Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Ilość informacji pochodzących z tylko jednego eksperymentu jest ogromna. Możemy wykryć obecność tych polimerów ściany komórkowej i dokładnie wiedzieć, w jaki sposób są one rozmieszczone w komórkach i tkankach, a nawet określić ich obfitość. Metoda ta została zaprojektowana w taki sposób, że można ją zastosować do prawie każdego rodzaju tkanki roślinnej z dowolnego gatunku, który można chcieć przeanalizować.

Immunolokalizacja w tkankach roślinnych wiąże się z dużą ilością skrupulatnej pracy, trudnej do wyjaśnienia bez faktycznego zobaczenia, co się dzieje. Przed pobraniem próbki tkanki roślinnej napełnij szklaną fiolkę wystarczającą ilością zimnego roztworu utrwalającego, aby całkowicie zanurzyć wszystkie próbki. Następnie wybierz tkanki roślinne do analizy i przytnij próbki do rozmiaru nie większego niż 16 milimetrów kwadratowych.

Natychmiast zanurzyć próbki w roztworze utrwalającym. Aldehyd glutarowy i formaldehyd są doskonałymi utrwalaczami, ale oba są niebezpieczne i muszą być obsługiwane w okapie przepływowym. Przenieść fiolkę do komory próżniowej i powoli stosować podciśnienie.

Gdy ciśnienie osiągnie minus 60 kilo paskalów, unoszący się materiał w fiolce zacznie opadać na dno. Utrzymuj ciśnienie w komorze na poziomie nie większym niż minus 80 kilo paskalów. Proces tonięcia może potrwać do dwóch godzin.

Po dwóch godzinach przebywania próbek w komorze próżniowej powoli uwolnij próżnię. Zamknij szklaną fiolkę i wstaw ją do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu przez noc należy wyrzucić wszystkie próbki, które nie opadły na dno fiolki.

Pozostałe próbki przemywać 25 milimolowymi PBS przez 10 minut, a następnie myć je w 25 milimolowym buforze PIPES przez 20 minut. Niezwykle ważne jest usunięcie wszystkich pływających próbek, ponieważ jest wysoce prawdopodobne, że utrwalacz nie przeniknął do próbki. Odwodnić próbki w serii etanolu, zanurzając próbki na 20 minut przy każdym stężeniu etanolu.

Aby przetworzyć próbki, dodaj rosnące stężenie białej żywicy LR w etanolu, zaczynając od jednej części żywicy do trzech części etanolu. Przy każdym stężeniu inkubować przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zastąp białą żywicę LR świeżą żywicą i inkubuj próbki przez dodatkowe 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przygotuj zatapiające kapsułki żelatynowe, wybierając kapsułki, które są nieco większe niż próbki, tak aby próbki mogły być całkowicie zamknięte w żywicy. Oznacz papierowe metki ołówkiem, ponieważ atrament zanieczyści żywicę. Nałóż jedną kroplę świeżej żywicy LR-white na dno każdej kapsułki.

Umieść próbkę w każdej kapsułce, a następnie napełnij kapsułki do maksymalnej pojemności świeżą żywicą. Nałóż nakrętkę na kapsułkę i delikatnie dociśnij, aby ją uszczelnić. Aby spolimeryzować żywicę, utwardź kapsułki w temperaturze 58 stopni Celsjusza do całkowitego stwardnienia około 24 do 48 godzin.

Po oderwaniu kapsułki żelatynowej od żywicy LR-white, umieść blok żywicy pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrej żyletki przytnij biały blok LR pod kątem 45 stopni do próbki. Obróć próbkę i wykonaj drugie cięcie pod kątem 90 stopni do pierwszego.

Kontynuuj cięcie w ten sam wzór, aby utworzyć ostrosłup z wierzchołkiem ostrosłupa bezpośrednio nad obszarem zainteresowania próbki, a następnie zacznij usuwać drobne plasterki prostopadłe do głównej osi, aż powierzchnia cięcia dotrze do próbki. Najlepiej byłoby, gdyby próbka docelowa była zamknięta w kształcie trapezu. Umieść przycięty blok żywicy w ultra mikrotomie.

Dostosuj kąt między krawędzią noża a blokiem żywicy. Wytnij sekcje z bloku o grubości od 200 do 700 nanometrów. Użyj drucianej pętli, aby ostrożnie podnieść niektóre próbki z mikrotomu.

Umieść je w kropli destylowanej wody dejonizowanej na szklanym szkiełku. Odparuj wodę, umieszczając szkiełko na płycie grzejnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie dodaj kroplę plamy do sekcji. Po 30 sekundach spłucz plamę i obserwuj szkiełko pod mikroskopem, aby sprawdzić ogólny stan przekroju i czy widoczna jest pożądana struktura rośliny.

Przygotuj czysty szkiełko reakcyjne, umieszczając kroplę destylowanej wody dejonizowanej w każdej studzience szkiełka. Przenieść jedną lub dwie cząstki próbki do każdej kropli wody. Umieść szkiełko na szalce Petriego o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych, przykryj i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Aby przygotować komorę inkubacyjną dla szkiełek reakcyjnych, umieść kilka zwilżonych ręczników papierowych na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owiń pudełko folią aluminiową. Przenieś szkiełka z pudełka do komory inkubacyjnej. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki.

Po inkubacji szkiełka przez 10 minut usunąć roztwór blokujący, a następnie przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut za każdym razem. Po przygotowaniu pierwotnych roztworów przeciwciał zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy przeprowadzić końcowe płukanie studzienek destylowaną wodą dejonizowaną przez pięć minut. Odpipetować roztwór przeciwciała pierwotnego do dołków reakcyjnych, a następnie odpipetować roztwór blokujący do studzienek kontrolnych.

Zamknąć komorę inkubacyjną. Odstaw na dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wstaw do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór przeciwciała drugorzędowego w roztworze blokującym.

Potrzebne będzie około 40 mikrolitrów na studzienkę. Przykryj roztwór folią aluminiową. Przemyć studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną wodą dejonizowaną przez 10 minut za każdym razem.

Upewnij się, że w studzienkach nie pozostał żaden roztwór blokujący ani osady. Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Inkubuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech godzin.

Ponownie umyj studzienki szkiełka reakcyjnego dwukrotnie PBS i raz destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie dodaj kroplę Calcofluor White do każdej studzienki. Bez mycia dodaj kroplę podłoża montażowego do każdej studzienki i przykryj każdą studzienkę szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować skrawki próbki na szkiełku reakcyjnym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Do każdej obserwacji należy użyć filtra UV do wykrycia ścian komórkowych przebarwionych przez Calcofluor oraz filtra FITC do wykrycia immunolokalizacji. Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, użyj ImageJ lub podobnego programu do analizy obrazu, aby scalić każdy obraz filtra UV z odpowiadającym mu obrazem filtra FITC. Określając lokalizację określonych epitopów, protokół umożliwia scharakteryzowanie składu ściany komórkowej.

Na przykład 1,5-arabinan występuje obficie w ścianie komórkowej rozwijającego się pylnika Quercus suber. Słabo estryfikowane homogalakturony znajdują się zwykle na końcu korzenia zarodka Quercus suber, określając właściwości mechaniczne narządu. Xylogalacturonans znajdują się w komórkach degenerujących, takich jak komórka bielma podczas końcowych etapów dojrzewania żołędzi Quercus suber.

Epitopy AGP rozpoznawane przez JIM13 lub JIM8 znajdują się na strukturach związanych z reprodukcją, takich jak linie komórkowe związane z mikrogametogenezą u Arabidopsis thaliana oraz brodawki stygmatyczne i drobnoustroje podstawy okrytozalążkowych Trithuria submersa. Typowe błędy w implementacji tego protokołu są zwykle łatwe do wykrycia i zidentyfikowania. Gdy płukanie jest pomijane lub studzienki reakcyjne pozostawia się do wyschnięcia, przeciwciało wtórne zwykle pojawia się jako rozmaz.

Agregaty zielonego fluorochromu powstaną, jeśli niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe nie zostanie odpowiednio wypłukane. Składanie lub odklejanie sekcji jest zwykle związane ze słabą przyczepnością z powodu stosowania brudnych szkiełek lub agresywnego mycia. Kluczowe znaczenie ma również przygotowanie próbki.

Bloki żywicy powinny być wolne od pęknięć, z wyraźnie widoczną próbką o barwie od jasnożółtej do jasnobrązowej. Nieefektywnie osadzone próbki pokażą sproszkowane białe plamy lub obszary. Utrzymanie wielkości próbki poniżej ośmiu milimetrów jest niezbędne do penetracji roztworu utrwalającego.

Źle utrwalone próbki będą ciemnobrązowe lub prawie czarne. Nadmierna temperatura może spowodować pękanie żywicy, co uniemożliwi przekrój próbki. Zastosowanie technik immunolokalizacji otwiera kilka kierunków badań.

Można kontynuować bardziej szczegółowe techniki, takie jak analiza biochemiczna ściany komórkowej, a nawet przejść do podejścia molekularnego. Wyniki uzyskane dzięki tej technice mogą pomóc w zrozumieniu składu ściany komórkowej, niezwykle złożonej struktury, bardzo trudnej do analizy za pomocą prostej analizy chemicznej.