Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) do specyficznego i szybkiego wykrywania wirusa Tilapia Lake

Wirus jeziora Tilapia jest nowym wirusem i zakaźnymi patogenami, które powodują wysoką śmiertelność tilapii i jej gatunków hybrydowych. Ponieważ tilapia jest głównym źródłem białka dla wielu krajów rozwijających się, nowa infekcja wirusowa ma ogromny wpływ na akwakulturę tilapii, a także zagraża światowemu bezpieczeństwu żywnościowemu. Opracowanie szybkiej, dokładnej i czułej metody wykrywania wirusa w tkance ryb pomoże w kontroli choroby i zmniejszeniu wpływu wirusa.

W tym filmie pokażemy amplifikację izotermiczną za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji lub test RT-LAMP do szybkiego wykrywania wirusa jeziora tilapia w próbkach ryb. Część druga, ekstrakcja RNA. Najpierw dodaj 3250 miligramów tkanki wątroby do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki, zawierającej od 600 do 1000 mikrolitrów odczynnika na bazie kwasowej guanidyny-fenolu i zmiel do uzyskania jednorodności.

Wirować przy 10 000 RCF przez 30 sekund i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj równą objętość 95% etanolu do probówki i dokładnie wymieszaj. Przenieść roztwór do kolumny wirowej, umieścić w probówce zbiorczej, a następnie odwirować przy 10 000 RCF przez 30 sekund.

Odrzucić przepływ i przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej. Dodaj 400 mikrolitrów RNA PreWash do kolumny i odwiruj przy 10 000 RCF przez 30 sekund. Odrzuć przepływ i powtórz ten krok.

Dodaj 700-mikrolitrowy bufor płuczący RNA do kolumny i odwiruj przy 10 000 RCF przez dwie minuty. Następnie przenieś kolumnę do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Na koniec eluuj RNA do matrycy kolumny za pomocą 100-mikrolitrowej wody wolnej od nukleaz i odwiruj przy 10 000 RCF przez 30 sekund.

Część trzecia, projekt podkładu. PrimerExplorer Version 4 jest najpopularniejszym narzędziem bioinformatycznym do projektowania wydajnych starterów LAMP lub RT-LAMP, w których dobre instrukcje do oprogramowania są dostępne na ich stronie internetowej. W tym przypadku cztery specyficzne startery, składające się z dwóch wewnętrznych i dwóch zewnętrznych starterów, zostały zaprojektowane w celu rozpoznania sześciu odrębnych regionów w segmencie 3 TiLV, pochodzącym z Tajlandii.

Po wejściu na stronę, na której link jest pokazany na filmie, kliknij na PrimerExplorer V4. Wybierz plik zawierający sekwencję segmentu 3 TiLV w formacie FASTA pobraną z numeru dostępowego KX631923 lub wirusa jeziora tilapia TV1 segmentu 3, a następnie kliknij przycisk Projekt podkładu. Po kliknięciu przycisku Generuj oprogramowanie przetworzy oprogramowanie, a wyniki zostaną wyświetlone. Po zoptymalizowaniu sekwencji pod kątem amplifikacji LAMP, w sumie do tego badania wybrano jedną parę starterów zewnętrznych i dwie pary starterów wewnętrznych, aby wykryć infekcję TiLV.

Ten zestaw podkładów jest pokazany tutaj. Część czwarta, demonstracja RT-LAMP. Główna mieszanka dla RT-LAMP specyficzna dla wirusa jeziora tilapia składa się z następujących substancji chemicznych.

Przygotuj mieszankę wzorcową, używając substancji chemicznych podanych w tabeli. Dozuj 22 mikrolitry mieszanki wzorcowej do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj trzy mikrolitry matrycy RNA do probówki reakcyjnej.

Do kontroli ujemnej użyj wody destylowanej zamiast materiałów RNA i dobrze wymieszaj. Inkubuj reakcje w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji przez 30 minut zmiany kalorymetryczne są widoczne gołym okiem.

W razie potrzeby możemy potwierdzić wyniki testu RT-LAMP, wykonując elektroforezę żelową na 1,5% żelu agarozowym, działającym ze stałą 100 woltów, przez 40 minut, przy czym drabinka DNA o wielkości cząsteczkowej o wielkości jednej kilozasady jest ładowana jako marker w celu określenia wielkości fragmentu. Część piąta, reprezentatywne wyniki i interpretacja. Po inkubacji przez 30 minut, reakcja fluorescencji ziarna sugerująca dodatnią amplifikację TiLV w tkankach ryb, była oczywiście obserwowana w zakażonych próbkach pod wpływem światła UV o długości fali 365 nanometrów, podczas gdy te z kontroli ujemnej miały klarowny i lekko bezbarwny roztwór.

Odpowiednio, amplifikacja produktów RT-LAMP została potwierdzona w elektroforezie w żelu agarozowym, wykazując różne rozmiary wielokrotnych amplifikacji powtórzeń odwróconego DNA, tworzących struktury pętli macierzystej pod lampą UV w próbkach zakażonych TiLV, podczas gdy w studzienkach kontroli ujemnej nie wykazano prążków, gdzie wyniki były zgodne z wynikami testu RT-LAMP. Tak więc, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa jeziora tilapia, jednym z ważnych kluczy jest natychmiastowe badanie przesiewowe tych zakażonych ryb przy użyciu skutecznej metody diagnostycznej. Tak więc nowo opracowany test RT-LAMP powinien stanowić szybkie i czułe narzędzie diagnostyczne, które będzie stosowane w procesie środków bezpieczeństwa biologicznego.

Test może być stosowany zarówno w laboratorium, jak i w obiektach na miejscu. Mamy nadzieję, że metoda zostanie wdrożona do badań przesiewowych populacji zakażonych ryb, co może doprowadzić do ograniczenia rozprzestrzeniania się wirusa jeziora tilapia.