj równą objętość 95% etanolu do probówki i dokładnie wymieszaj. Przenieść roztwór do kolumny wirowej, umieścić w probówce zbiorczej, a następnie odwirować przy 10 000 RCF przez 30 sekund.Odrzucić przepływ i przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej. Dodaj 400 mikrolitrów RNA PreWash do kolumny i odwiruj przy 10 000 RCF przez 30 sekund. Odrzuć przepływ i powtórz ten krok.Dodaj 700-mikrolitrowy bufor płuczący RNA do kolumny i odwiruj przy 10 000 RCF przez dwie minuty. Następnie przenieś kolumnę do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Na koniec eluuj RNA do matrycy kolumny za pomocą 100-mikrolitrowej wody wolnej od nukleaz i odwiruj przy 10 000 RCF przez 30 sekund.Część trzecia, projekt podkładu. PrimerExplorer Version 4 jest najpopularniejszym narzędziem bioinformatycznym do projektowania wydajnych starterów LAMP lub RT-LAMP, w których dobre instrukcje do oprogramowania są dostępne na ich stronie internetowej. W tym przypadku cztery specyficzne startery, składające się z dwóch wewnętrznych i dwóch zewnętrznych starterów, zostały zaprojektowane w celu rozpoznania sześciu odrębnych regionów w segmencie 3 TiLV, pochodzącym z Tajlandii.Po wejściu na stronę, na której link jest pokazany na filmie, kliknij na PrimerExplorer V4. Wybierz plik zawierający sekwencję segmentu 3 TiLV w formacie FASTA pobraną z numeru dostępowego KX631923 lub wirusa jeziora tilapia TV1 segmentu 3, a następnie kliknij przycisk Projekt podkładu. Po kliknięciu przycisku Generuj oprogramowanie przetworzy oprogramowanie, a wyniki zostaną wyświetlone. Po zoptymalizowaniu sekwencji pod kątem amplifikacji LAMP, w sumie do tego badania wybrano jedną parę starterów zewnętrznych i dwie pary starterów wewnętrznych, aby wykryć infekcję TiLV.Ten zestaw podkładów jest pokazany tutaj. Część czwarta, demonstracja RT-LAMP. Główna mieszanka dla RT-LAMP specyficzna dla wirusa jeziora tilapia składa się z następujących substancji chemicznych.Przygotuj mieszankę wzorcową, używając substancji chemicznych podanych w tabeli. Dozuj 22 mikrolitry mieszanki wzorcowej do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj trzy mikrolitry matrycy RNA do probówki reakcyjnej.Do kontroli ujemnej użyj wody destylowanej zamiast materiałów RNA i dobrze wymieszaj. Inkubuj reakcje w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji przez 30 minut zmiany kalorymetryczne są widoczne gołym okiem.W razie potrzeby możemy potwierdzić wyniki testu RT-LAMP, wykonując elektroforezę żelową na 1,5% żelu agarozowym, działającym ze stałą 100 woltów, przez 40 minut, przy czym drabinka DNA o wielkości cząsteczkowej o wielkości jednej kilozasady jest ładowana jako marker w celu określenia wielkości fragmentu. Część piąta, reprezentatywne wyniki i interpretacja. Po inkubacji przez 30 minut, reakcja fluorescencji ziarna sugerująca dodatnią amplifikację TiLV w tkankach ryb, była oczywiście obserwowana w zakażonych próbkach pod wpływem światła UV o długości fali 365 nanometrów, podczas gdy te z kontroli ujemnej miały klarowny i lekko bezbarwny roztwór.Odpowiednio, amplifikacja produktów RT-LAMP została potwierdzona w elektroforezie w żelu agarozowym, wykazując różne rozmiary wielokrotnych amplifikacji powtórzeń odwróconego DNA, tworzących struktury pętli macierzystej pod lampą UV w próbkach zakażonych TiLV, podczas gdy w studzienkach kontroli ujemnej nie wykazano prążków, gdzie wyniki były zgodne z wynikami testu RT-LAMP. Tak więc, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa jeziora tilapia, jednym z ważnych kluczy jest natychmiastowe badanie przesiewowe tych zakażonych ryb przy użyciu skutecznej metody diagnostycznej. Tak więc nowo opracowany test RT-LAMP powinien stanowić szybkie i czułe narzędzie diagnostyczne, które będzie stosowane w procesie środków bezpieczeństwa biologicznego.Test może być stosowany zarówno w laboratorium, jak i w obiektach na miejscu. Mamy nadzieję, że metoda zostanie wdrożona do badań przesiewowych populacji zakażonych ryb, co może doprowadzić do ograniczenia rozprzestrzeniania się wirusa jeziora tilapia.

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Domesle, K. J. i in. Pętlowane wzmacnianie izotermiczne do wykrywania salmonelli w karmach zwierzęcych i potwierdzania izolacji salmonelli w hodowli kulturowej.  J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje technikę amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) do wykrywania docelowego genu bakteryjnego poprzez amplifikację DNA w stałej temperaturze. Mieszanina reakcyjna przygotowuje się poprzez dodanie izotermicznej mieszanki głównej, specyficznych starterów dla docelowego genu oraz próbek...

Pętlowa amplifikacja izotermiczna do wykrywania genów bakteryjnych

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ten protokół zapewnia skuteczną i tanią metodę wykrywania wirusa Zika lub celów kontrolnych w próbkach ludzkiego moczu i surowicy lub u komarów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda nie wymaga izolacji RNA i można ją wykonać w ciągu 30 minut.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) dla wirusa Zika i genów porządkowych w próbkach moczu, surowicy i komarów

Ten protokół diagnozuje wirusa Tilapia Lake (TiLV) w tkankach tilapii za pomocą metodologii RT-PCR. Cała metoda jest opisana od rozwarstwienia tkanek do całkowitej ekstrakcji RNA, a następnie syntezy cDNA i wykrywania TiLV za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR przy użyciu dsDNA wiążącego fluorescencyjny barwnik wiążący.

Wykrywanie wirusa Tilapia Lake za pomocą konwencjonalnego RT-PCR i SYBR Green RT-qPCR

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Poznaj metodę RT-LAMP do szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake w tkankach ryb. Ta technika izotermicznej amplifikacji oferuje prostszą i szybszą alternatywę dla RT-PCR, wspierając kontrolę chorób w akwakulturze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake (Wideo) | JoVE Journal

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake

Przeglądaj więcej filmów