Name: Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj cytometrię przepływową do ilościowego określania komórek krwiotwórczych u zarodków Danio rerio. Ta metoda umożliwia szybką analizę wpływu modyfikacji genetycznych na hematopoezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 do D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 do D.L.S.), oraz z Honor's Program na California State University Chico (do K.F.R.). Autorzy dziękują Betsey Tamietti za zarządzanie laboratorium i Kathy Johns za pomoc administracyjną.

Rada doradcza Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Kalifornii, Chico, zatwierdziła wszystkie opisane poniżej metody.
UWAGA: Zaleca się leczenie zarodków 1-fenylo 2-tiomoczkiem (PTU; Tabela 1) po 24 godzinach od zapłodnienia (HPF), aby zapobiec pigmentacji, która negatywnie wpływa na dyskryminację fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej. Wszystkie wymienione poniżej procedury są dopuszczalne w przypadku cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Jeśli jednak celem jest hodowla komórek krwiotwórczych po FACS, należy przestrzegać sterylnych praktyk podczas przetwarzania próbek. Protokół wybielania i przygotowania próbek zarodków w sterylny sposób został opisany wcześniej12.
1. Dechorionacja 48 zarodków zebry zebry hpf
<ol>
	<li>Z zarodkami (co najmniej 5, ale nie więcej niż 200 zarodkami) na plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 cm, przechylić szalkę tak, aby zarodki opadły do dolnej krawędzi. 
	UWAGA: Naczynie można łatwo przechylić, zdejmując jego pokrywkę i umieszczając pokrywkę pod jedną krawędzią szalki Petriego.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić jak najwięcej pożywki E3 (Tabela 1) i dodać 500 μl proteazy dekorionacyjnej (10 mg/ml). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Po 5 minutach podnieś szalkę Petriego (trzymając wszystkie zarodki na dolnej krawędzi płytki) i delikatnie postukaj w bok szalki Petriego, pozwalając zarodkom delikatnie ocierać się o spód płytki, aby całkowicie usunąć kosmówkę.</li>
	<li>Za pomocą wyciskanej butelki dodaj ~20 ml pożywki E3, aby rozcieńczyć proteazę. Pozwolić zarodkom na osiadanie i usunąć pożywkę E3 przez dekantację.</li>
	<li>Powtórz krok 1.4 3x, aby usunąć wszystkie ślady proteazy dechorionacyjnej. 
	UWAGA: Do każdej pojedynczej próbki do analizy wymaganych jest co najmniej 5 zarodków. Ta procedura dechorionacji może pomieścić do 200 zarodków na szalce Petriego. Na tym etapie próbki można grupować i w razie potrzeby rozdzielać później. Alternatywnie, manualną dechorionację można wykonać poprzez delikatne rozdarcie pasm płciowych kleszczami zegarmistrzowskimi. Jest to korzystne, gdy liczba zarodków jest niewielka. Zwykle danio pręgowany wykluwa się z kosmówki przez 72 hpf. Poważnie zniekształcone zarodki nie mogą jednak i po tym czasie będą wymagały dechorionacji (manualnej lub chemicznej).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek zarodków do dysocjacji
<ol>
	<li>Za pomocą pipety P1000 umieść 5-10 zarodków w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Usunąć pożywkę E3 za pomocą pipety i wyrzucić. 
	UWAGA: Pipetę należy ostrożnie odpipetować, ponieważ zarodki można łatwo wyrzucić podczas wykonywania poniższych czynności.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 10 mM ditiotreitolu (DTT) do podłoża E3, aby usunąć powłokę śluzową otaczającą embrionalny danio pręgowany11,12,13,14. Ułóż probówkę do mikrowirówki poziomo i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Dysocjacja zarodków
<ol>
	<li>Przemyj zarodki 3x 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco z Ca2+ i Mg2+, aby usunąć ślady DTT. Po ostatnim przepłukaniu dodać 500 μl DPBS z Ca2+ i Mg2+ oraz 5 μl proteazy dysocjacyjnej 5 mg/ml (26 U/ml). 
	UWAGA: Można stosować inne izotoniczne roztwory buforowe, ale muszą one zawierać Ca2+ i Mg2+, aby enzym dysocjacyjny działał prawidłowo.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze 37 °C na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 185 obr./min przez 60 minut. Rozcierać zarodki za pomocą pipety P1000 aż do całkowitego dysocjacji próbek. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przetrawić zarodków; Powinna być obecna pewna tkanka stała i nie powinna być całkowicie jednorodna. Możliwe jest nadmierne trawienie, które niszczy docelowe komórki krwi, które można zaobserwować na cytometrze przepływowym (rysunek uzupełniający 1). 
	UWAGA: Ta procedura działa najlepiej w przypadku zarodków 48−72 hpf. Późniejsze etapy mogą wymagać dłuższej inkubacji z proteazą dysocjacyjną. Czas dla różnych etapów musi być określony empirycznie. Istnieją szybsze alternatywne metody dysocjacji tkanki embrionalnej, ale empirycznie stwierdzono, że metoda ta, choć trwa 60 minut, jest na tyle delikatna i dokładna, że umożliwia skuteczną izolację żywych komórek krwiotwórczych.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zdysocjowanych zarodków do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odpipetować 5 zdysocjowanych zarodków do górnego zbiornika polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z nasadką sitową 35 μmM.</li>
	<li>Przepłukać komórki, dodając 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca2+ lub Mg2+ do nasadki sitka w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml zawierającej przefiltrowane komórki. 
	UWAGA: Można również stosować inne izotoniczne roztwory buforowe, ale powinno w nich brakować Ca2+ lub Mg2+, aby rozcieńczyć i uczynić enzym dysocjacyjny nieskutecznym.</li>
	<li>Probówki wirować w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut w celu osadzania komórek. Za pomocą pipety usunąć i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS (bez Ca2+ lub Mg2+).</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek i dodaj 1:1,000 czerwonej plamy martwych komórek (tabela materiałów). 
	UWAGA: Czerwone barwienie martwych komórek jest barwnikiem przepuszczalnym dla komórek, który umożliwia wykluczenie martwych komórek i zanieczyszczeń z komórek docelowych i jest doskonałym wyborem barwnika do dyskryminacji martwych komórek, ponieważ jest wzbudzany przez laser 633 nm, który różni się od lasera 488 nm używanego do wzbudzania popularnych fluoroforów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) i DsRed. W ten sposób nie dochodzi do nakładania się widmowego martwych komórek i transgenicznych komórek krwi. Jodek propidyny (PI) w stężeniu 1 mg/ml jest niedrogą alternatywą dla czerwonego barwienia martwych komórek, ale pamiętaj, aby zarezerwować niektóre próbki barwione tylko za pomocą PI, a także próbki tylko za pomocą fluoroforu, aby ustawić kompensację instrumentu. W przeciwnym razie sygnały PI i fluoroforów, takich jak GFP, będą się nakładać, co spowoduje wyniki fałszywie dodatnie. Jeśli cytometr przepływowy ma również laser o długości fali 405 nm, inne barwniki, takie jak barwienie niebieskich komórek taty, są również doskonałym wyborem. 
	UWAGA: Analizując komórki krwi, należy pamiętać, że po 30 minutach niektóre typy komórek zaczną fagocytozować czerwone zabarwienie martwych komórek. Utrzymuj komórki chronione przed światłem i na lodzie do czasu analizy i wykonaj cytometrię przepływową w ciągu 30 minut od dodania barwnika.</li>
	<li>Analiza metodą cytometrii przepływowej 
	UWAGA: Każdy cytometr przepływowy jest nieco inny, ale poniższe kroki pomogą w przygotowaniu próbek do analizy na większości maszyn. Użytkownicy, którzy nie mają doświadczenia w cytometrii przepływowej, powinni zasięgnąć porady kogoś, kto jest ekspertem w tej konkretnej dziedzinie sprzętu. Poniższe instrukcje dotyczą cytometru przepływowego BD FACSAria Fusion.
	<ol>
		<li>Włącz cytometr i pozwól laserom rozgrzać się przez 20 minut. Opróżnij zbiornik na odpady, napełnij zbiornik osłonowy odpowiednim roztworem (różni się w zależności od cytometru przepływowego) i uruchom system fluidics. 
		UWAGA: Zwykle istnieje określona procedura uruchamiania dla każdego typu cytometru przepływowego; Postępuj zgodnie z tą procedurą uruchamiania.</li>
		<li>W oprogramowaniu do analizy narysuj pięć wykresów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
		<ol>
			<li>Niech pierwszy wykres punktowy zmierzy rozproszenie do przodu (FSC) na osi x i rozproszenie boczne (SSC) na osi y. Ustaw FSC jako liniowe, a SSC jako log. 
			UWAGA: FSC jest miarą wielkości komórki, a SSC jest miarą ziarnistości; Umożliwi to odróżnienie komórek od szczątków. Embrionalne populacje krwinek danio pręgowanego nie rozdzielają się według wielkości i ziarnistości w taki sam sposób, jak dorosłe komórki krwi danio pręgowanego opisane wcześniej15. Zamiast tego pojawią się w tej samej populacji ze wszystkimi innymi strawionymi komórkami embrionalnymi.</li>
			<li>Ustaw drugi wykres, aby sprawdzić wysokość FSC (H) w stosunku do szerokości FSC (W). Ustaw trzeci wykres tak, aby mierzył SSC (H) i SSC (W). 
			UWAGA: Ten krok służy do wykluczania dubletów (komórek, które sklejają się ze sobą, gdy przechodzą przez laser).</li>
			<li>Ustaw czwarty wykres punktowy, aby zmierzyć czerwone barwienie martwych komórek na osi x (w zależności od cytometru jest to zwykle równoważne filtrowi używanemu do allofikocyjaniny [APC]) i SSC na osi y. Umożliwi to odróżnienie żywych komórek od martwych. 
			UWAGA: Zestawy filtrów każdego cytometru mogą być różne. Upewnij się, że używasz właściwego filtra wykrywającego dla barwnika do dyskryminacji martwych komórek.</li>
			<li>Piąty wykres mierzy wybrany fluorofor. Zwizualizuj to jako histogram fluoroforu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) lub użyj wykresu kropkowego (Rysunek uzupełniający 2). 
			UWAGA: W przypadku badania więcej niż jednego fluoroforu u tego samego zwierzęcia zaleca się użycie wykresu punktowego, aby wyświetlić oba parametry w tym samym czasie. Jeśli istnieje jakakolwiek szansa, że fluorofory nakładają się na siebie widmowo (rysunek uzupełniający 2), zalecany jest również wykres punktowy. Użyj ustawień Obszar (A), aby obliczyć obszar pod krzywą generowaną przez impuls laserowy cytometru dla wszystkich parametrów, ponieważ są one dokładniejsze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załadować próbkę i zmniejszyć natężenie przepływu, aby próbka nie wyczerpała się szybko. Dostosuj ustawienia FSC i SSC tak, aby większość populacji komórek była wyraźnie widoczna (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Narysuj bramkę wokół populacji komórek i oznacz ją komórkami. Upewnij się, że drugi wykres kropkowy jest bramkowany na komórkach, wyklucz dublety, najpierw bramkując na FSC, a następnie na singletach SSC.</li>
		<li>Na czwartym wykresie dostosuj ustawienia czerwonego barwienia martwych komórek, tak aby populacja była wyraźnie ujemna. Narysuj bramkę wokół tych komórek i oznacz je jako żywe komórki. Na piątym wykresie przelej żywe komórki i zbadaj komórki fluoroforowe ujemne i dodatnie. Narysuj bramkę wokół komórek dodatnich. 
		UWAGA: Ta hierarchiczna strategia bramkowania bada pojedyncze komórki fluoroforowe +, które znajdują się w bramie żywych komórek, które również znajdują się w bramie komórkowej. Zadbaj o prawidłowe ustawienie bram. Bramy te można dostosować w zależności od eksperymentu.</li>
		<li>Uruchom każdą próbkę, zbierając co najmniej 25 000 zdarzeń komórek na żywo.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurą zamykania, aby wyłączyć płyny Fluidics. Napełnij zbiornik osłonowy i opróżnij zbiornik na odpady. 
		UWAGA: Często trudno jest uwidocznić komórki fluoroforu+, gdy ekspresja białka jest niska lub populacja komórek jest rzadka. Aby zapewnić prawidłowe ustawienie parametrów, zarodki rodzeństwa fluoroforowego powinny być przygotowane równolegle, aby prawidłowo narysować bramki i dostosować napięcia lasera (rysunek uzupełniający 2). Jeśli docelowa populacja komórek jest rzadka, zbierz ponad 25 000 zdarzeń. Mając od 5 do 10 strawionych zwierząt, powinno być w stanie zebrać miliony zdarzeń. Na podstawie tych danych można również uzyskać całkowitą liczbę komórek fluoroforu+. Wystarczy policzyć całkowitą liczbę komórek w próbce za pomocą hemocytometru i pomnożyć procent komórek fluoroforu+, aby uzyskać bezwzględną liczbę komórek fluoroforu+ na rybę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. , 303-309 (1996).</li>
<li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li>
<li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).</li>
<li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li>
<li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li>
<li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods in Cell Biology. 133, 11-53 (2016).</li>
<li>Berrun, A. C., Stachura, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+In+Vitro+Assay+to+Quantitate+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+%28HSPCs%29+in+Developing+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56836(2017).</li>
<li>Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22Essential+Zebrafish+Methods%3A+Cell+and+Developmental+Biology%22">Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrummond%2C+IA+%22The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A%22">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Ganis, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+globin+switching+occurs+in+two+developmental+stages+and+is+controlled+by+the+LCR%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR.</a> Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, e1-e11 (2013).</li>
<li>Ding, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+High-Throughput+Flow+Cytometry+in+Early+Drug+Discovery%3A+An+AstraZeneca+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective.</a> SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).</li>
<li>Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+flow+cytometry+for+drug+discovery%3A+principles%2C+applications%2C+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies.</a> Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).</li>
<li>Joslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fully+Automated+High-Throughput+Flow+Cytometry+Screening+System+Enabling+Phenotypic+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery.</a> SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).</li>
</ol>

D.L.S. jest konsultantem naukowym i otrzymał wynagrodzenie od Finless Foods, Inc. i Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. deklaruje, że nie ma sprzecznych interesów.

Danio pręgowany jest doskonałym systemem modelowym do badania hematopoezy prymitywnych i ostatecznych kręgowców. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano i udoskonalono wiele testów, dzięki czemu danio pręgowany stał się szybkim i ekonomicznym modelem do testowania leków, generowania i testowania mutantów genetycznych oraz ogólnie umożliwiając naukowcom analizę szlaków molekularnych niezbędnych dla hematopoezy. Protokół ten wykorzystuje embrionalnego danio pręgowanego, co pozwala na szybkie gromadzenie danych, wykorzysta...

Produkcja krwi (hematopoeza) jest niezbędnym procesem rozwojowym, który zaczyna się we wczesnym stadium zarodka. Proces ten rozpoczyna się od wytworzenia prymitywnych czerwonych krwinek i makrofagów bezpośrednio z mezodermy, a następnie przechodzi w produkcję hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Te komórki macierzyste, które są multipotencjalne, wytwarzają wszystkie odmiany dojrzałych komórek krwi w organizmie. System jest zdolny do samoodnawiania i jest stale uzupełniany za pośrednictwem tych modułów HSPC. Chociaż proces ten rozpoczyna się na wczesnym etapie rozwoju, hematopoeza trwa przez całe życie zwierzęcia, zapewniając zdolność do transportu tlenu do odległych miejsc ciała, zatrzymywania krwawienia po urazie i ochrony organizmu przed infekcją. Rozwój tego złożonego systemu jest kontrolowany czasowo i przestrzennie podczas rozwoju, a wszelkie zaburzenia w produkcji komórek krwi mogą być katastrofalne dla organizmu, powodując niedokrwistość, małopłytkowość, leukopenię i białaczkę.
Popularnym modelem zwierzęcym używanym do badań hematopoetycznych jest danio pręgowany (Danio rerio), ponieważ mają one podobny rozwój krwi w porównaniu do ludzi. W rzeczywistości wiele genów i szlaków molekularnych wykorzystywanych podczas hematopoezy jest zachowanych podczas ewolucji kręgowców, co pozwala nam dowiedzieć się więcej o ludzkich genach poprzez badanie danio pręgowanego. Co ważne, zarodki danio pręgowanego rozwijają się poza organizmem i w ciągu 7 dni wytworzyły większość dojrzałych typów krwinek, co pozwala na bezpośrednią wizualizację układu krwiotwórczego w krótkim czasie. Danio pręgowany jest również niezwykle płodny, co pozwala naukowcom obserwować większą liczbę próbek w krótkim czasie, co jest również ważne dla generowania powtarzalnych danych. Krótki czas generacji danio pręgowanego i jego rozwój zewnętrzny zapewniają łatwiejszą manipulację i obserwację podczas badań mutagenezy1,2,3,4,5 i badanie przesiewowe leków6,7,8,9,10. Pozwala to na szybkie i skuteczne przetestowanie panelu obiecujących związków terapeutycznych stosowanych w chorobach krwi u ludzi.
Co ważne, danio pręgowany jest również genetycznie podatny, a genom jest sekwencjonowany i opisywany. Ta wykonalność pozwala na wykonanie technik genetyki odwrotnej, takich jak knockdown za pośrednictwem morfoliny (MO-) i ablacja genetyczna za pośrednictwem CRISPR. Danio pręgowany udowodnił również swoją przydatność jako model do przeprowadzania badań genetycznych; W ten sposób odkryto wiele istotnych genów i szlaków zaangażowanych w tworzenie krwi kręgowców. Liczne metody obserwacji komórek krwi zostały również opracowane u danio pręgowanego. Chociaż istnieją tradycyjne techniki barwienia histologicznego, możliwe jest również przeprowadzenie hybrydyzacji in situ dla transkryptów specyficznych dla krwi. Co ważne, istnieją również liczne transgeniczne linie ryb, w których białka fluorescencyjne są wyrażane przez promotory specyficzne dla linii, co pozwala na znakowanie określonych komórek krwi białkami fluorescencyjnymi11. Dzięki temu naukowcy mogą prowadzić obserwację z dokładnością co do minuty genezy, ekspansji i regulacji komórek krwi w żywym organizmie w czasie.
Ogólnie rzecz biorąc, zachowanie układu krwiotwórczego, obecność i łatwy rozwój linii transgenicznych, łatwa wizualizacja i krótki czas generacji sprawiły, że danio pręgowany stał się ekonomicznym, szybkim i elastycznym modelem hematopoezy. Aby udoskonalić zestaw technik dostępnych dla badaczy danio pręgowanego, opracowaliśmy ten test, aby solidnie określić ilościowo liczbę komórek krwi w zarodkach. Metoda polega na trawieniu zwierząt transgenicznych i wykonywaniu cytometrii przepływowej dla fluorescencyjnych komórek krwi. W ten sposób komórki krwi zmutowanych zwierząt, efekt modyfikacji MO i CRISPR oraz wpływ małych cząsteczek mogą być analizowane ilościowo w szybki i powtarzalny sposób. Testy te są przyjaznymi dla użytkownika i ekonomicznymi sposobami liczenia komórek krwi, umożliwiającymi badanie ich powstawania, proliferacji i utrzymania w czasie.

<table><tbody><tr><td>Probówka MCF 1,5 ml</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Polistyrenowa łatwa w obsłudze szalka Petriego</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem z nasadką sitka</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>DPBS (10x) z Ca2+ i Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Librease</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>proteaza</td></tr> <tr><td>dysocjacjiPronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>proteaza dechorionacyjna</td></tr><tr><td>SYTOX Red Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S34859</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

Różnorodność linii komórkowych, które składają się na dojrzałą krew u kręgowców, wynika z różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). Jest to krytyczny proces, który zachodzi przez całe życie organizmów, a zakłócenie szlaków molekularnych zaangażowanych podczas embriogenezy może mieć katastrofalne długoterminowe konsekwencje. Z wielu powodów danio pręgowany (Danio rerio) stał się organizmem modelowym do badania hematopoezy. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i po 7 dniach od zapłodnienia (dpf) wytwarzają większość podtypów ostatecznych komórek krwi, które przetrwają przez całe życie. Opracowano testy do oceny liczby komórek krwiotwórczych, głównie przy użyciu specyficznych barwień histologicznych, technik hybrydyzacji in situ i mikroskopii zwierząt transgenicznych, które wykorzystują promotory specyficzne dla komórek krwi napędzające ekspresję białek fluorescencyjnych. Jednak większość testów barwienia i technik hybrydyzacji in situ nie określa dokładnie liczby obecnych komórek krwi; Tylko duże różnice w numerach komórek są łatwe do wizualizacji. Można przeprowadzić wykorzystanie zwierząt transgenicznych i analizę osobników za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej, ale kwantyfikacja tych testów opiera się na ręcznym liczeniu lub użyciu drogiego oprogramowania do obrazowania, z których oba mogą powodować błędy. Opracowanie dodatkowych metod oceny liczby krwinek byłoby ekonomiczne, szybsze, a nawet mogłoby zostać zautomatyzowane w celu szybkiej oceny wpływu modyfikacji genetycznej za pośrednictwem CRISPR, redukcji transkryptu za pośrednictwem morfoliny oraz wpływu związków leków, które wpływają na hematopoezę na dużą skalę. Ten nowatorski test do ilościowego oznaczania komórek krwi polega na dysocjacji całych zarodków danio pręgowanego i analizie ilości obecnych fluorescencyjnie znakowanych komórek krwi. Testy te powinny pozwolić na wyjaśnienie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za wytwarzanie, ekspansję i regulację komórek krwi podczas embriogenezy, co pozwoli naukowcom na dalsze odkrywanie nowych czynników zmienianych podczas chorób krwi, a także szlaków niezbędnych podczas ewolucji hematopoezy kręgowców.

Aby zliczyć erytrocyty w embrionach danio przebrzmiałego, zarodki lcr:GFP16 wstrzykiwano w stadium jednego komórki buforem PBS, 7,0 ng/nL MO przeciwko ism1 lub 7,0 ng/nL MO przeciwko ism1 wraz z 7,0 ng mRNA ism112. Po 48 hpf poddano je trawieniu i analizie metodą cytometrii przepływowej. Po analizie odsetka erytrocytów GFP+ z każdej próbki (każda próbka obejmowała 5 losowo wybranych embrionów; <...

Ten test jest prostą metodą do ilościowego oznaczania komórek krwiotwórczych w rozwoju embrionalnej danio pręgowanego. Komórki krwi od zdysocjowanego danio pręgowanego poddawane są analizie cytometrii przepływowej. Pozwala to na wykrycie wad krwi u zwierząt zmutowanych oraz po modyfikacji genetycznej.

Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na obniżenie i nadmierną ekspresję genów u rozwijającej się ryby, a także na ilościowe określenie tych dalszych skutków dla komórek krwi. Protokół ten jest szybki, łatwy do wykonania, ekonomiczny i łatwy do zautomatyzowania dzięki dostępowi do odpowiedniego oprzyrządowania. Procedurę tę zademonstruje Kristen Rueb, badaczka pracująca w laboratorium.Zacznij od przeniesienia od pięciu do 200, 48 godzin po zapłodnieniu zarodków na plastikową 10-centymetrową szalkę Petriego. Przechyl naczynie tak, aby zarodek opadł do dolnej krawędzi i usuń jak najwięcej podłoża E3 z naczynia. Następnie dodaj 500 mikrolitrów proteazy dechorionacyjnej do zarodków.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej ponownie przechyl wszystkie zarodki na dolną krawędź płytki i delikatnie postukaj w bok naczynia, pozwalając zarodkom delikatnie pocierać o spód płytki, aby całkowicie usunąć ich kosmówkę. Za pomocą butelki do wyciskania dodaj około 20 mililitrów pożywki E3, aby rozcieńczyć proteazę i pozwól zarodkom się uspokoić. Następnie zdekantować pożywkę i przepłukać zarodki jeszcze trzy razy świeżą pożywką, jak właśnie wykazano, aby usunąć wszelkie ślady proteazy.Aby przygotować zarodki do dysocjacji, użyj pipety P1000, aby przenieść od pięciu do 10 zarodków do jednej, 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i odessać przeniesione podłoże E3. Następnie dodaj jeden mililitr 10-milimolowej pożywki DTT w pożywce E3 do embrionalnego danio pręgowanego i umieść probówkę mikrowirówki w pozycji poziomej na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć powłokę śluzu. W celu dysocjacji zarodków należy trzykrotnie przemyć zarodki poddane działaniu DTT jednym mililitrem DPBS uzupełnionym wapniem i magnezem na jedno płukanie.Przed dodaniem 500 mikrolitrów DPBS uzupełnionych wapniem i magnezem oraz pięciu mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr, proteaza dysocjacyjna. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 185 obrotów na minutę przez 60 minut. Pamiętaj, aby okresowo sprawdzać zarodki, aby ich nie przetrawić.Gdy można zaobserwować nie do końca jednorodną próbkę, w której obecna jest pewna ilość tkanki stałej, należy rozcierać zarodki za pomocą pipety P1000, aż próbka zostanie całkowicie zdysocjowana. Aby przygotować zdysocjowane komórki embrionalne danio pręgowanego do cytometrii przepływowej, należy przenieść całą próbkę komórek do górnego zbiornika pięciomililitrowej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu z nasadką sitową o długości 35 mikrometrów. Przepłucz nakrętkę czterema mililitrami PBS bez wapnia lub magnezu i opłucz komórki przez odwirowanie.Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS bez wapnia i magnezu na probówkę. W celu analizy cytometrycznej przepływowej komórek embrionalnych danio pręgowanego, delikatnie zawiruj zawiesiny komórkowe przed dodaniem do każdej probówki rozcieńczenia od jednego do tysiąca czerwonego barwnika martwych komórek. W ciągu 30 minut od nałożenia barwienia martwych komórek opróżnij zbiornik na nieczystości, napełnij zbiornik osłonowy odpowiednim roztworem i uruchom układ fluidyczny cytometru przepływowego.W oprogramowaniu do analizy narysuj pięć wykresów i ustaw pierwszy wykres tak, aby mierzył rozrzut do przodu i z boku. Ustaw punktowy punkt do przodu na liniowy, a punktowy boczny na logarytmiczny. Ustaw drugi wykres, aby zmierzyć wysokość punktu punktowego do przodu w stosunku do szerokości punktu punktowego do przodu, a trzeci wykres tak, aby mierzyć wysokość punktu punktowego w stosunku do szerokości punktowego z boku.Ustaw czwarty wykres, aby zmierzyć czerwone zabarwienie martwych komórek na osi x i rozrzut boczny na osi y, aby umożliwić rozróżnienie żywych komórek od martwych. Piątą powierzchnię należy ustawić w celu zmierzenia wybranego fluoroforu. Po ustawieniu wszystkich wykresów załaduj próbkę do cytometru i zmniejsz natężenie przepływu, aby komórki nie wyczerpały się zbyt szybko.Dostosuj ustawienia rozproszenia do przodu i z boku, aby można było wyraźnie zaobserwować większość populacji komórek, i narysuj bramkę wokół populacji komórek. Oznacz tę bramkę jako komórki. Z drugim wykresem kropkowym bramkowanym na komórkach, bramka na rozproszeniu do przodu i boczne rozproszenie podkoszulka, aby wykluczyć dublety.Na czwartym wykresie dostosuj ustawienia barwienia martwych komórek na czerwono, tak aby populacja była wyraźnie ujemna. Narysuj bramkę wokół tych komórek i oznacz tę bramkę jako żywe komórki. Na piątym wykresie przelej żywe komórki i narysuj bramkę wokół komórek dodatnich, a następnie uruchom każdą próbkę, zbierając co najmniej 25 000 zdarzeń żywych komórek.Po przeanalizowaniu wszystkich próbek postępuj zgodnie z procedurą wyłączania, aby wyłączyć fluidykę, napełnić zbiornik osłonowy i opróżnić zbiornik na odpady. Po przeanalizowaniu procentu czerwonych krwinek dodatnich przez GFP z każdej próbki embrionalnego danio pręgowanego można obliczyć średnią z całej grupy kontrolnej. Zazwyczaj średnia jest ustawiana jako jeden, a wszystkie wartości procentowe są obliczane na podstawie tego punktu odniesienia.W tej reprezentatywnej analizie stwierdzono, że zmniejszenie transkryptu ISM1 za pomocą specyficznego morfolino, zmniejszenie liczby czerwonych krwinek GFP obecnych w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu zarodków. Ratując to obniżenie poziomu morfolina ISM1 za pomocą egzogennego mRNA, przywróć liczbę czerwonych krwinek do normy. Prawidłowe trawienie próbek ma kluczowe znaczenie.Jeśli trawisz za dużo lub za mało, nie uzyskasz prawidłowych wyników. Jeśli dostępny jest faks, naukowcy mogą pobrać komórki krwi, sortując je do hodowli in vitro, sekwencjonowania RNA i ilościowego RT-PCR.

using-flow-cytometry-to-detect-quantitate-altered-blood-formation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Niniejszy artykuł przedstawia technikę pobierania krwi z aorty grzbietowej Danio pręgowanego. Zawiera on również instrukcje pozyskiwania surowicy do zastosowania w analizach biochemicznych, takich jak testy określające poziom cholesterolu i tryglicerydów.

Pobieranie krwi do analizy biochemicznej u dorosłych danio-ostroskrzelnych

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy prostą metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) u embrionalnych danio pręgowanego. HSPC od zdysocjowanego danio pręgowanego są posiane w metylocelulozie z czynnikami podporowymi, różnicującymi się w dojrzałą krew. Pozwala to na wykrycie wad krwi i łatwe przeprowadzanie badań przesiewowych leków.

Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Poznaj cytometrię przepływową do ilościowego określania komórek krwiotwórczych u zarodków Danio rerio. Ta metoda umożliwia szybką analizę wpływu modyfikacji genetycznych na hematopoezę.

Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie cytometrii przepływowej do wykrywania i ilościowego określania zmienionego tworzenia się krwi u rozwijającego się danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów