Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na obniżenie i nadmierną ekspresję genów u rozwijającej się ryby, a także na ilościowe określenie tych dalszych skutków dla komórek krwi. Protokół ten jest szybki, łatwy do wykonania, ekonomiczny i łatwy do zautomatyzowania dzięki dostępowi do odpowiedniego oprzyrządowania. Procedurę tę zademonstruje Kristen Rueb, badaczka pracująca w laboratorium.

Zacznij od przeniesienia od pięciu do 200, 48 godzin po zapłodnieniu zarodków na plastikową 10-centymetrową szalkę Petriego. Przechyl naczynie tak, aby zarodek opadł do dolnej krawędzi i usuń jak najwięcej podłoża E3 z naczynia. Następnie dodaj 500 mikrolitrów proteazy dechorionacyjnej do zarodków.

Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej ponownie przechyl wszystkie zarodki na dolną krawędź płytki i delikatnie postukaj w bok naczynia, pozwalając zarodkom delikatnie pocierać o spód płytki, aby całkowicie usunąć ich kosmówkę. Za pomocą butelki do wyciskania dodaj około 20 mililitrów pożywki E3, aby rozcieńczyć proteazę i pozwól zarodkom się uspokoić. Następnie zdekantować pożywkę i przepłukać zarodki jeszcze trzy razy świeżą pożywką, jak właśnie wykazano, aby usunąć wszelkie ślady proteazy.

Aby przygotować zarodki do dysocjacji, użyj pipety P1000, aby przenieść od pięciu do 10 zarodków do jednej, 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odessać przeniesione podłoże E3. Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowej pożywki DTT w pożywce E3 do embrionalnego danio pręgowanego i umieść probówkę mikrowirówki w pozycji poziomej na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć powłokę śluzu. W celu dysocjacji zarodków należy trzykrotnie przemyć zarodki poddane działaniu DTT jednym mililitrem DPBS uzupełnionym wapniem i magnezem na jedno płukanie.

Przed dodaniem 500 mikrolitrów DPBS uzupełnionych wapniem i magnezem oraz pięciu mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr, proteaza dysocjacyjna. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 185 obrotów na minutę przez 60 minut. Pamiętaj, aby okresowo sprawdzać zarodki, aby ich nie przetrawić.

Gdy można zaobserwować nie do końca jednorodną próbkę, w której obecna jest pewna ilość tkanki stałej, należy rozcierać zarodki za pomocą pipety P1000, aż próbka zostanie całkowicie zdysocjowana. Aby przygotować zdysocjowane komórki embrionalne danio pręgowanego do cytometrii przepływowej, należy przenieść całą próbkę komórek do górnego zbiornika pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu z nasadką sitową o długości 35 mikrometrów. Przepłucz nakrętkę czterema mililitrami PBS bez wapnia lub magnezu i opłucz komórki przez odwirowanie.

Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS bez wapnia i magnezu na probówkę. W celu analizy cytometrycznej przepływowej komórek embrionalnych danio pręgowanego, delikatnie zawiruj zawiesiny komórkowe przed dodaniem do każdej probówki rozcieńczenia od jednego do tysiąca czerwonego barwnika martwych komórek. W ciągu 30 minut od nałożenia barwienia martwych komórek opróżnij zbiornik na nieczystości, napełnij zbiornik osłonowy odpowiednim roztworem i uruchom układ fluidyczny cytometru przepływowego.

W oprogramowaniu do analizy narysuj pięć wykresów i ustaw pierwszy wykres tak, aby mierzył rozrzut do przodu i z boku. Ustaw punktowy punkt do przodu na liniowy, a punktowy boczny na logarytmiczny. Ustaw drugi wykres, aby zmierzyć wysokość punktu punktowego do przodu w stosunku do szerokości punktu punktowego do przodu, a trzeci wykres tak, aby mierzyć wysokość punktu punktowego w stosunku do szerokości punktowego z boku.

Ustaw czwarty wykres, aby zmierzyć czerwone zabarwienie martwych komórek na osi x i rozrzut boczny na osi y, aby umożliwić rozróżnienie żywych komórek od martwych. Piątą powierzchnię należy ustawić w celu zmierzenia wybranego fluoroforu. Po ustawieniu wszystkich wykresów załaduj próbkę do cytometru i zmniejsz natężenie przepływu, aby komórki nie wyczerpały się zbyt szybko.

Dostosuj ustawienia rozproszenia do przodu i z boku, aby można było wyraźnie zaobserwować większość populacji komórek, i narysuj bramkę wokół populacji komórek. Oznacz tę bramkę jako komórki. Z drugim wykresem kropkowym bramkowanym na komórkach, bramka na rozproszeniu do przodu i boczne rozproszenie podkoszulka, aby wykluczyć dublety.

Na czwartym wykresie dostosuj ustawienia barwienia martwych komórek na czerwono, tak aby populacja była wyraźnie ujemna. Narysuj bramkę wokół tych komórek i oznacz tę bramkę jako żywe komórki. Na piątym wykresie przelej żywe komórki i narysuj bramkę wokół komórek dodatnich, a następnie uruchom każdą próbkę, zbierając co najmniej 25 000 zdarzeń żywych komórek.

Po przeanalizowaniu wszystkich próbek postępuj zgodnie z procedurą wyłączania, aby wyłączyć fluidykę, napełnić zbiornik osłonowy i opróżnić zbiornik na odpady. Po przeanalizowaniu procentu czerwonych krwinek dodatnich przez GFP z każdej próbki embrionalnego danio pręgowanego można obliczyć średnią z całej grupy kontrolnej. Zazwyczaj średnia jest ustawiana jako jeden, a wszystkie wartości procentowe są obliczane na podstawie tego punktu odniesienia.

W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że zmniejszenie transkryptu ISM1 za pomocą specyficznego morfolino, zmniejszenie liczby czerwonych krwinek GFP obecnych w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu zarodków. Ratując to obniżenie poziomu morfolina ISM1 za pomocą egzogennego mRNA, przywróć liczbę czerwonych krwinek do normy. Prawidłowe trawienie próbek ma kluczowe znaczenie.

Jeśli trawisz za dużo lub za mało, nie uzyskasz prawidłowych wyników. Jeśli dostępny jest faks, naukowcy mogą pobrać komórki krwi, sortując je do hodowli in vitro, sekwencjonowania RNA i ilościowego RT-PCR.