Name: Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metodę immunolokalizacji fluorescencyjnej białek arabinogalaktanu i pektyn w ścianach komórkowych roślin. Technika ta umożliwia precyzyjne wykrywanie i wizualizację polimerów komórkowych w różnych gatunkach roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy otrzymali wsparcie od unijnego projektu 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) finansowanego przez H2020-MSCA-RISE-2015 i SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP otrzymał grant z projektu Unii Europejskiej MSCA-IF-2016 (nr 753328). MC otrzymał grant z FCT PhD GRANT SFRH/BD/111781/2015.

1. Przygotowanie próbki: utrwalanie, odwadnianie i zatapianie LR-White
<ol>
	<li>Utrwalenie i odwodnienie 
	UWAGA: Proces utrwalania ma kluczowe znaczenie dla zachowania próbki; Poprzez sieciowanie cząsteczek metabolizm komórkowy zostaje zatrzymany, zapewniając integralność komórkową i zapobiegając dyfuzji molekularnej. Utrwalacze i stosowane stężenie muszą być dostosowane do tego celu, pozostawiając antygeny wystarczająco narażone, aby mogły oddziaływać z przeciwciałami. Poniższy protokół łączy łagodną zdolność utrwalania paraformaldehydu z silniejszym działaniem aldehydu glutarowego. Ich proporcje zostały zoptymalizowane pod kątem AGP i składników ściany komórkowej, ale nadaje się do innych białek i struktur komórkowych. Późniejszy proces odwadniania przygotuje próbki do zatopienia LR-White. W tym eksperymencie wykorzystano tkanki roślinne z kilku gatunków roślin. Próbki Quercus suber pobrano z drzew rosnących na polu. Próbki Trithuria submersa zostały nam uprzejmie udostępnione przez Paulę Rudall (Kew Gardens, Londyn, Wielka Brytania).
	<ol>
		<li>Wysiewaj wszystkie rośliny rzodkiewnika bezpośrednio na glebę i uprawiaj w pomieszczeniu o wilgotności względnej 60% i cyklu dzień/noc z 16-godzinnym światłem w temperaturze 21 °C i 8-godzinnym zaciemnieniem w temperaturze 18 °C. Wybierz tkanki roślinne do analizy i przycinaj próbki tak, aby nie przekraczały 16mm2.</li>
		<li>Natychmiast przenieść próbkę do szklanej fiolki uprzednio wypełnionej wystarczającą ilością zimnego roztworu utrwalającego (2% formaldehydu (w/v), 2,5% aldehydu glutarowego (w/v), 25 mM RURY pH 7 i 0,001% Tween-20 (v/v)) aby całkowicie zanurzyć próbki (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Formaldehyd i aldehyd glutarowy są środkami utrwalającymi, które mogą być szkodliwe przez wdychanie i kontakt. Wykonać etap mocowania na dygestorium i nosić odpowiednią odzież ochronną oraz rękawice nitrylowe. Wszystkie roztwory począwszy od tego etapu, w tym serie alkoholowe do 70%, powinny być przechowywane w celu późniejszej dekontaminacji przez wyspecjalizowany personel.</li>
		<li>Po zebraniu wszystkich próbek odświeżyć utrwalacz.</li>
		<li>Przenieść fiolki do komory próżniowej i powoli stosować podciśnienie. Po osiągnięciu -60 kPa unoszący się materiał zacznie opadać na dno fiolki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Przechowywać w próżni nie wyższej niż -80 kPa przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powoli uwolnić próżnię, zamknąć szklaną fiolkę i umieścić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć wszystkie próbki, które nie zatonęły podczas utrwalania przez noc. Przemywać pozostałe próbki 25 mM PBS o pH 7 przez 10 minut, a następnie przemywać przez 20 minut w 25 mM PIPES buforze o pH 7,2.</li>
		<li>Odwodnić próbki w serii etanolu (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% i 3 x 100% etanolu) przez 20 minut każda. Natychmiast przenieś odwodnione próbki do oznakowanych szklanych fiolek w celu zatopienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). 
		UWAGA: Proces odwadniania można wstrzymać na etapie 70% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LR-White zatapianie żywicy 
	UWAGA: LR-white to niehydrofobowa żywica akrylowa o niskiej lepkości, dzięki czemu idealnie nadaje się do penetracji tkanek z wieloma grubymi warstwami ścian komórkowych. LR-White jest również dostępny w kilku klasach twardości kompatybilnych z cięciem większości próbek roślin. Upewnij się, że zużyta żywica jest już dostarczona z domieszką odpowiedniego katalizatora lub postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby przygotować żywicę. Następujący proces osadzania jest powolny, ale wyniki w znacznym stopniu uzasadniają środki.
	<ol>
		<li>Próbki należy przetapiać przez inkubację z żywicą LR-White w serii półksiężycowych zatężeń żywicy (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) w etanolu, inkubując przez 24 godziny w temperaturze 4 °C na każdym etapie. 
		UWAGA: Żywica LR-White jest żywicą akrylową o niskiej toksyczności; Może jednak działać drażniąco na skórę przez kontakt i wdychanie. Zdecydowanie zaleca się pracę w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem z odpowiednią odzieżą ochronną i rękawicami nitrylowymi.</li>
		<li>Odświeżyć białą żywicę LR i inkubować przez dodatkowe 12 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj kapsułki żelatynowe o odpowiednim rozmiarze (rozmiar 1 (0,5 ml) dla próbek do 3 mm, 2 x 0,37 ml dla próbek do 5 mm lub 3 x 0,3 ml dla próbek do 8 mm oraz etykiety papierowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
		UWAGA: Wybierz rozmiar kapsułki tak, aby był nieco większy niż próbka, tak aby próbka mogła być całkowicie zamknięta w żywicy. Pamiętaj również, aby oznaczyć metki ołówkiem, ponieważ długopis lub drukowane atramenty zanieczyszczą żywicę, niszcząc próbkę.</li>
		<li>Nałóż jedną kroplę świeżej żywicy LR-white na dno każdej kapsułki.</li>
		<li>Umieścić próbkę w każdej kapsułki żelatynowej i napełnić do maksymalnej pojemności świeżą żywicą. Umieść nakrętkę kapsułki i delikatnie dociśnij, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Polimeryzować żywicę przez 24 do 48 godzin w temperaturze 58 °C lub do całkowitego stwardnienia.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Żywica LR-white po polimeryzacji jest obojętna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie slajdów
UWAGA: Szkiełka muszą być czyste, wolne od kurzu, tłuszczu czy innych zanieczyszczeń. Nawet nowe prowadnice muszą być czyszczone, ponieważ niektórzy dostawcy używają olejów i detergentów, aby zapobiec sklejaniu się prowadnic. Jakikolwiek smar lub detergent będzie zakłócał przyleganie sekcji do prowadnicy, nawet jeśli zostanie potraktowany poli-L-lizyną. Kłaczki i kurz wpłyną na obserwacje okazu i bardzo możliwe, że zrujnują eksperyment. Do tego zadania doskonale nadają się szkiełka pokryte teflonem z dołkami reakcyjnymi. Są niedrogie, wielokrotnego użytku i drastycznie zmniejszają ilość potrzebnego roztworu przeciwciał. Przy odpowiednim czyszczeniu można przeprowadzić doskonałej jakości immunolokalizację fluorescencyjną w bardzo przystępnej cenie.
<ol>
	<li>Mycie szkiełek
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w stojaku do barwienia i przykryj roztworem czyszczącym (0.1% SDS (w/v), 1% kwas octowy (v/v), 10% etanol (v/v)).</li>
		<li>Utrzymywać łagodne pobudzenie przez 20 min.</li>
		<li>Przenieść ruszty barwiące do łaźni ddH2O z łagodnym mieszaniem przez 10 minut. Powtórzyć 4 razy.</li>
		<li>Ostrożnie opróżnij stojaki przed zanurzeniem na krótko w 100% etanolu i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w środowisku wolnym od kurzu.</li>
		<li>Przechowywać do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka poli-L-lizynowa (opcjonalnie) 
	UWAGA: Małe sekcje zwykle bardzo dobrze przylegają do czystych szkiełek szkiełkowych. Ten krok jest zalecany tylko w przypadku większych przekrojów (>2 mm2). Większe sekcje mają tendencję do fałdowania się i marszczenia i nie są wskazane. Niemniej jednak, w razie potrzeby, należy stosować szkiełka reakcyjne z większymi otworami. Wyczyść je jak powyżej i postępuj w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Umieść czyste szkiełka na kwadratowej szalce Petriego. Odpipetować 0,001% roztwór poli-L-lizyny (w/v), aby zakryć otwory szkiełek, bez przelewania.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w temperaturze 40 °C na zamkniętych szalkach Petriego. 
		UWAGA: Powlekane szkiełka są gotowe do natychmiastowego użycia i mogą być przechowywane w środowisku wolnym od kurzu w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przycinanie i dzielenie próbek na sekcje
<ol>
	<li>Przycinanie próbki
	<ol>
		<li>Ostrą żyletką przyciąć bloki LR-White pod mikroskopem stereoskopowym, aby utworzyć strukturę w kształcie piramidy, w której wierzchołek jest prostopadły do obszaru zainteresowania próbki (rysunek uzupełniający 1A). 
		UWAGA: Ultra-mikrotomowy uchwyt na próbki jest doskonałym narzędziem do zabezpieczenia bloku. Jeśli urządzenie nie jest wyposażone w uniwersalny uchwyt na próbki, użyj tego, który najbardziej pasuje do okrągłych bloków.</li>
		<li>Przytnij strukturę piramidalną, usuwając drobne plasterki nadmiaru żywicy prostopadle do głównej osi piramidy.</li>
		<li>Kontynuuj, aż próbka zostanie osiągnięta, tworząc powierzchnię cięcia. Próbka docelowa powinna być idealnie zamknięta w kształcie trapezu w obrębie powierzchni cięcia. 
		UWAGA: Blok żywicy można dodatkowo przyciąć pod kątem szczeliny, aby zmniejszyć powierzchnię przekroju za pomocą ostrego ostrza (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekroje półcienkie 
	UWAGA: Zostanie użyty mikrotom ze szklanymi nożami. Zdolność przeciwciała do wiązania się z epitopem będzie warunkować powodzenie reakcji znakowania immunologicznego. Hydrofilowy charakter żywicy LR-White pozwoli na dobry kontakt przeciwciał z sekcjami próbki. Cieńsze skrawki będą wykazywać słabsze zabarwienie kalkofluoru, które zostanie wykorzystane do zlokalizowania skrawków i wspomagają proces obrazowania. To samo dotyczy innych plam, które można później nałożyć. Również nadmierna grubość wpłynie na jakość akwizycji obrazu. Dobrym kompromisem dla grubości przekroju jest zakres od 200 do 700 nm, w zależności od charakterystyki tkanki. Zamontuj bloki szczelnie na uchwycie próbki ultramikrotomu.
	<ol>
		<li>Za pomocą ultramikrotomu wykonaj sekcje o grubości od 200 do 700 nm (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1G).</li>
		<li>Sprawdź obszar przekroju, przenosząc niektóre sekcje do kropli ddH2O na szkiełku podstawowym. Umieść szkiełko na płycie grzejnej o temperaturze 50 °C, aż woda odparuje. Barwienie: umieszczając kroplę 1% błękitu toluidynowego O (w/v) w 1% roztworze kwasu borowego (w/v) na sekcjach przez 30 s. Spłucz i obserwuj pod mikroskopem.</li>
		<li>Po znalezieniu pożądanej struktury przenieść jedną lub dwie sekcje do każdej kropli ddH2O uprzednio umieszczonej na każdym studzienku czystego szkiełka reakcyjnego.</li>
		<li>Umieść każde szkiełko w zamkniętej, czystej szalce Petriego o powierzchni 10 cm i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 °C.</li>
		<li>Przechowuj slajdy w czystym pudełku archiwum do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunolokalizacja
UWAGA: Procedura immunolokalizacji fluorescencyjnej opiera się na sekwencyjnym użyciu dwóch przeciwciał. Przeciwciało pierwszorzędowe jest podnoszone przeciwko specyficznemu antygenowi docelowemu. Przeciwciało drugorzędowe jest wywoływane specyficznie przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu, a w przypadku technik fluorescencyjnych jest sprzężone z fluoroforem (FITC w tym konkretnym protokole). Przeciwciało pierwszorzędowe zostanie użyte do wykrycia antygenu docelowego w próbce, a przeciwciało drugorzędowe zostanie użyte do oznaczenia miejsca, w którym przeciwciało pierwszorzędowe połączyło się z próbką po zmyciu nadmiaru przeciwciała pierwszorzędowego. Kontrole są ważną częścią tego testu i zawsze muszą być przeprowadzane w celu zapewnienia dokładności obserwacji. Jedna studzienka na szkiełku powinna być zarezerwowana do użycia jako kontrola ujemna, w której podstawowe leczenie przeciwciałami zostanie pominięte, a zatem pod koniec eksperymentu nie należy zaobserwować żadnego sygnału. Do doświadczenia musi zostać włączona kontrola pozytywna poprzez potraktowanie jednego studzienka przeciwciałem, którego oznakowanie jest już znane i pewne. Kontrolę dodatnią stosuje się w celu potwierdzenia skuteczności znakowania przeciwciał drugorzędowych i warunków reakcji, natomiast kontrolę ujemną bada się swoistość przeciwciał drugorzędowych.
<ol>
	<li>Przygotuj komorę inkubacyjną, umieszczając zwilżone ręczniki papierowe na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owijając je folią aluminiową (Rysunek uzupełniający 1B-1E). Umieścić szkiełka w komorze inkubacyjnej.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 50 μl kropli na 8 mm dołka roztworu blokującego (5% odtłuszczonego mleka w proszku (w/v) w 1 M PBS) i inkubować przez 10 minut. Usunąć roztwór blokujący i przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (patrz Tabela Uzupełniająca 1), przeciwciało 1:5 (v/v) w roztworze blokującym; oszacować około 40 μl na 8 mm dołka. 
	UWAGA: Stężenie przeciwciała należy dostosować zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wykonać końcowe płukanie ddH2O przez 5 minut, nigdy nie dopuszczać do całkowitego wyschnięcia studzienek.</li>
	<li>Odpipetować pierwotny roztwór przeciwciała do studzienek reakcyjnych. Roztwór blokujący pipety do studzienek kontrolnych.</li>
	<li>Zamknąć komorę inkubacyjną i odstawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie na noc w temperaturze 4 °C. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, 1% w roztworze blokującym (v/v) około 40 μl na studzienkę. Przykryj go folią aluminiową.</li>
	<li>Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut, a następnie przez dodatkowe 10 minutddH2O. Upewnij się, że na studzienkach nie jest widoczny żaden ślad roztworu blokującego lub osadów.</li>
	<li>Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Od teraz chroń zjeżdżalnie przed światłem.</li>
	<li>Inkubować przez 3–4 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie przez 10 minut PBS, a następnie ponownie przepłukać przez 10 minut ddH2O.</li>
	<li>Nałóż kroplę kalkofluoru (1:10 000 (w/v) świetlówka jaśniejsza 28 w PBS) do każdej studzienki. Bez mycia nałóż kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela Materiałów) na każdą studzienkę i umieść szkiełko nakrywkowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1H).</li>
	<li>Obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w soczewki 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 i 100x/1,40, użyj filtrów UV (do barwienia kalkofluorem) i FITC, aby wykryć odpowiednio ścianę komórkową i immunolokalizację (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1I). Użyj następujących długości fal: wzbudzenie/emisja (nm) 358/461 dla UV i 485/530 dla FITC.</li>
	<li>Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, nałóż na siebie oba obrazy za pomocą ImageJ lub podobnego.</li>
</ol>

<ol><li>Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Cell+Walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plant Cell Walls.</a> Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).</li>
<li>Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinogalactan+Proteins+as+Interactors+along+the+Crosstalk+between+the+Pollen+Tube+and+the+Female+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).</li>
<li>Showalter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinogalactan-proteins%3A+structure%2C+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).</li>
<li>Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+arabinogalactan+proteins+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.</a> Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).</li>
<li>Seifert, G., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+arabinogalactan+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The biology of arabinogalactan proteins.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).</li>
<li>Ruprecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthetic+Glycan+Microarray+Enables+Epitope+Mapping+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies.</a> Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Sample+Preparation+for+Staining+and+Immunodetection+of+Plant+Cell+Walls+by+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy.</a> Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505(2017).</li>
<li>Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+immunocytochemical+procedures+with+affinity+purified+antibodies%3A+tubulin+containing+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures.</a> Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).</li>
<li>Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinogalactan+proteins+as+molecular+markers+in+Arabidopsis+thaliana+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).</li>
<li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).</li>
<li>Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+expression+of+arabinogalactan-proteins+in+the+ovaries+of+Nicotiana+alata+Link+and+Otto%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto.</a> Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).</li>
<li>Coimbra, S., Salema, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+in+Amaranthus+hypocondriacus+L.+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules.</a> Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).</li>
<li>Coimbra, S., Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinogalactan+proteins+may+facilitate+the+movement+of+pollen+tubes+from+the+stigma+to+the+ovules+in+Actinidia+deliciosa+and+Amaranthus+hypocondriacus%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus.</a> Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).</li>
<li>El-Tantawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinogalactan+protein+profiles+and+distribution+patterns+during+microspore+embryogenesis+and+pollen+development+in+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus.</a> Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).</li>
<li>Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+arabinogalactan+proteins+%28AGPs%29+in+reproductive+structures+of+an+early-divergent+angiosperm%2C+Trithuria+submersa+%28Hydatellaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae).</a> Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).</li>
<li>Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+presence+of+arabinogalactan+proteins+and+pectins+during+Quercus+suber+male+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis.</a> Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).</li>
<li>Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHibbs%2C+AR+%22Confocal+Microscopy+for+Biologists%22">Confocal Microscopy for Biologists</a>. , Springer. Boston, MA. (2004).</li>
<li>Johnson, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+of+Immunofluorescence+during+microscopy%3A+A+Study+of+the+Phenomenon+and+its+Remedy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy.</a> Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li>
<li>Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury+Free+Microscopy%3A+An+Opportunity+for+Core+Facility+Directors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).</li>
<li>Weber, G. F., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+image+acquisition+using+a+monochrome+camera+and+standard+fluorescence+filter+cubes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes.</a> BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisana tutaj metoda immunolokalizacji fluorescencyjnej u roślin, choć bezbłędnie prosta, opiera się na sukcesie kilku małych kroków. Pierwszym z nich jest przygotowanie i utrwalenie próbki. Podczas tego pierwszego etapu mieszanina formaldehydu i aldehydu glutarowego jest używana do sieciowania większości składników komórek. Formaldehyd w roztworze zapewnia łagodne i odwracalne utrwalenie, podczas gdy aldehyd glutarowy zapewnia silne, bardziej trwałe wiązanie; Równowaga między dwoma utrwalaczami zapewnia odpowiednią iloś...

Ściany komórkowe roślin to złożone struktury złożone z polisacharydów i glikoprotein. Ściany komórkowe są niezwykle dynamicznymi strukturami, których architektura, organizacja i skład różnią się w zależności od typu komórki, lokalizacji, etapu rozwoju, bodźców zewnętrznych i wewnętrznych1. Białka arabinogalaktanu (AGP) i pektyny są ważnymi składnikami ściany komórkowej rośliny. AGP są silnie glikozylowanymi białkami, a pektyny są polisacharydami homogalakturonowymi, których skład, ilość i struktura różnią się znacznie w różnych fazach rozwoju rośliny2,3,4. Badania AGP i pektyn wykazały ich udział w kilku procesach roślinnych, takich jak programowana śmierć komórki, reakcja na stresy abiotyczne, rozmnażanie płciowe roślin i wiele innych5. Większość z tych badań rozpoczęto od informacji uzyskanych z badań immunolokalizacyjnych.
Biorąc pod uwagę jego złożoność, badanie ścian komórkowych wymaga wielu różnych narzędzi. Wykrywanie epitopów glikanów za pomocą przeciwciał monoklonalnych (mAb) jest cennym podejściem do rozwiązania dystrybucji polisacharydów i glikoprotein wzdłuż tej struktury. Dostępna jest duża kolekcja mAb do wykrywania epitopów glikanów, a swoistość każdego mAb jest również stale ulepszana6. Opisana tu technika ma zastosowanie do wszystkich gatunków roślin i jest doskonałym narzędziem do wyznaczania przyszłych kierunków badań, które mogą obejmować bardziej kosztowne i złożone techniki.
W tej technice, specyficzne przeciwciała są chemicznie sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), TRITC (tetrametylorodamino-5-(i 6)-izotiocyjanian) lub kilka barwników Alexa Fluor. Immunofluorescencja ma kilka zalet, umożliwiając wyraźną i szybką subkomórkową lokalizację glikanów, którą można bezpośrednio zaobserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jest wysoce specyficzny i wrażliwy, ponieważ przygotowanie próbki może skutecznie chronić naturalną strukturę antygenu, nawet jeśli występuje w mniejszych ilościach. Pozwala na wykrycie wielu antygenów w tej samej próbce, a co najważniejsze, oferuje wysoką jakość i piękne wizualnie wyniki. Pomimo ogromnej mocy, jaką oferują badania immunolokalizacji fluorescencji, często są one uważane za trudne do wykonania i wdrożenia, najprawdopodobniej ze względu na brak szczegółowych protokołów pozwalających na wizualizację poszczególnych etapów zabiegu. Tutaj podajemy kilka prostych wskazówek, jak wykonać tę technikę i jak uzyskać obrazy wysokiej jakości.
Dla przedstawionego tutaj protokołu, próbki muszą najpierw zostać naprawione i osadzone przy użyciu najbardziej odpowiedniego utrwalacza. Chociaż uważa się, że jest to technika czasochłonna i stosunkowo żmudna, właściwe utrwalenie i osadzenie próbki rośliny jest kluczem do zapewnienia udanego testu immunolokalizacyjnego. W tym celu najczęściej stosuje się utrwalanie chemiczne za pomocą utrwalaczy sieciujących, takich jak aldehydy. Utrwalacze sieciujące tworzą wiązania chemiczne między cząsteczkami tkanki, stabilizując i utwardzając próbkę. Formaldehyd i aldehyd glutarowy są utrwalaczami sieciującymi, a czasami stosuje się mieszankę obu utrwalaczy7. Formaldehyd zapewnia doskonałą ochronę strukturalną tkanek przez dłuższy czas, powodując niewielkie retrakcje tkanek i będąc kompatybilnym z barwieniem immunologicznym. Aldehyd glutarowy jest silniejszym i stabilniejszym utrwalaczem, zwykle stosowanym w połączeniu z formaldehydem. Stosowanie aldehydu glutarowego ma pewne wady, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ wprowadza on pewne wolne grupy aldehydowe do utrwalonej tkanki, co może powodować niespecyficzne znakowanie. Również sieciowanie między białkami i innymi cząsteczkami czasami może sprawić, że niektóre docelowe epitopy staną się niedostępne dla przeciwciał. Aby tego uniknąć, należy dokładnie określić ilość i czas trwania utrwalenia.
Po utrwaleniu, próbki są zatapiane w odpowiedniej żywicy, aby utwardzić się przed uzyskaniem sekcji. Żywica akrylowa London Resin (LR-White) jest żywicą z wyboru do badań immunolokalizacyjnych. W przeciwieństwie do innych żywic, LR-White jest hydrofilowa, dzięki czemu przeciwciała docierają do swoich antygenów, bez potrzeby jakiejkolwiek obróbki, aby to ułatwić. LR-White ma również tę zaletę, że oferuje niską autofluorescencję, co pozwala na redukcję szumów tła podczas obrazowania immunofluorescencyjnego.
Istnieje wiele dostępnych technik barwienia do wykrywania różnych składników ściany komórkowej, takich jak barwienie błękitem alcyjskim, barwienie błękitem toluidynowym lub barwienie kwasem okresowym-Schiffem (PAS). Żadna z tych metod nie oferuje takiej mocy jak analizy immunolokalizacyjne8. Takie podejście zapewnia większą szczegółowość w wykrywaniu glikanów, oferując szersze informacje na temat składu i struktury ściany komórkowej.

<table><tbody><tr><td>25% (w/v) Agar aldehydu gluterowego</td><td>Scientific</td><td>AGR1010</td><td>aq. Roztwór bez metanolu</td></tr><tr><td>8 dołków Można stosować szklane szkiełka reakcyjne</td><td>Marinfeld</td><td>MARI1216750</td><td>innych marek</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rat IgG (cząsteczka wole)-FITC wytwarzane w</td> szkiełkach nakrywkowych GOAT <td>Sigma-Aldrich</td><td>F6258</td><td></td></tr><tr><td>, 24 mm x 50 mm</td><td>Marinfeld</td><td>MARI0100222</td><td>Szkiełko nakrywkowe powinno zakrywać wszystkie studzienki. Mogą być używane inne marki&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>na</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>na</td><td>na Rozjaśniacz</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjny 28</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6259</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułki żelatynowe</td><td>Agar</td><td>AGG29211</td><td>naukowy Rozmiar kapsułki powinien pasować do wielkości próbki.</td></tr><tr><td>Można</td><td></td><td></td><td>użyć wszelkich prostych, niedrogich szklanych fiolek, które można zamknąć. Po użyciu fiolki można oczyścić 96% etanolem w celu usunięcia pozostałości LR-White i użyć ponownie.</td></tr><tr><td>LR-white średniej jakości, żywica embdeding</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1281</td><td>LR-White występuje w kilku formach; średnia klasa zapewnia odpowiednie wsparcie cięcia dla większości tkanek, podczas gdy dla twardszych tkanek może być zalecana twardsza klasa LR-white. Jeśli to możliwe, użyj żywicy już zmieszanej z aktywatorem polimeracji (nadtlenek benzoilu), jeśli nie, postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby przygotować żywicę.</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Dowolny</td><td>odtłuszczony mleko w proszku jest odpowiedni</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>na</td><td></td><td>ogólny piekarnik laboratoryjny</td></tr><tr><td>szalka Petriego, 10 cm x 10 cm kwadratowy</td><td>na</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Sondy monoklonalne przeciwciał</td><td>roślinnych</td><td>generowane przez</td> szczury na <td>Kilka przeciwciał, które rozpoznają składniki ściany komórkowej, to dostępne zarówno w centrum badań nad węglowodanami złożonymi (CCRC, Georgia University, USA), jak i Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, na Uniwersytecie Leeds w Wielkiej Brytanii). Krótka lista niektórych powszechnie używanych MABS i gdzie można je kupić znajduje się w tabeli uzupełniającej 1</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>na</td><td></td><td>zwykłe żyletki</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue-O</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1727</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop epifluorescencyjny z filtrami fluorescencyjnymi UV i FITC</td><td>Komora próżniowa Leica Mycrosistems</td><td>DMLb</td><td></td></tr><tr><td>i</td><td></td><td></td> na Pompa próżniowa na Vectashield vecta Labs T-1000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Można zastosować inne środki zapobiegające blaknięciu. Sprawdź kompatybilność z FITC i rozjaśniaczem fluorescencyjnym 28. (Uwaga: dla niekomercyjnej alternatywy, (patrz Jonhson i in. 198218) Pożywkę zapobiegającą blaknięciu można uzyskać, mieszając 25 mg/ml 1,4-diazobicyklo-(2,2,2)oktanu (DABCO) w glicerolu 9:1 (v/v) do 1xPBS. Doprowadzić pH do 8,6 za pomocą rozcieńczonego HCl.)</td></tr></tbody></table>

immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Rozwój roślin polega na ciągłym dostosowywaniu składu i struktury ściany komórkowej w odpowiedzi na bodźce zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne. Ściany komórkowe składają się z polisacharydów celulozowych i niecelulozowych wraz z białkami, związkami fenolowymi i wodą. 90% ściany komórkowej składa się z polisacharydów (np. pektyn) i białek arabinogalaktanu (AGP). Immunolokalizacja fluorescencyjna specyficznych epitopów glikanów w przekrojach histologicznych roślin pozostaje kluczowym narzędziem do odkrycia przebudowy ściennych sieci polisacharydowych, struktury i składników.
Tutaj opisujemy zoptymalizowaną procedurę immunolokalizacji fluorescencyjnej do wykrywania epitopów glikanów z AGP i pektyn w tkankach roślinnych. Zastosowano utrwalanie paraformaldehydu/aldehydu glutarowego wraz z zatapianiem próbek roślinnych LR-White, co pozwoliło na lepsze zachowanie struktury i składu tkanki. Cienkie skrawki osadzonych próbek uzyskanych za pomocą ultramikrotomu wykorzystano do immunolokalizacji za pomocą specyficznych przeciwciał. Technika ta oferuje doskonałą rozdzielczość, wysoką specyficzność i szansę na wykrycie wielu epitopów glikanów w tej samej próbce. Technika ta umożliwia subkomórkową lokalizację glikanów i wykrywa poziom ich akumulacji w ścianie komórkowej. Pozwala również na określenie czasoprzestrzennych wzorców dystrybucji AGP i pektyn podczas procesów rozwojowych. Zastosowanie tego narzędzia może ostatecznie wskazać kierunki badań i powiązać glikany z określonymi funkcjami w roślinach. Ponadto uzyskane informacje mogą stanowić uzupełnienie badań biochemicznych i badań nad ekspresją genów.

W udanym eksperymencie przeciwciało wtórne w sposób spójny i specyficznie wskaże lokalizację konkretnego epitopu kolorem jasnej zieleni, co pozwoli na scharakteryzowanie składu ściany komórkowej na określonym etapie rozwoju komórki, tkanki lub narządu. Na przykład przeciwciało LM6 wykazuje wysokie powinowactwo do 1,5-arabinanu, związku z rhamnogalakturonanem typu I, który występuje obficie w ścianach komórkowych rozwijającego się pręcika Quercus suber (Rysunek 2A), co pozwala wywnio...

Ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób materiał roślinny do immunolokalizacji białek i pektyn Arabinogalaktanu jest utrwalony, osadzony w hydrofilowej żywicy akrylowej, podzielony na sekcje i zamontowany na szkiełkach podstawowych. Pokazujemy, że epitopy związane ze ścianą komórkową zostaną wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał.

Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Ilość informacji pochodzących z tylko jednego eksperymentu jest ogromna. Możemy wykryć obecność tych polimerów ściany komórkowej i dokładnie wiedzieć, w jaki sposób są one rozmieszczone w komórkach i tkankach, a nawet określić ich obfitość. Metoda ta została zaprojektowana w taki sposób, że można ją zastosować do prawie każdego rodzaju tkanki roślinnej z dowolnego gatunku, który można chcieć przeanalizować.Immunolokalizacja w tkankach roślinnych wiąże się z dużą ilością skrupulatnej pracy, trudnej do wyjaśnienia bez faktycznego zobaczenia, co się dzieje. Przed pobraniem próbki tkanki roślinnej napełnij szklaną fiolkę wystarczającą ilością zimnego roztworu utrwalającego, aby całkowicie zanurzyć wszystkie próbki. Następnie wybierz tkanki roślinne do analizy i przytnij próbki do rozmiaru nie większego niż 16 milimetrów kwadratowych.Natychmiast zanurzyć próbki w roztworze utrwalającym. Aldehyd glutarowy i formaldehyd są doskonałymi utrwalaczami, ale oba są niebezpieczne i muszą być obsługiwane w okapie przepływowym. Przenieść fiolkę do komory próżniowej i powoli stosować podciśnienie.Gdy ciśnienie osiągnie minus 60 kilo paskalów, unoszący się materiał w fiolce zacznie opadać na dno. Utrzymuj ciśnienie w komorze na poziomie nie większym niż minus 80 kilo paskalów. Proces tonięcia może potrwać do dwóch godzin.Po dwóch godzinach przebywania próbek w komorze próżniowej powoli uwolnij próżnię. Zamknij szklaną fiolkę i wstaw ją do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu przez noc należy wyrzucić wszystkie próbki, które nie opadły na dno fiolki.Pozostałe próbki przemywać 25 milimolowymi PBS przez 10 minut, a następnie myć je w 25 milimolowym buforze PIPES przez 20 minut. Niezwykle ważne jest usunięcie wszystkich pływających próbek, ponieważ jest wysoce prawdopodobne, że utrwalacz nie przeniknął do próbki. Odwodnić próbki w serii etanolu, zanurzając próbki na 20 minut przy każdym stężeniu etanolu.Aby przetworzyć próbki, dodaj rosnące stężenie białej żywicy LR w etanolu, zaczynając od jednej części żywicy do trzech części etanolu. Przy każdym stężeniu inkubować przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zastąp białą żywicę LR świeżą żywicą i inkubuj próbki przez dodatkowe 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przygotuj zatapiające kapsułki żelatynowe, wybierając kapsułki, które są nieco większe niż próbki, tak aby próbki mogły być całkowicie zamknięte w żywicy. Oznacz papierowe metki ołówkiem, ponieważ atrament zanieczyści żywicę. Nałóż jedną kroplę świeżej żywicy LR-white na dno każdej kapsułki.Umieść próbkę w każdej kapsułce, a następnie napełnij kapsułki do maksymalnej pojemności świeżą żywicą. Nałóż nakrętkę na kapsułkę i delikatnie dociśnij, aby ją uszczelnić. Aby spolimeryzować żywicę, utwardź kapsułki w temperaturze 58 stopni Celsjusza do całkowitego stwardnienia około 24 do 48 godzin.Po oderwaniu kapsułki żelatynowej od żywicy LR-white, umieść blok żywicy pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrej żyletki przytnij biały blok LR pod kątem 45 stopni do próbki. Obróć próbkę i wykonaj drugie cięcie pod kątem 90 stopni do pierwszego.Kontynuuj cięcie w ten sam wzór, aby utworzyć ostrosłup z wierzchołkiem ostrosłupa bezpośrednio nad obszarem zainteresowania próbki, a następnie zacznij usuwać drobne plasterki prostopadłe do głównej osi, aż powierzchnia cięcia dotrze do próbki. Najlepiej byłoby, gdyby próbka docelowa była zamknięta w kształcie trapezu. Umieść przycięty blok żywicy w ultra mikrotomie.Dostosuj kąt między krawędzią noża a blokiem żywicy. Wytnij sekcje z bloku o grubości od 200 do 700 nanometrów. Użyj drucianej pętli, aby ostrożnie podnieść niektóre próbki z mikrotomu.Umieść je w kropli destylowanej wody dejonizowanej na szklanym szkiełku. Odparuj wodę, umieszczając szkiełko na płycie grzejnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie dodaj kroplę plamy do sekcji. Po 30 sekundach spłucz plamę i obserwuj szkiełko pod mikroskopem, aby sprawdzić ogólny stan przekroju i czy widoczna jest pożądana struktura rośliny.Przygotuj czysty szkiełko reakcyjne, umieszczając kroplę destylowanej wody dejonizowanej w każdej studzience szkiełka. Przenieść jedną lub dwie cząstki próbki do każdej kropli wody. Umieść szkiełko na szalce Petriego o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych, przykryj i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Aby przygotować komorę inkubacyjną dla szkiełek reakcyjnych, umieść kilka zwilżonych ręczników papierowych na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owiń pudełko folią aluminiową. Przenieś szkiełka z pudełka do komory inkubacyjnej. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki.Po inkubacji szkiełka przez 10 minut usunąć roztwór blokujący, a następnie przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem. Po przygotowaniu pierwotnych roztworów przeciwciał zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy przeprowadzić końcowe płukanie studzienek destylowaną wodą dejonizowaną przez pięć minut. Odpipetować roztwór przeciwciała pierwotnego do dołków reakcyjnych, a następnie odpipetować roztwór blokujący do studzienek kontrolnych.Zamknąć komorę inkubacyjną. Odstaw na dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wstaw do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór przeciwciała drugorzędowego w roztworze blokującym.Potrzebne będzie około 40 mikrolitrów na studzienkę. Przykryj roztwór folią aluminiową. Przemyć studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną wodą dejonizowaną przez 10 minut za każdym razem.Upewnij się, że w studzienkach nie pozostał żaden roztwór blokujący ani osady. Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Inkubuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech godzin.Ponownie umyj studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie dodaj kroplę Calcofluor White do każdej studzienki. Bez mycia dodaj kroplę podłoża montażowego do każdej studzienki i przykryj każdą studzienkę szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować skrawki próbki na szkiełku reakcyjnym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Do każdej obserwacji należy użyć filtra UV do wykrycia ścian komórkowych przebarwionych przez Calcofluor oraz filtra FITC do wykrycia immunolokalizacji. Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, użyj ImageJ lub podobnego programu do analizy obrazu, aby scalić każdy obraz filtra UV z odpowiadającym mu obrazem filtra FITC. Określając lokalizację określonych epitopów, protokół umożliwia scharakteryzowanie składu ściany komórkowej.Na przykład 1,5-arabinan występuje obficie w ścianie komórkowej rozwijającego się pylnika Quercus suber. Słabo estryfikowane homogalakturony znajdują się zwykle na końcu korzenia zarodka Quercus suber, określając właściwości mechaniczne narządu. Xylogalacturonans znajdują się w komórkach degenerujących, takich jak komórka bielma podczas końcowych etapów dojrzewania żołędzi Quercus suber.Epitopy AGP rozpoznawane przez JIM13 lub JIM8 znajdują się na strukturach związanych z reprodukcją, takich jak linie komórkowe związane z mikrogametogenezą u Arabidopsis thaliana oraz brodawki stygmatyczne i drobnoustroje podstawy okrytozalążkowych Trithuria submersa. Typowe błędy w implementacji tego protokołu są zwykle łatwe do wykrycia i zidentyfikowania. Gdy płukanie jest pomijane lub studzienki reakcyjne pozostawia się do wyschnięcia, przeciwciało wtórne zwykle pojawia się jako rozmaz.Agregaty zielonego fluorochromu powstaną, jeśli niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe nie zostanie odpowiednio wypłukane. Składanie lub odklejanie sekcji jest zwykle związane ze słabą przyczepnością z powodu stosowania brudnych szkiełek lub agresywnego mycia. Kluczowe znaczenie ma również przygotowanie próbki.Bloki żywicy powinny być wolne od pęknięć, z wyraźnie widoczną próbką o barwie od jasnożółtej do jasnobrązowej. Nieefektywnie osadzone próbki pokażą sproszkowane białe plamy lub obszary. Utrzymanie wielkości próbki poniżej ośmiu milimetrów jest niezbędne do penetracji roztworu utrwalającego.Źle utrwalone próbki będą ciemnobrązowe lub prawie czarne. Nadmierna temperatura może spowodować pękanie żywicy, co uniemożliwi przekrój próbki. Zastosowanie technik immunolokalizacji otwiera kilka kierunków badań.Można kontynuować bardziej szczegółowe techniki, takie jak analiza biochemiczna ściany komórkowej, a nawet przejść do podejścia molekularnego. Wyniki uzyskane dzięki tej technice mogą pomóc w zrozumieniu składu ściany komórkowej, niezwykle złożonej struktury, bardzo trudnej do analizy za pomocą prostej analizy chemicznej.

fluorescent-immunolocalization-arabinogalactan-proteins-pectins-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego do lokalizacji białek arabinogalaktanu (AGP) i pektyn w tkankach roślinnych. Utrwalone i zatopione w żywicy skrawki tkanki roślinnej są barwione przeciwciałami pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi specyficznymi dla AGP i pektyny oraz barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym celulozę, aby ujawnić ich specyficzną tkankowo kolokalizację w ścianie komórkowej.

Immunolokalizacja białek i pektyn arabinogalaktanu w tkance roślinnej

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Ten protokół opisuje mikroskopijną metodę wykrywania pektyn w interakcji między kawą a grzybem.

Metoda podwójnego barwienia do wykrywania pektyn w interakcji roślina-grzyb

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.

Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu

Ten raport opisuje podstawowe metody używane do hodowli i eksperymentalnego manipulowania jednokomórkową streptophyte alg, Penium margaritaceum. Zapewnia również podstawowe protokoły obrazowania opartego na mikroskopii, w tym znakowanie żywych komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych i innych sond fluorescencyjnych oraz skaningową mikroskopię elektronową.

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

Poznaj metodę immunolokalizacji fluorescencyjnej białek arabinogalaktanu i pektyn w ścianach komórkowych roślin. Technika ta umożliwia precyzyjne wykrywanie i wizualizację polimerów komórkowych w różnych gatunkach roślin.

Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów